XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO NGHỆ VÀ CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. Thonn) là dược liệu được dùng để chữa một số bệnh như viêm gan, vàng da, viêm thận, điều kinh… Gần đây, cao Diệp hạ châu đắng được dùng nhiều để hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan... Nghệ vàng (Curcuma longa L.) không chỉ có công dụng giúp liền sẹo, mau lên da non các vết thương mà còn được sử dụng để điều trị bệnh đau dạ dày, kích thích bài tiết mật… Hiện nay, nhu cầu trong nước và trên thế giới về cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng là rất lớn. Nguồn dược liệu Nghệ và Diệp hạ châu đắng của nước ta hoàn toàn có khả năng đáp ứng nhu cầu sản xuất cao chiết trong nước và xuất khẩu. Một số công ty dược phẩm trong nước hiện đã sản xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng. Tuy nhiên, việc chiết xuất, tiêu chuẩn hóa các cao này vẫn chưa đáp ứng yêu cầu sản suất tại các nhà máy GMP. Mặt khác, tiêu chuẩn của các cao chưa đáp ứng được yêu cầu của đối tác nước ngoài nên không xuất khẩu được các sản phẩm này với số lượng lớn. Chính vì vậy, các dược liệu này chủ yếu được xuất khẩu dưới dạng dược liệu thô và giá thành thấp. Chất lượng cao Nghệ, cao Diệp hạ châu đắng và các sản phẩm chứa các cao này chưa đạt và không ổn định là do các nguyên nhân sau: Quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa nên hiệu suất chiết chưa cao, chất lượng cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng còn thấp, không ổn định. Do đó, tác dụng điều trị không đảm bảo vì chứa ít hoặc không có các hoạt chất. Việc kiểm nghiệm cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng chỉ được thực hiện sơ sài, thiếu tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm thích hợp. Do chưa có tiêu chí chất lượng rõ ràng, việc tiêu chuẩn hóa các cao nguyên liệu này để đưa vào sản xuất các sản phẩm gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng. Kết quả thu được từ đề tài này sẽ là cơ sở cho dự án sản xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng thương phẩm có chất lượng cao, tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc chất lượng. Đồng thời, góp phần đảm bảo chất lượng các thuốc có chứa các cao nói trên vì các cao này đều được tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chặt chẽ. Để xây dựng quy trình chiết xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng, đề tài này được thực hiện với những mục tiêu cụ thể sau: Tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu Nghệ và Diệp hạ châu đắng. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong cao Diệp hạ châu đắng. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng curcumin I trong cao Nghệ. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng thông qua thiết kế thí nghiệm, phân tích liên quan nhân quả và tối ưu hóa các thông số. Tiêu chuẩn hóa cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng

NGUYỄN ĐỨC HẠNH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

CAO NGHỆ VÀ CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2009

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO NGHỆ VÀ CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

Chuyên ngành: Bào chế - Công nghiệp Dược

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Đức Hạnh

1.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 13

1.4 NỘI DUNG CỦA MỘT TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU 16

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 30

3.2 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NGHỆ 34

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 39

3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT CAO NGHỆ 48

3.5 TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 57

3.6 TIÊU CHUẨN HÓA CAO NGHỆ 63

(High Performance Liquid Chromatography)

QTCX Quy trình chiết xuất

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

(Relative Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Chương trình gradient dung môi HPLC định lượng curcumin I 24

Bảng 3.1 Kết quả định tính hóa học dược liệu Diệp hạ châu đắng 32

Bảng 3.3 Tro toàn phần của dược liệu Diệp hạ châu đắng 33

Bảng 3.4 Tóm tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Diệp hạ châu đắng 34

Bảng 3.5 Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu Nghệ 37

Bảng 3.7 Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu Nghệ 38

Bảng 3.8 Hàm lượng các chất chiết được từ dược liệu Nghệ bằng ethanol 38

Bảng 3.9 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh phyllanthin 40

Bảng 3.10 Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ phyllanthin 40

Bảng 3.11 Độ chính xác của phương pháp định lượng phyllanthin 41

Bảng 3.12 Độ đúng của phương pháp định lượng phyllanthin 42

Bảng 3.13 Dữ liệu thực nghiệm quy trình chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng 43 Bảng 3.14 Liên quan nhân quả trong QTCX cao Diệp hạ châu đắng 44

Bảng 3.15 Đánh giá các mô hình nhân quả đối với cao Diệp hạ châu đắng 45

Bảng 3.16 Kết quả dự đoán và thực nghiệm đối với cao Diệp hạ châu đắng 46 Bảng 3.17 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh curcumin I 49

