Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất panax pseudoginseng (burk) f h chen

MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tam thất ( Panax Pseudoginseng) 1.1.1 Tên khoa học tam thất 1.1.2 Phân bố tam thất 1.1.3 Đặc điểm thực vật tam thất 1.1.4 Thành phần hoá học tam thất 1.1.5 Tác dụng dược lý tam thất 1.1.6 Tam thất y học cổ truyền 11 2.2 Các phương pháp chiết xuất tinh chế saponin từ tam thất 12 2.2.1 Nguyên tắc chung 12 2.2.2 Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất 13 2.2.3 Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nguyên vật liệu thí nghiệm 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Nguyên liệu, hoá chất 16 2.1.3 Máy móc, dụng cụ 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 18 2.2.2 Quy trình chiết xuất tinh chế saponin 20 2.2.3 Xác định cấu trúc độ tinh khiết saponin tinh chế 22 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ 23 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng R1, Rg1 Rb1 tam thất phương pháp HPLC 23 3.1.1 Độ đặc hiệu phương pháp 23 3.1.2 Tính thích hợp hệ thống 25 3.1.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ 26 3.1.4 Độ lặp lại 27 3.1.5 Độ 28 3.2 Định lượng saponin toàn phần mẫu củ tam thất 29 3.3 Chiết xuất saponin toàn phần từ củ tam thất 30 3.4 Tinh chế saponin mẫu củ tam thất 32 3.4.1 Tinh chế saponin toàn phần 32 3.4.2 Tinh chế saponin điển hình sắc ký lỏng đầu dò PDA 33 3.5 Xác định cấu trúc độ tinh khiết saponin tinh chế 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 37 4.1 Về phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 37 4.2 Về quy trình chiết xuất tinh chế saponin 37 4.3 Về quy trình xác định cấu trúc độ tinh khiết saponin tinh chế 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 Kết luận 41 Đề xuất 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt, ký hiệu Tên đầy đủ PPG Panax pseudoginseng (Burk.) F H Chen hay gọi panax notoginseng PNS Panax notoginseng saponin ESI Ion hoá tia điện HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao DAD Đầu dò mảng diod TB Trung bình SD Độ lệch chuẩn RSD Độ lệch tương đối AOAC Hiệp hội nhà phân tích hố học thống 10 PDA Màng quang Điot DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Nguyên liệu hoá chất 16 Bảng 2.2 Máy móc dụng cụ 17 Bảng 3.1 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 26 Bảng 3.2 Kết khảo sát độ tuyến tính 27 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 28 Bảng 3.4 Độ phương pháp 29 Bảng 3.5 Kết định lượng hàm lượng R1, Rg1 Rb1 củ 30 tam thất Bảng 3.6 Kết chiết xuất saponin ba phương pháp chiết 31 Bảng 3.7 Kết chiết xuất saponin từ củ tam thất thơng qua chiết nóng 32 Bảng 3.8 Kết tinh chế saponin toàn phần 32 Bảng 3.9 Kết hàm lượng R1, Rg1 Rb1 mẫu cao giàu 33 saponin Bảng 3.10 Khối lượng saponin S1 S2 thu 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh củ Panax pseudoginseng (Burkill) F H Chen Hình 1.2 Cấu trúc phân tử notoginsenosid R1 ginsenosid Rb1 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử ginsenosid Rg1 ginsenosid Rd Hình 1.4 Cấu trúc phân tử ginsenosid Re Hình 2.1 Mẫu củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk.) F.H Chen 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn R1 23 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rg1 23 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Rb1 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp gồm R1, Rg1 Rb1 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng 24 