TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ KHOA DƢỢC LBM HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ DƢỢC IỆU Y DƢỢNG QUY TR NH CHI T UẤT V Đ NH ƢỢNG RUTIN TRONG DƢỢC IỆU NỤ H E (Flos Styphnolobii imaturi ) BẰNG PHƢƠNG PHÁP UP C UV GVHD PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Vân Thực hiện CKI Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, K 20–22 Cần Thơ, năm 2022 TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ KHOA DƢỢC LBM HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ DƢỢC IỆU Y DƢỢNG QUY TR NH CHI T UẤT V Đ NH ƢỢNG RUTIN TRONG DƢỢ.
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ KHOA DƢỢC LBM HĨA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ DƢỢC IỆU Y DƢỢNG QUY TR NH CHI T UẤT V Đ NH ƢỢNG RUTIN TRONG DƢỢC IỆU NỤ H E (Flos Styphnolobii imaturi.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP UP C UV GVHD: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân Thực hiện: CKI Kiểm nghiệm thuốc Độc chất, K 20–22 Cần Thơ, năm 2022 TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ KHOA DƢỢC LBM HĨA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ DƢỢC IỆU Y DƢỢNG QUY TR NH CHI T UẤT V Đ NH ƢỢNG RUTIN TRONG DƢỢC IỆU NỤ H E F os Styphno o ii im turi BẰNG PHƢƠNG PHÁP UP C UV t u L Lê Văn Bẩy v t 2020 -2022 20121010507 100% Cần Thơ, năm 2022 i LỜI CẢM ƠN Quyển báo cáo hoàn thành dựa tham khảo tài liệu nghiên cứu có liên quan, sách, báo chuyên ngành nhiều tác giả, đặc biệt tư vấn quý thầy cô tr nh thực nghiêm hợp tác tất thành viên nhóm Trước tiên, nhóm báo cáo chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Vân tạo điều kiện, tận t nh hướng dẫn, Cô truyền đạt tận tình kiến thức quý báu kinh nghiệm bổ ích để nhóm có hội rèn luyện, nhằm nâng cao kỹ có nh n tổng quan công việc người Dược sĩ làm công tác nghiên cứu khoa học sau Xin cảm ơn tất thành viên nhóm giúp đỡ, động viên, hỗ trợ lẫn nhau, giải khó khăn tr nh thực Trong trình thực chắn khơng tránh khỏi thiếu sót, nhóm báo cáo kính mong nhận góp ý, nhận xét từ quý Thầy Cơ để nhóm rút kinh nghiệm q báo bổ ích cho báo cáo Cuối cùng, nhóm báo cáo chúng em xin kính chúc quý Thầy Cô dồi nhiều sức khỏe, thành công công việc sống Trân trọng cảm ơn! ii LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VI T TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Hoa Hoè [1] 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hoá học [1] 1.1.4 Tác dụng dược lý dược liệu Hoa h e 1.2 Tổng quan Rutin 1.2.1 Tính chất vật lý [1],[8] 1.2.2 Tác dụng dược lý 1.2.2.1 Tăng cường sức đề kháng, giảm t n t m t ấu mao mạch [1],[2],[3],[4] 1.2.2.2 Tác dụung hệ t ân kin trung ương [5],[6 1.2.2.3 Tác dụng hệ nội ti t [5],[6] 1.2.2.4 Tác dụng hệ tim mạch [7] 1.2.2.4 Tác dụng chống viêm [10],[11],12] 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc CHƢƠNG Đ I TƢỢNG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 10 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 10 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 10 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 10 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 10 2.1.5 Hóa chất, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 10 2.1.5.1 Hóa chât, c ất c u n, dung môi 10 iii 2.1.5.2 Thi t bị, dụng cụ 10 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 11 2.2.2 Phương pháp chọn mẫu 11 2.2.3 Nội dung nghiên cứu 