Bảng 3.18 Sự tương quan giữa điện tích đỉnh và nồng độ curcumin I 50

Bảng 3.19 Độ chính xác của phương pháp định lượng curcumin I 51

Bảng 3.20 Độ đúng của phương pháp định lượng curcumin I 51

Bảng 3.21 Dữ liệu thực nghiệm quy trình chiết xuất cao Nghệ 52

Bảng 3.22 Liên quan nhân quả trong quy trình chiết xuất cao Nghệ 53

Bảng 3.23 Đánh giá các mô hình nhân quả đối với cao Nghệ 54

Bảng 3.24 Kết quả dự đoán và thực nghiệm đối với cao Nghệ 55

Bảng 3.26 Cắn không tan trong nước của cao Diệp hạ châu đắng 57

Bảng 3.27 Tro toàn phần của cao Diệp hạ châu đắng 58

Bảng 3.28 Tro không tan trong acid của cao Diệp hạ châu đắng 58

Bảng 3.29 Tro sulfat của cao Diệp hạ châu đắng 58

Bảng 3.30 Tro tan trong nước của cao Diệp hạ châu đắng 59

Bảng 3.32 Giới hạn kim loại nặng của cao Diệp hạ châu đắng 60

Bảng 3.33 Kết quả định tính alcaloid trong cao Diệp hạ châu đắng 60

Bảng 3.34 Hàm lượng phyllanthin trong cao Diệp hạ châu đắng 61

Bảng 3.35 Tóm tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Diệp hạ châu đắng 62

Bảng 3.37 Cắn không tan trong nước của cao Nghệ 63

Bảng 3.40 Tro không tan trong acid hydrochlorid của cao Nghệ 64

Bảng 3.44 Kết quả định lượng curcumin I trong cao Nghệ 66

Bảng 3.45 Tóm tắt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Nghệ 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Công thức hóa học của phyllanthin và hypophyllanthin 5

Hình 1.4 Công thức của curcumin I (a), curcumin II (b) và curcumin III (c) 10 Hình 2.1 Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 19

Hình 3.3 SKLM dịch chiết cloroform dược liệu Diệp hạ châu đắng 33

Hình 3.9 Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ phyllanthin 41

Hình 3.10 Ảnh hưởng của độ cồn, số lần chiết trên HSC cao Diệp hạ châu

Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC định lượng curcumin I trong cao Nghệ 48

Hình 3.13 Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ curcumin I 50

Hình 3.14 Ảnh hưởng của độ cồn và số lần chiết trên HSC cao Nghệ 54

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu 14

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng 20

Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết xuất cắn cloroform từ cao Diệp hạ châu đắng 21

Sơ đồ 3.4 Quy trình chiết xuất cắn ethyl acetat từ cao Nghệ 23

Sơ đồ 3.5 Quy trình tối ưu chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng 47

MỞ ĐẦU

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum & Thonn) là dược liệu được dùng

để chữa một số bệnh như viêm gan, vàng da, viêm thận, điều kinh… Gần đây, caoDiệp hạ châu đắng được dùng nhiều để hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan B, gan nhiễm

mỡ, xơ gan Nghệ vàng (Curcuma longa L.) không chỉ có công dụng giúp liền sẹo,

mau lên da non các vết thương mà còn được sử dụng để điều trị bệnh đau dạ dày,kích thích bài tiết mật…

Hiện nay, nhu cầu trong nước và trên thế giới về cao Nghệ và cao Diệp hạ châuđắng là rất lớn Nguồn dược liệu Nghệ và Diệp hạ châu đắng của nước ta hoàn toàn

có khả năng đáp ứng nhu cầu sản xuất cao chiết trong nước và xuất khẩu Một sốcông ty dược phẩm trong nước hiện đã sản xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châuđắng Tuy nhiên, việc chiết xuất, tiêu chuẩn hóa các cao này vẫn chưa đáp ứng yêucầu sản suất tại các nhà máy GMP Mặt khác, tiêu chuẩn của các cao chưa đáp ứngđược yêu cầu của đối tác nước ngoài nên không xuất khẩu được các sản phẩm nàyvới số lượng lớn Chính vì vậy, các dược liệu này chủ yếu được xuất khẩu dướidạng dược liệu thô và giá thành thấp

Chất lượng cao Nghệ, cao Diệp hạ châu đắng và các sản phẩm chứa các cao nàychưa đạt và không ổn định là do các nguyên nhân sau:

- Quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa nên hiệu suất chiết chưa cao, chấtlượng cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng còn thấp, không ổn định Do đó, tácdụng điều trị không đảm bảo vì chứa ít hoặc không có các hoạt chất

- Việc kiểm nghiệm cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng chỉ được thực hiện sơsài, thiếu tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm thích hợp

- Do chưa có tiêu chí chất lượng rõ ràng, việc tiêu chuẩn hóa các cao nguyên liệunày để đưa vào sản xuất các sản phẩm gặp nhiều khó khăn

Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình chiếtxuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng Kết quả thu được từ đề tài này sẽ là cơ sởcho dự án sản xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng thương phẩm có chất lượngcao, tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc chất lượng Đồng thời, góp phần đảm bảochất lượng các thuốc có chứa các cao nói trên vì các cao này đều được tiêu chuẩnhóa và kiểm nghiệm chặt chẽ

Để xây dựng quy trình chiết xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng, đề tài nàyđược thực hiện với những mục tiêu cụ thể sau:

- Tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu Nghệ và Diệp hạ châu đắng

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong cao Diệp hạ châu đắng

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng curcumin I trong cao Nghệ

- Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắngthông qua thiết kế thí nghiệm, phân tích liên quan nhân quả và tối ưu hóa các thông số

- Tiêu chuẩn hóa cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum & Thonn.

Họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae) [16]

1.1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT

Cây thảo, cao 10-40 cm, ít phân cành, màu xanh Lá mỏng, hình bầu dục, gân mờ,

hai mặt màu ít khác nhau Lá non đầu cành màu xanh lục nhạt, mép lá nhẵn, đầu lá

tròn Hoa đơn tính, mọc kẽ lá, không có cánh hoa, màu lục nhạt Hoa đực có cuống

ngắn xếp ở dưới hoa cái Hoa cái có cuống dài Vị rất đắng, mùi hăng [7]

Hình 1.1 Toàn cây, lá và quả Diệp hạ châu đắng

1.1.2 PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI

Diệp hạ châu đắng có nguồn gốc xa xưa ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ và hiện nay phân

bố rải rác ở các vùng nhiệt đới Ở Châu Á, vùng phân bố Diệp hạ châu đắng gồm

các nước Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt

Nam, Trung Quốc Ở Việt Nam, Diệp hạ châu đắng phân bố rải rác khắp nơi, từ

các tỉnh ở vùng đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh ở trung du miền núi

có độ cao dưới 800 m

Diệp hạ châu đắng là cây ưa sáng và có thể chịu bóng râm khi còn nhỏ hoặc mọcxen lẫn với những loại cây cỏ khác Cây thường mọc ở đất ẩm trong vườn, ruộngtrồng hoa màu, ven đường đi hay trên nương rẫy Cây con mọc từ hạt, thường xuấthiện vào cuối mùa xuân Sinh trưởng nhanh trong vòng 2 tháng hè, sau đó ra hoaquả và tàn lụi Toàn bộ vòng đời của cây chỉ kéo dài trong 3-4 tháng Hạt của Diệp

hạ châu đắng tồn tại trên mặt đất 7-8 tháng vẫn còn sức nẩy mầm [3]

1.1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Diệp hạ châu đắng gồm có các nhóm hợp chất chính như alcaloid, lignan,triterpenoid, flavonoid, tanin và một số chất khác

1.1.3.1 Sơ lược về lignan

Lignan là một trong những thành phần gây nhiều chú ý cho các nhà nghiên cứu.Lignan là một nhóm hợp chất hóa học tìm thấy ở cây, đặc biệt ở hạt lanh Lignantrong cây là hợp chất polyphenolic có liên quan đến chuyển hóa sinh học củaphenylalanin, hoạt động tương tự như chất chống oxi hóa

Nhiều lignan có khả năng kháng khối u Hoạt động đặc biệt này do sự can thiệp vàoquá trình phân bào bằng 2 cơ chế khác nhau ở cả người và động vật Một vài lignanhoạt động hiệu quả trong việc làm dịu thần kinh trung ương và khóa men c-AMPphosphodiesterase, trong khi một số khác được dùng như một chất độc đối với cá vàngăn sự nẩy mầm Ở Trung Quốc, một số lignan được dùng để bảo vệ gan [3]

1.1.3.2 Lignan trong Diệp hạ châu đắng

Phyllanthin và hypophyllanthin trong lá Diệp hạ châu đắng là hai lignan tiêu biểu.Trong đó, phyllanthin có hàm lượng lớn nhất (0,35%) Hai lignan phyllanthin vàhypophyllanthin được nhiều tài liệu công bố có tác dụng sinh học đáng chú ý nhưkháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm, đặc biệt là trị viêm gan [9]