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu thử từ củ tam thất 25 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn với đầu dò PDA bước sóng 203 nm 34 Hình 3.8 Phổ khối saponin S1 35 Hình 3.9 Phổ khối saponin S2 35 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu saponin S1 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu saponin S2 36 MỞ ĐẦU Từ xưa, loại thảo dược tự nhiên sử dụng rộng rãi y học cổ truyền với tác dụng bồi bổ thể điều trị bệnh lý người bị bệnh Ngày nay, việc ứng dụng loại cỏ tự nhiên lĩnh vực chăm sức khoẻ người quan tâm đẩy mạnh phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường ngày tăng chế phẩm có nguồn gốc thảo dược Trong loại thảo dược có tác dụng bồi bổ thể, thuộc chi sâm nhân sâm (Panax ginseng) hay sâm Mỹ (Panax quinquefolium) biết đến sử dụng rộng rãi lợi ích ứng dụng loài sức khoẻ người, Panax pseudoginseng (Burk.) F H Chen, hay gọi tam thất, loài thuộc chi sâm có tác dụng hàng đầu kể đến Tam thất loài dược liệu quý, biết đến từ xa xưa với vai trò vị thuốc y học cổ truyền sử dụng phổ biến với tác dụng bồi bổ thân thể người bị suy nhược, điều trị chảy máu [1, 4, 43, 48] Đến thời điểm tại, có 200 hợp chất hoá học phân lập xác định từ phận khác Tam thất, thành phần chủ yếu saponin, với năm loại saponin kể đến notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Rd Re [43, 48] Các saponin chứng minh có tác dụng tốt sức khoẻ, lợi ích hệ tim mạch [43, 48, 51], khả chống xơ vữa động mạch[50], khả chống viêm [12, 45], chống oxi hoá [49], giảm nồng độ cholesterol máu điều hoà huyết áp [31, 36] giảm rủi ro mắc phải ung thư [9, 20, 24, 43] Trong tam thất, ba thành phần saponin đặc biệt lưu ý notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 ginsenosid Rb1 tác dụng điều trị loại bệnh xu hướng kỷ 21, bệnh tim mạch [48, 51], tiểu đường [31, 36] hay ung thư [9, 20, 24] Từ minh chứng trên, thấy tam thất dược liệu quý giàu saponin với nhiều tác dụng dụng có lợi sức khoẻ người Việc sản xuất ứng dụng tam thất lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ thị trường đầy tiềm Việt Nam Tuy nhiên, nước ta nghiên cứu chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin phân lập saponin riêng biệt hạn chế Việc phân lập saponin từ tam thất có nhiều ý nghĩa việc đánh giá tác dụng dược lý saponin này, từ nghiên cứu sâu saponin điển hình tam thất tiến hành Vì vậy, chúng tơi thực đề tài “Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen với hai mục tiêu sau: Xây dựng quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 Rb1 có củ tam thất Xây dựng bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ tam thất tinh hai loại saponin điển hình từ cao chuẩn hố giàu saponin CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tam thất (Panax Pseudoginseng) 1.1.1 Tên khoa học tam thất Tên khoa học: Panax pseudoginseng (Burkill) F H Chen, giới thực vật có vị trí phân loại sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật hạt kín (Magnoliophyta) Lớp: Thực vật hai mầm (Magnoliopsida) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Nhân sâm (Araliaceae) Chi: Sâm (Panax) Loài: Tam thất (pseudoginseng) Tên đồng nghĩa: Aralia quinquefolia var notoginseng Burkill; Panax pseudoginseng var notoginseng (Burkill) G.Hoo & C.L.Tseng Panax pseudoginseng Wall Tên thường gọi: sâm tam thất, kim bất hoán, nhân sâm tam thất, điền thất [1, 4] 1.1.2 Phân bố tam thất Tam thất có nguồn gốc phía nam Trung Quốc, trồng từ lâu đời khơng cịn tìm thấy trạng thái mọc tự nhiên Cây nuôi trồng nhiều tỉnh Vân