11 2.2.3.1 Chu n bị mẫu chu n v mẫu t 2.2.3.2 11 ảo s t c c điều kiện sắc ký để c địn rutin ng p ương p p UPLC/UV 11 2.2.3.3 Xây dựmg quy trình chi t xuất Rutin dược liệu nụ hoa hịe, tối ưu óa quy trìn c i t xuất 12 2.2.3.4 Đ n gi iệu suất thu hồi cua quy trình chi t xuất b ng p ương pháp UHPLC/UV 14 2.2.3.5 Độ n định dịch chi t dược liệu 14 2.2.3.6 Xây dựng thâm dịn quy trìn địn lượng rutin có dược liệu hoa hòe b ng p ương p p UHPLC/UV 15 2.2.4 Phương pháp thu thập đánh giá số liệu 19 2.2.5 Phương pháp kiểm soát sai số 19 2.2.6 Phương pháp xử lý phân tích số liệu 20 2.3 Đạo đức nghiên cứu 20 CHƢƠNG K T QUẢ 21 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ƣớc s ng để định ƣợng rutin phƣơng pháp UHP C UV 21 2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 21 2.3.2 Khảo sát bước sóng phân tích 22 3.2 Tối ƣu h quy trình chiết xuất rutin dƣợc liệu hoa hịe 24 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 24 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết 26 3.2.3 Khảo sát số lần chiết 27 3.3 Kết thẩm định quy trình định ƣợng Rutin phƣơng pháp UHPLC/UV 29 iv 3.3.1 Tính tương thích hệ thống 29 2.3.1.1 T n tương t c ệ thống đối v i mẫu c u n 29 2.3.1.2 T n tương t c ệ thống đối v i mẫu t 30 3.3.2 Tính đặc hiệu 31 3.3.3 Tính tuyến tính 31 3.3.4 Độ xác ngày 33 3.3.5 Độ 33 3.4 Giới h n phát OD giới h n định ƣợng OQ 36 3.4.1 Giới hạn phát LOD 36 3.4.2 Giới hạn định lượng LOQ 36 3.4.3 Giới hạn định lượng LOQ 36 3.5 Kết khảo sát độ ổn định dung dịch m u th 37 Chƣơng B N UẬN 38 4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 38 4.2 Quy trình chiết kiệt Rutin 39 4.2.1 Nhiệt độ chiết 39 4.2.2 Nhiệt độ chiết 39 4.2.3 Số lần chiết 39 4.2 Thẩm định phƣơng pháp 40 K T UẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ ỤC 47 v DANH MỤC CÁC TỪ VI T TẮT Chữ viết tắt ACN AOAC Tiếng Anh Acetonitril Association of Official Analytical Community DĐVN DL GLP LOD LOQ MeOH RSD SD UHPLC UV - Vis Tiếng Việt Acetonitril Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế Dược điển Việt Nam Dược liệu Good Laboratory Practice Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Relative Standard Deviation Standard Deviation Ultra High Performance Liquid Chromatography Ultraviolet - Visible Thực hành tốt ph ng thí nghiệm Giới hạn phát Giới hạn định lượng Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Sắc ký lỏng siêu hiệu Tử ngoại - Khả kiến vi DANH MỤC CÁC H NH Hình 1.1 Hoa hịe hịe H nh 1.2 Cơng thức cầu tạo Rutin Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động khác Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn bước sóng 36 nm 255nm Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : formic pH , t lệ 48 : 52 H nh 3.4 Sơ đồ chiết xuất rutin dược liệu hoa h e đề xuất H nh 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết Rutin dung môi khác H nh 3.6 Sắc ký đồ dịch chiết Rutin pha loãng lần H nh 3.7 Sắc ký đồ dịch chiết Rutin nhiệt độ khác Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết gộp sau lần chiết lần chiết thứ H nh 3.9 Sơ đồ quy trình chiết Rutin tối ưu định lượng UHPC/UV H nh 3.1 Kết khảo sát lần t lệ 1g ml chiết lần chiết t lệ 1/1000 (0.01g ml x lần Hình 3.11 Sắc ký đồ kết sắc ký dung dịch chuẩn Rutin Hình 3.12 Sắc ký đồ kết sắc ký mẫu thử hoa h e Hình 3.13 Sắc ký đồ tính đặc hiệu rutin H nh 3.14 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rutin: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm 100 ppm H nh 3.15 Đồ thị tương quan nồng độ diện tích pic rutin H nh 3.16 Sắc ký đồ kết sắc ký dung dịch Mẫu thử H nh 3.17 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ppm H nh 3.18 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ppm H nh 3.19 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ppm 12 H nh 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử đanh giá độ H nh 3.21 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nồng độ 5ppm, 25ppm, 125ppm 0.0625ppm H nh 3.22 Sắc ký đồ kết độ ổn định mẫu thử theo thời gianHình 4.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : formic pH , t lệ 48 : 52 Hình 4.2 Đồ thị tương quan nồng độ diện tich pic rutin nồng độ nhỏ 1ppm vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 T nh h nh nghiên cứu nước Bảng 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát Bảng 2.2 Các yêu tố khảo sát để tơi ưu hóa quy tr nh chiết Bảng 2.3 T lệ dung môi số lần chiết Rutin Bảng 2.4 Thăm d dung mơi chiết thích hợp Bảng 2.5 Độ lặp lại tối đa chấp nhận hàm lượng khác theo phụ lục F AOAC – trang Bảng 2.6 Độ thu hồi chấp nhận hàm lượng khác theo O C Bảng 3.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi chiết Bảng 3.3 T lệ dung môi số lần chiết Rutin Bảng 3.4 Kết sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rutin: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm 100 ppm Bảng 3.5 Kết khảo sát độ xác Bảng 3.6 Kết thẩm định độ Bảng 3.7 Kết khảo sát độ ổn định dịch chiết Bảng 4.1 Kết hàm lượng rutin mẫu thử ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa hòe vị thuốc quý thông dụng nước ta Theo dược học cổ truyền, hoa hòe vị đắng, tính lạnh, có cơng dụng nhiệt lương huyết ch huyết, thường dùng chữa bệnh tràng phong tiện huyết, trĩ huyết, tiểu huyết… Nghiên cứu dược học đại cho thấy: Hoa h e có tác dụng nâng caosức bền thành mạch, cầm mau, kháng khuẩn, chống viêm, chống co thắt trơn đường ruột phế quản, hưng phẩn nhẹ tăng cường sức bóp tim, hạ huyết áp, hạ mỡ máu làm chậm tr nh xơ vữa động mạch… Hoa h e sử dụng kết hợp với số loại thuốc khác để chữa bệnh cao huyết áp, tiểu máu… Nhằm đảm bảo đảm chất lượng, tính an tồn hiệu việc sử dụng Hoa h e, cơng tác tiêu chuẩn hóa chất lượng quan tâm khảo sát mức Vì vậy, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất kiểm nghiệm dược liệu Hoa h e với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát điều kiện sắc thích hợp định lượng rutin dược liệu Hoa hịe Tối ưu hóa quy tr nh chiết xuất rutin dược liệu Hoa hòe Đề xuất quy tr nh chiết xuất định lượng Rutin dược liệu Hoa hòe Thẩm định quy tr nh định lượng Rutin dược liệu Hoa hòe Đánh giá hiệu suất thu hồi quy trình chiết xuất rutin phương pháp UPLC / UV Đánh giá tính ổn định dịch chiết dược 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất học, 2004, tr 298-299 Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, 2017, trang 1195-1196 Nguyễn Tư Đạt, Nghiên cứu bào chế Phytosome Rutin, Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dưoc học - Đại học Quốc gia Hà Nội, 2017 Tiếng Anh British Phamarcopoeia 2013 Lee SuanChua, A review on plant-based rutin extraction methods ar its pharmacological activities, Journal of Ethnopharmacology, Volum 150, Issue 3, 12 December 2013, Pages 805-817 AdityaGaneshpurkar, Ajay K.Saluja, The Pharmacological Potential c Rutin, Saudi Pharmaceutical Journal, Volume 