Hình 1.2 Công thức hóa học của phyllanthin và hypophyllanthin

Bên cạnh hai lignan trên, trong Diệp hạ châu đắng, còn có các lignan khác nhưniranthin, nirtetralin, phyltetralin, hinokinin và isolintetralin Các lignan hầu hếtđược tìm thấy trong phân đoạn chiết với dung môi kém phân cực, chủ yếu từ dịchchiết n-hexan [11]

1.1.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

1.1.4.1 Tác dụng trị viêm gan, bảo vệ tế bào gan

Tác dụng chống viêm gan, bảo vệ tế bào gan của Diệp hạ châu đắng là lãnh vực màcác nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu

Phyllanthin và hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu đắng là chất bảo vệ các tếbào gan chống lại carbon tetrachlorid và galactosamin [16]

Diệp hạ châu đắng có thể ngăn sự tăng trưởng, ngăn sự gia tăng số lượng virus, dokhóa trực tiếp hay ngăn ngừa sự sao chép vật liệu di truyền của virus Kết quả thửnghiệm lâm sàng cho thấy Diệp hạ châu đắng có khả năng ức chế enzym DNA

polymerase của virus gây bệnh gan và virus viêm gan B, có hoạt tính in vitro đối

kháng với enzym transcriptase ngược của retrovirus, do đó làm giảm quá trình sao

mã và dịch mã của virus viêm gan B [20]

Ngoài ra, tác dụng trị viêm gan B còn do Diệp hạ châu đắng có khả năng gây bấthoạt kháng nguyên bề mặt viêm gan B [8]

1.1.4.2 Tác dụng trị ung thư

Diệp hạ châu đắng có tác dụng chống sự tăng sinh của tế bào Kết quả nghiên cứutại Thái Lan nhận thấy phyllanthin và hypophyllanthin có tác dụng tăng cường tínhđộc tế bào của vinblastin ở các tế bào KJ3 kháng thuốc [18]

1.1.4.3 Tác dụng kháng HIV (Human Immuno-deficiency Virus)

Các nhà khoa học người Đức nhận thấy dịch chiết nước và dịch chiết cồn của Diệp

hạ châu đắng có khả năng ức chế sự sao chép của HIV-1 trong tế bào HeLa CD4+ Ngoài ra, các thành phần trong Diệp hạ châu đắng có hoạt tính ngăn cản sự sao chépsớm trong chu kỳ sống của HIV-1, ngăn cản sự hấp thu virus và ức chế enzymreverse transcriptase của virus

Nhóm HIV-1 và 2 đề kháng với chất ức chế enzym reverse transcriptase cũng nhạycảm với Diệp hạ châu đắng [19]

1.1.4.4 Tác dụng chống thụ cảm đau

Dịch chiết cồn nước của Diệp hạ châu đắng ức chế đáng kể sự đau thắt ruột do acidacetic, ức chế sự đau thần kinh do capsaicin hay formalin Tác dụng này phụ thuộcliều sử dụng [22]

1.1.4.5 Tác dụng kháng khuẩn

Các nhà khoa học người Cộng hòa Séc nhận thấy dịch chiết từ Diệp hạ châu đắng

có hoạt tính kháng khuẩn đặc biệt là trên vi khuẩn gram âm Các vi khuẩn nhạy cảm

bao gồm Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa,

Proteus mirabilis, Salmonella paratyphi và Staphylococcus aureus

Trong các thành phần phân lập từ Diệp hạ châu đắng thì các tanin như corilagin,

geraniin và acid gallic cho thấy có hoạt tính in vitro chống lại Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus và Escherichia coli [17].

1.1.4.6 Tác dụng khác

Dịch chiết methanol của Diệp hạ châu đắng ức chế sự thương tổn và viêm dạ dày dodùng ethanol tuyệt đối Tỷ lệ tử vong, chỉ số loét cũng như sự chảy máu trong bụngcũng được giảm khi dùng Diệp hạ châu đắng

Diệp hạ châu đắng có hoạt tính loại sạch gốc tự do và các superoxid, các gốchydroxyl và các lipoperoxid Vì phản ứng viêm là do sự oxi hóa các chất từ đại thựcbào nên nhiều chất chống oxi hóa có thể hiệu quả trong việc làm giảm phản ứngviêm, trong đó có viêm dạ dày

Một cơ chế khác trong hoạt tính ức chế thương tổn dạ dày do cồn có thể là do sựhình thành một lớp bảo vệ gồm các polyphenol có trong Diệp hạ châu đắng với cácprotein của dạ dày bằng liên kết kỵ nước