Nam, sau Quảng Tây số quốc gia khác Đài Loan, Nhật Bản, Triều Tiên [4] Sự nhạy cảm với ánh sáng hạn chế phân bố tam thất Trung Quốc [43] Ở Việt Nam, tam thất loại nhập trồng từ Trung Quốc [4] Tam thất trồng với số lượng số tỉnh như: Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai (Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng… vùng núi cao 1200 – 1500 m [1] 1.1.3 Đặc điểm thực vật tam thất Tam thất thân thảo, sống nhiều năm Thân tam thất mọc thẳng, không phân nhánh, cao 30 – 50 cm, màu tím tía Lá kép chân vịt, màu xanh đậm, – mọc vòng, cuống dài – cm, cuống gồm – chét hình mác, cuống chét dài 0,6 – 1,2 cm, gốc thn, đầu có mũi nhọn, mép khía răng, hai mặt có lơng cứng gân, mặt sẫm, mặt nhạt [4] Cụm hoa hoàn chỉnh có đường kính – 25 mm, tổng chiều dài cuống từ – 45mm Cuống nhỏ đầu đầu lại chứa nhiều nụ hoa, với khoảng 130–230 hoa [48].Cụm hoa mọc thành tán đơn thân, có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tính tồn Hoa màu lục vàng nhạt, đài ngắn, màu xanh, tràng cánh rộng phía dưới, nhị 5, bầu Quả mọng, hình cầu dẹt, chín màu đỏ, có hai hạt hình cầu, màu trắng [4] Rễ có hình nón trụ, với chiều dài từ – cm, có màu vàng nâu với vết nhăn nếp rễ Cây thường thu hoạch vào mùa thu, thời gian trước nở hoa nghiền thành bột sử dụng cho đường uống kết hợp với thảo dược khác [4] Hình 1.1 Hình ảnh củ Panax pseudoginseng (Burkill) F H Chen 1.1.4 Thành phần hoá học tam thất Theo nghiên cứu, 200 thành phần hoá học phân lập từ tam thất Trong số đó, saponin (4,42 – 12%) [4] chiếm hàm lượng lớn coi thành phần chính, ngồi tam thất chứa thành phần khác flavonoid, peptit vịng, đường saccarid ngun tố vơ Những thành phần phân bố phận khác rễ, thân, hoa với tỉ lệ khác Saponin coi thành phần Panax pseudoginseng Trong thực tế, có 100 loại saponin phân lập xác định, xthuộc ba nhóm ginsenosid, notoginsenosid gypenosid Hầu hết saponin tam thất triterpen thuộc nhóm Dammarane với nhóm aglycon 20(S)-protopanaxadiol (nhóm Rb) 20(S)-protopanaxatriol (nhóm Rg) PPG có thành phần khơng chứa saponin có nhóm axit oleanolic(nhóm Ro), khác biệt lớn so với Panax ginseng C A Meyer and Panax quinquefolius L Mỗi phận khác tam thất chứa thành phần tỉ lệ saponin khác tuỳ theo phận cụ thể Nghiên cứu cho thấy ginsenosid Rb1 có nhiều tất phận cây, Rg1 giàu thân rễ Rg3 – chất báo cáo khả bảo vệ thần kinh - có hàm lượng lớn nụ hoa tam thất Thông thường, năm loại saponin notoginsenosid R1 (7 – 10%), ginsenosid Rb1 (30 – 36%), Rg1 (20 – 40%), Rd (5 – 8,4%) Re (3,9 – 6%) chiếm tới khoảng 90% tổng số saponin tam thất nghiên cứu ứng dụng thí nghiệm dược lý Trong số đó, ba saponin ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg1 notoginsenosid R1 chọn làm hợp chất tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng tam thất Để tăng cường đa dạng phân tử ginsenosid, đồng nghĩa với khả tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học mới, nghiên cứu khoa học thực nhằm xác định sản phẩm thuỷ phân sản phẩm biến đổi sinh học saponin nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính mới, mở hướng nghiên cứu việc ứng dụng tam thất điều trị [43] Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn với đầu dị PDA bước sóng 203 nm Phân đoạn S1 S2 thu lấy dịch riêng, sau loại dung mơi mơ tả mục 2.2.2 thu saponin tinh chế điển hình S1 S2 Khối lượng cao khô saponin S1 S2 thu bảng 3.10 Bảng 3.10 Khối lượng saponin S1 S2 thu Khối lượng cao tinh chế giàu Khối lượng S1 Khối lượng S2 73,3 71,8 saponin(mg) 250,3 Như từ 250,3 cao tinh chế thu saponin 