25, Issue 2, Februar 2017, Pg 149-164 Shrestha Sharma, Asgar Ali, Javed Ali, Jasjeet K Sahni & Sanjul Baboota, Rutin: therapeutic potential and recent advances in dru delivery, Journal Expert Opinion on Investigational Drugs, Volume 22 Issue 8, 2013, Pages 1063-1079 C.F.Krewson, J.Naghski, Some Physical Properties of Rutin, Journal o the American Pharmaceutical Association (Scientific ed.), Volume 41 Issue 11, November 1952, Pages 582-587 Nuray Yildizoğlu-Ari, V Melih Altan, Orhan Altinkurt, Yusuf Öztürk Pharmacological effects of rutin, Phytotherapy research, Volume5 Issuel, February 1991, Pages 19-23 10 Taha I Khalifa, Farid J Muhtadi, and Mahrnoud M.A Hassan, Rutin Analytical profiles of drug subtances, vol 12 89 / 85 11 Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin Francisco PerezVizcaino1, Juan Duarte2, Rosario Jimenez2,Celestino Santos-Buelga3, Antonio Osuna4 12 Chuyên đề rutin từ hoa h e Meteor Nguyễn – Academia.edu 13 Official Methods of Analysis of AOAC International, 20th Edition (2016 PDF) 47 PHỤ ỤC PHỤ ỤC 1: Khảo sát điều iện sắc Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động khác Hình Sắc ký đồ mẫu thử điều kiện sắc ký khác 48 Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn bước sóng 360nm 255nm Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : formic : 52 pH , t lệ 48 49 PHỤ ỤC 2: Khảo sát dung m i chiết Hình Sắc ký đồ dịch chiết Rutin dung mơi khác Hình Sắc ký đồ dịch chiết Rutin pha lỗng lần 50 Hình Sắc ký đồ dịch chiết Rutin nhiệt độ khác Hình Sắc ký đồ chiết xuất rutin MeOH sau lần chiết 51 Hình Sắc ký đồ dịch chiết gộp sau lần chiết lần chiết thứ 52 PHỤ ỤC 3: Tính tƣơng thích hệ thống Hình 10 Sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : formic pH , t lệ 48 : 52 53 Hình 11 Sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu thử hệ pha động MeOH : formic pH , t lệ 48 : 52 54 PHỤ ỤC 4: Tính đặc hiệu Hình 12 Sắc ký đồ tính đặc hiệu rutin PHỤ ỤC 5: Tính tuyến tính H nh 13 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rutin: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm 100 ppm 55 PHỤ ỤC 6: Độ đ ng Hình 14 Sắc ký đồ dung dịch Mẫu thử H nh 15 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ppm 56 H nh 16 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ppm H nh 17 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ppm 12 57 PHỤ ỤC 7: OD OQ H nh 18 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nồng độ 5ppm, 25ppm, 125ppm 0.0625ppm 58 PHỤ ỤC 7: Độ ổn định dung dịch m u th H nh 19 Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát độ ổn định mẫu thử H nh 20 Sắc ký đồ độ ổn định mẫu thử theo thời gian 59 PHỤ ỤC 8: Độ xác H nh 21 Sắc ký đồ mẫu chuẩn đánh giá độ xác H nh 22 Sắc ký đồ mẫu thử đánh giá độ xác ngày 60 ... ƣu h quy trình chiết xuất rutin dƣợc liệu hoa hịe Quy tr nh chiết xuất rutin dược liệu hoa hòe đề xuất: Hình 3.4 Sơ đồ chiết xuất rutin dược liệu hoa h e đề xuất 3.2.1 Khảo sát dung m i chiết. .. rutin dược liệu Hoa hòe Đề xuất quy tr nh chiết xuất định lượng Rutin dược liệu Hoa hòe Thẩm định quy tr nh định lượng Rutin dược liệu Hoa hòe Đánh giá hiệu suất thu hồi quy trình chiết xuất rutin... hành xây dựng quy trình chiết xuất kiểm nghiệm dược liệu Hoa h e với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát điều kiện sắc thích hợp định lượng rutin dược liệu Hoa hòe Tối ưu hóa quy tr nh chiết xuất rutin