73,3 mg S1 71,8 mg S2 3.5 Xác định cấu trúc độ tinh khiết saponin tinh chế Saponin S1, S2 xác định cấu trúc phổ khối so sánh thời gian lưu với chuẩn Rg1 Rb1 Kết thu hình 3.8 – 3.11 34 Hình 3.8 Phổ khối saponin S1 Hình 3.9 Phổ khối saponin S2 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu saponin S1 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu saponin S2 Kết sắc ký đồ cho thấy thời gian lưu saponin S1, S2 giống thời gian lưu saponin Rg1, Rb1 tương ứng điều kiện sắc ký Phổ khối S1 có m/z 835,3 tương ứng với [Rg1 + Cl]- Phổ khối S2 có m/z 1143,5 tương ứng với [Rb1 + Cl]- Những kết saponin S1 tinh chế Rg1, saponin S2 tinh chế Rb1 Tiến hành đánh giá độ tinh khiết hai saponin điển hình Rg1 Rb1 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Kết thu saponin Rg1 Rb1 có độ tinh khiết cao 95% tương ứng 98,3 % 97,4% Kết luận: Từ 250,3 mg cao chuẩn hoá giàu saponin tương ứng thu 73,3 mg Rg1 71,8 mg Rb1 có độ tinh khiết 98,3% 97,4% 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Thẩm định phương pháp khẳng định việc kiểm tra cung cấp chứng khách quan chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt (fitness for the purpose) Thẩm định phương pháp phân tích phần khơng thể thiếu muốn có kết phân tích đáng tin cậy [5] Việc thẩm định phương pháp định lượng tam thất có vai trị quan trọng việc định tính, định lượng chất có củ tam thất, xây dựng lên tiêu chuẩn cho nghiên cứu sau Trong trình thẩm định tam thất, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp đầu dò DAD lựa chọn ưu điểm độ xác, nhạy cảm, khả định lượng tốt thích hợp việc tách chất dễ bị phân huỷ nhiệt tam thất Thực tế chứng minh, có nhiều nghiên cứu quy trình thẩm định saponin tam thất thông qua HPLC kết hợp đầu dò DAD với kết thu khả quan [23, 26] Dựa kết ghi nhận được, quy trình thẩm định có độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính khoảng nồng độ từ 10 – 160 µg/ml, độ lặp lại, độ đáp ứng u cầu theo AOAC Theo đó, quy trình thẩm định cho hợp lệ ứng dụng định lượng saponin R1, Rg1, Rb1 Dựa quy trình thẩm định xây dựng, tiến hành định lượng dược liệu nhằm xác định nồng độ ba loại saponin R1, Rg1 Rb1 có mẫu củ tam thất nghiên cứu Kết cho thấy tổng hàm lượng ba loại saponin có mẫu củ tam thất chiếm 7,84% khối lượng dược liệu, với tỷ lệ notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 Rb1 0,69%; 3,50% 3,65% Đối chiếu với tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam V, quy định hàm lượng notoginsenosid R1 khơng 0,4% tổng hàm lượng ba saponin R1, Rb1 Rg1 khơng 5% mẫu dược liệu rễ củ khô kiệt, mẫu có kết đạt chuẩn so yêu cầu đề [2] Thơng qua q trình thẩm định, mẫu củ tam thất cho đạt điều kiện dược liệu, phù hợp cho thử nghiệm chiết xuất tinh chế đề tài 4.2 Về quy trình chiết xuất tinh chế saponin Hiện nay, có nhiều phương pháp tiên tiến ứng dụng việc chiết xuất saponin từ tam thất sử dụng sóng siêu âm, sóng vi ba hay chiết 37 áp suất lớn [38, 39], phương pháp dừng lại phịng thí nghiệm hạn chế kinh phí chiết xuất quy mơ lớn Trong q trình chiết xuất quy mơ cơng nghiệp, việc sử dụng phương pháp chiết xuất tối giản điều kiện sở vật chất coi yếu tố quan trọng Chính ngun nhân trên, nghiên cứu thử nghiệm hiệu suất ba phương pháp ngâm lạnh, chiết nóng đun hồi lưu chiết xuất tam thất, ba phương pháp với kỹ thuật không phức tạp, dung môi dễ kiếm phù hợp với q trình chiết xuất quy mơ lớn dễ ứng dụng công nghiệp Thông qua kết khảo sát, phương pháp chiết nóng (92,48%) khơng đạt hiệu suất cao so với chiết xuất ngâm lạnh (90,43%) đun hồi lưu (91,90%) mà sử dụng dung môi nước tinh khiết, dung môi dễ kiếm an tồn phịng thí nghiệm với môi trường so với ethanol Dựa kết trên, phương pháp chiết nóng sử dụng đề tài q trình chiết xuất saponin tồn phần từ dược liệu thô Thông qua việc ứng dụng phương pháp, kết định lượng cho thấy hàm lượng trung bình ba saponin tam thất chiết xuất chiếm 7,25% khối lượng dược liệu thô ban đầu với hiệu suất chiết xuất cao 92,52% Đây coi phương pháp chiết xuất đơn giản, hiệu cao mặt kinh tế, tạo tiền việc nâng cấp quy mơ cơng nghiệp Q trình tinh chế saponin toàn phần từ cao tam thất chiết xuất được tiến hành thông qua phương pháp sắc ký cột sử dụng nhựa macroporous D101 Nguyên lý trình phân tách dựa khác biệt khối lượng phân tử, độ phân cực hình dạng phân tử dẫn đến khác biệt lực chất hấp phụ Dựa nguyên lý trên, pha loãng cho cao hấp phụ vào cột chứa nhựa macroporous D101, phân tử saponin giữ lại cột lực lớn saponin với pha tĩnh tạp chất với lực thấp loại bỏ Sau đó, trình rửa giải với nước tinh khiết loại bỏ tạp chất phân cực polysaccarid hay amino axit khỏi cột [40] Dựa nghiên cứu trước, saponin thông qua việc rửa giải cột với ethanol nồng độ 70o nhằm rửa giải hai nhóm saponin Rb Rg với hiệu suất cao [3] Phương pháp tiến hành có hiệu suất tinh chế cao lên tới 98% đạt hiệu suất tồn q trình 90,78%, cao so với quy trình tinh chế trước [3, 21, 22, 44] Tổng hàm lượng saponin cao khô tinh chế (73,67%) tương đương so với phương pháp sử dụng nhựa macroporous D101 tinh chế trước [3] Nồng độ thu ba loại saponin R1 (6,5%), Rg1 (33,7%) Rb1 (33,5%) cao khô tinh chế coi phù hợp với hàm lượng ba loại saponin điển hình R1, Rb1 Rg1 thử nghiệm Thẩm Dương, Trung Quốc, với tỉ lệ ginsenosid Rb1 từ 26,17 – 29,60%, Rg1 từ 20,50 – 25,43% notoginsenosid R1 38 khoảng 5,29% – 6,89% [46] Dựa kết trên, phương pháp tinh chế saponin toàn phần từ cao tam thất đề tài đánh giá tốt, với nhiều ưu điểm hiệu suất chiết xuất cao, sử dụng dung môi dễ kiếm, rẻ, phù hợp nghiên cứu sâu lĩnh vực ứng dụng sản xuất cao chuẩn hóa giàu saponin từ tam thất Trong trình tinh chế saponin điển hình, dựa kết điều kiện pha động thời gian lưu khảo sát trình thẩm định phương pháp Thực nghiệm thu kết với 73,3 mg S1 và 71,8 mg S2 phân lập từ 250,3 mg cao tinh chế giàu saponin 4.3 Về quy trình xác định cấu trúc độ tinh khiết saponin tinh chế Phổ khối phương pháp sử dụng thường xuyên việc xác định cấu trúc phân tử có nhiều ứng dụng với PPG, việc xác định saponin riêng biệt nghiên cứu chiết xuất tinh chế [38] hay thử nghiệm in vivo tác dụng dược lý [7], với kết xác Trong nghiên cứu này, phổ khối xác định hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ LC-MS/MS với nguồn ion ESI Nguồn ion ESI thường sử dụng chất phân cực có trọng lượng phân tử lớn, coi phù hợp với nhóm chất saponin Trong thử nghiệm, hai saponin ginsenosid Rg1 (S1) ginsenosid Rb1 (S2) phân lập xác định cấu trúc thông qua LC-MS/MS kết hợp ESI, kết thu phổ khối 835,3 m/z [Rg1 + Cl]- 1143,5 m/z tương ứng với [Rb1 + Cl]- Có nhiều thay đổi tiến hành nhằm tăng độ nhạy cụ thể hoá việc xác định cấu trúc saponin Một thí nghiệm nhằm xác định cấu trúc ba saponin R1, Rg1 Rb1 mẫu huyết chó so sánh điều kiện thực phổ khối, với kết ghi nhận khả ghi nhận ion tốt nguồn ion ESI so với nguồn ion hố học áp suất khí quyển(APCI) độ nhạy [M + Na]- cho tốt so với [M + Cl]-, [M + HCOO]- hay [M – H]- việc lựa chọn dung mơi từ nghiên cứu trước [34] Sự kết hợp LC-MS/MS với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NRM) cho phương pháp hữu ích việc tăng cường khả xác định cấu trúc cụ thể saponin, với khả phát hạt nhân 1H, 8O 12C tốt so với phổ LC-MS/MS, kèm theo ưu điểm khác bảo tồn mẫu phân tích hay khả tái tạo kết dựa kết thu từ thí nghiệm trước [14] 39 Độ tinh khiết Rg1 Rb1 thu tương ứng 98,3 % 97,4% thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Kết hứa hẹn saponin Rg1 Rb1 phát triển để dùng làm chất chuẩn phịng thí nghiệm 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua thời gian thực đề tài, trình nghiên cứu thu kết theo mục tiêu nghiên cứu đề ra: - Đã xây dựng quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 Rb1 củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen - Xây dựng sơ quy trình bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ củ tam thất với tổng hàm lượng tính theo saponin (R1, Rg1, Rb1) đạt 70% tinh hai saponin Rg1 Rb1 từ cao chuẩn hoá giàu saponin đạt độ tinh khiết cao 95% Đề xuất - Nâng cấp quy mơ cơng nghiệp quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin - Tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng dược lý ginsenosid Rg1 Rb1 mơ hình thí nghiệm động vật 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 289-291 Hội đồng dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, Bộ Y tế Trần Trọng Biên cộng (2016), "Chiết xuất tinh chế saponin từ củ Tam thất (Panax notoginseng Burk.)", Tạp chí Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc 4+5, tr 47-51 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập NXB Khoa học Kỹ thuật, 775-780 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), "Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật", NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 10-59 Tài liệu tiếng Anh 10 11 12 13 14 Association of Official Analytical Chemists (2002), AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals, - 38 Chen M Y et al (2018), "Metabolic analysis of Panax notoginseng saponins with gut microbiota-mediated biotransformation by HPLC-DAD-Q-TOFMS/MS", J Pharm Biomed Anal 150, pp 199-207 Cheok Choon Yoong, Salman Hanaa Abdel Karim and Sulaiman Rabiha (2014), "Extraction and quantification of saponins: A review", Food Research International 59, pp 16-40 Chu Y et al (2020), "Ginsenoside Rg1 Induces Apoptotic Cell Death in Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines and Prevents Carcinogen-Induced Breast Tumorigenesis in Sprague Dawley Rats", Evid Based Complement Alternat Med 2020, pp 8886955 Cui Xiuming and Sun Yuqin (2008),"Method for extracting panax notoginseng saponins from fresh panax notoginseng", Google Patent, China, CN101513438A Du Qizhen et al (2003), "Isolation of dammarane saponins from Panax notoginseng by high-speed counter-current chromatography", Journal of Chromatography A 1008(2), pp 173-180 Gao Hongwei et al (2020), "Ginsenoside Rb1 exerts anti-inflammatory effects in vitro and in vivo by modulating toll-like receptor dimerization and NFkB/MAPKs signaling pathways", Phytomedicine 69, pp 153197 Gao Y et al (2017), "Hepatoprotective effects of ginsenoside Rg1 - A review", J Ethnopharmacol 206, pp 178-183 Gathungu Rose M et al (2020), "The integration of LC-MS and NMR for the analysis of low molecular weight trace analytes in complex matrices", Mass spectrometry reviews 39(1-2), pp 35-54 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Gu Qun et al (2010),"Method for extraction and seperation of ginsenoside Rg1", Google Patent, China, CN102532234A He Qing et al (2007),"Preparation method for extracting purified general saponin from notoginseng of Chinese traditional medicine", Google Patent, China, CN101049331A Hong J et al (2014), "In vitro antioxidant and antimicrobial activities of flavonoids from Panax notoginseng flowers", Nat Prod Res 28(16), pp 12606 Hong S J et al (2009), "Angiogenic effect of saponin extract from Panax notoginseng on HUVECs in vitro and zebrafish in vivo", Phytother Res 23(5), pp 677-86 Hu Yupiao et al (2018), "Optimisation of Ethanol-Reflux Extraction of Saponins from Steamed Panax notoginseng by Response Surface Methodology and Evaluation of Hematopoiesis Effect", Molecules 23(5) Huang Y et al (2017), "Ginsenoside Rg1 Activates Dendritic Cells and Acts as a Vaccine Adjuvant Inducing Protective Cellular Responses Against Lymphomas", DNA Cell Biol 36(12), pp 1168-1177 Huang Yusheng et al (2014),"Method for purifying R1 and Rb1 from Panax notoginsenosides", Google Patent, China, CN105796577A Lan Xing et al (2014),"The method that Rg1, Re and Rb1 are purified from arasaponin", Google Patent, China, CN105801656A Lau Aik-Jiang, Woo Soo-On and Koh Hwee-Ling (2003), "Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection", Journal of Chromatography A 1011(1), pp 77-87 Lee S Y (2020), "Ginsenoside Rg1 Drives Stimulations of Timosaponin AIIIInduced Anticancer Effects in Human Osteosarcoma Cells", Evid Based Complement Alternat Med 2020, pp 8980124 Li Lie et al (2005), "Determination of Four Active Saponins of Panax Notoginseng in Rat Feces by High-Performance Liquid Chromatography", Journal of Chromatographic Science 43(8), pp 421-425 Li Lie et al (2005), "Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high-performance liquid chromatography-UV method", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 38(1), pp 4551 Liu S J and Zhou S W (2000), "Panax notoginseng saponins attenuated cisplatin-induced nephrotoxicity", Acta Pharmacol Sin 21(3), pp 257-60 Liu X et al (2014), "Panax notoginseng saponins attenuates cisplatin-induced nephrotoxicity via inhibiting the mitochondrial pathway of apoptosis", Int J Clin Exp Pathol 7(12), pp 8391-400 Majinda Runner (2012), "Extraction and Isolation of Saponins", Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 864, pp 415-26 Ning Ning et al (2012), "Panax notoginsenoside produces neuroprotective effects in rat model of acute spinal cord ischemia–reperfusion injury", Journal of Ethnopharmacology 139(2), pp 504-512 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Park S et al (2008), "Ginsenosides Rb1 and Rg1 suppress triglyceride accumulation in 3T3-L1 adipocytes and enhance beta-cell insulin secretion and viability in Min6 cells via PKA-dependent pathways", Biosci Biotechnol Biochem 72(11), pp 2815-23 Qi L W., Wang C Z and Yuan C S (2011), "Isolation and analysis of ginseng: advances and challenges", Nat Prod Rep 28(3), pp 467-95 Shu-lin Chen (2005), "Simultaneous Distillation and Solvent Extraction and GC/MS Analysis of Volatile Oil from Flowers of Panax notoginseng (Burk.) F H Chen", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis Song M et al (2010), "Simultaneous determination of three Panax notoginseng saponins at sub-nanograms by LC-MS/MS in dog plasma for pharmacokinetics of compound Danshen tablets", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 878(32), pp 3331-7 Tan Ning-Hua and Zhou Jun (2006), "Plant Cyclopeptides", Chemical Reviews 106(3), pp 840-895 Tian W et al (2017), "Effects of ginsenoside Rg1 on glucose metabolism and liver injury in streptozotocin-induced type diabetic rats", Genet Mol Res 16(1) Uzayisenga R., Ayeka P A and Wang Y (2014), "Anti-diabetic potential of Panax notoginseng saponins (PNS): a review", Phytother Res 28(4), pp 5106 Vongsangnak Wanwipa et al (2004), "Towards efficient extraction of notoginseng saponins from cultured cells of Panax notoginseng", Biochemical Engineering Journal 18(2), pp 115-120 Wan J B et al (2006), "Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41(1), pp 274-279 Wan J B et al (2008), "Quantification and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins from Panax notoginseng with macroporous resins", Separation and Purification Technology 60(2), pp 198-205 Wan Jian-Bo et al (2013), "Separation and purification of saponin from Panax Notoginseng by preparative high-performance liquid chromatography", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 36(3), pp 406417 Wang J et al (2011), "Isolation of four high-purity dammarane saponins from extract of Panax notoginseng by centrifugal partition chromatography coupled with evaporative light scattering detection in one operation", Phytochem Anal 22(3), pp 263-7 Wang Ting et al (2016), "Traditional uses, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen: A review", Journal of Ethnopharmacology 188, pp 234-258 Wang Yitao, Wan Jianbo and Zhang Qingwen (2008),"Method for preparing notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd", Google Patent, China, CN101575357A 45 46 47 48 49 50 51 Xu Y et al (2018), "Panax notoginseng for Inflammation-Related Chronic Diseases: A Review on the Modulations of Multiple Pathways", Am J Chin Med 46(5), pp 971-996 Yao Hong et al (2011), "Chemical fingerprinting and quantitative analysis of a Panax notoginseng preparation using HPLC-UV and HPLC-MS", Chinese medicine 6, pp Zhang Pengfei (2015),"Method for preparing panax notoginseng saponins", Google Patent, China, CN104800258A Zhang Siqi et al (2018), "Phytochemistry, pharmacology, and clinical use of Panax notoginseng flowers buds: Active Components and Uses of Panax notoginseng Flowers", Phytotherapy Research 32 Zhang Y et al (2013), "Bioactive protopanaxatriol type saponins isolated from the roots of Panax notoginseng (Burk.) F H Chen", Molecules 18(9), pp 10352-66 Zhang Y G et al (2008), "Panax notoginseng saponins attenuate atherosclerosis in rats by regulating the blood lipid profile and an antiinflammatory action", Clin Exp Pharmacol Physiol 35(10), pp 1238-44 Zheng Xian et al (2017), "Ginsenoside Rb1 improves cardiac function and remodeling in heart failure", Experimental Animals 66(3), pp 217-228 PHỤ LỤC Sắc ký đồ mẫu chuẩn R1 Sắc ký đồ mẫu Rb1 chuẩn Sắc ký đồ mẫu Rg1 chuẩn Sắc ký đồ mẫu thử củ tam thất Sắc ký đồ mẫu tam thất tinh chế Phổ khối Rb1 Phổ khối Rg1 ... xuất cao chuẩn h? ?? giàu saponin tinh chế saponin từ củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F. H. Chen với hai mục tiêu sau: Xây dựng quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 Rb1 có củ tam thất Xây. .. cho thấy hiệu suất chiết xuất cao đạt 92,52 % 3.4 Tinh chế saponin mẫu củ tam thất 3.4.1 Tinh chế saponin toàn phần Tiến h? ?nh tinh chế saponin toàn phần theo mô tả mục 2.2.2 để thu cao chuẩn hoá. .. Rb1 củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F. H. Chen - Xây dựng sơ quy trình bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ củ tam thất với tổng h? ?m lượng tính theo saponin (R1, Rg1, Rb1) đạt 70% tinh hai