Ngoài ra, Diệp hạ châu đắng còn có thể ức chế sự tổng hợp prostaglandin giống nhưcác thuốc kháng viêm NSAID [21]

1.1.5 CÔNG DỤNG

Diệp hạ châu đắng được dùng làm thuốc trị viêm gan, vàng da, sốt, trị rắn cắn Mỗingày dùng 20-40 g cây tươi, giã lấy nước uống hoặc 8-16 g cây khô sắc uống Dịch ép lá dùng đắp ngoài trị lở loét Diệp hạ châu đắng được dùng trị sốt rét, sỏithận, sỏi bàng quang, các rối loạn về tiết niệu nói chung

1.1.6 ĐỘC TÍNH

Độc tính tế bào in vitro dịch chiết methanol từ Phyllanthus amarus đã được nghiên

cứu trên tế bào ung thư buồng trứng A2780 của người Kết quả cho thấy phân đoạndichloromethan là độc nhất, phân đoạn methanol phân cực là ít độc nhất [10]

1.2.2 PHÂN BỐ, SINH THÁI

Nghệ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông

Á Nghệ là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu bóng Cây thích nghi được với nhiềuvùng khí hậu khác nhau, từ nơi có khí hậu nhiệt đới điển hình đến những nơi có khíhậu cận nhiệt đới

Vào mùa đông, toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi hoặc khô Cây mọc lại vào giữamùa xuân, có hoa sau khi đã ra lá Hoa tự thụ phấn hoặc nhờ côn trùng

Nghệ có trữ lượng khá dồi dào ở Việt Nam Bên cạnh nguồn cung cấp do nhân dântrồng, ở một số địa phương phía bắc, Nghệ mọc hoang dại ước tính trữ lượng tới

có các monoterpen [1]

1.2.4.2 Curcumin

Tinh thể curcumin màu nâu đỏ, ánh tím, không tan trong nước, tan trong cồn, ethylacetat, ether, cloroform cho dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục, tan trong chấtbéo, tan trong acid, tan trong trong kiềm [5],[13]

Chất màu curcumin là một hỗn hợp, gồm có:

- Curcumin I (diferuloylmethan) chiếm 60%

- Curcumin II (monodesmethoxy curcumin) chiếm 24%

- Curcumin III (bidesmethoxy curcumin) chiếm 14%

Bên cạnh đó, còn có các curcumin khác nữa nhưng với lượng nhỏ (curcumin IV vàcurcumin V) [23, 25]

Hình 1.4 Công thức của curcumin I (a), curcumin II (b) và curcumin III (c)

Ngoài ra, Nghệ còn chứa tinh bột, chất béo…

Thử nghiệm gây độc tế bào bằng carbon tetraclorid và galactosamin trên các tế bàogan chuột cống trắng cho thấy cao thân rễ Nghệ có hoạt tính dự phòng mạnh chốngtổn thương gan gây bởi hai chất trên [1].

1.2.5.2 Tác dụng trên dạ dày – ruột

Nghệ có tác dụng chống viêm loét dạ dày, giảm độ acid dịch vị và cải thiện hệ tiêuhóa Thí nghiệm cho thỏ uống cao methanol của Nghệ cho thấy sự giảm tiết dịch vị

và tăng lượng chất nhầy trong dạ dày thỏ Khi cho chuột cống trắng uống cao cồn,kết quả làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày-tá tràng chống lại thươngtổn gây bởi sự co thắt môn vị, stress, indomethacin… Curcumin dự phòng và cảithiện những thương tổn gây ở dạ dày do kích thích sản sinh chất nhầy [24]

1.2.5.3 Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm

Nghệ có hoạt tính ức chế viêm cấp tính và viêm mạn tính trong các mô hình gâyphù bàn chân và gây u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng Tác dụng này tương

tự như hydrocortison acetat và indomethacin

Tinh dầu Nghệ có hoạt tính chống viêm khớp thực nghiệm Hoạt tính này do sự ứcchế các enzym trypsin và hyaluronidase Curcumin và dẫn chất có hoạt tính chốngviêm do khả năng thu dọn những gốc oxy có liên quan đến quá trình viêm [24]

M M Semiakin và cộng sự đã chứng minh curcumin I có tác dụng ngăn cản sự

phát triển của vi trùng lao Mycobacterium tuberculosis ở nồng độ 25 γ/ml

Ngoài ra, Curcumin I còn có hiệu lực kháng Salmonella paratyphi ở nồng độ 200 γ/ml, với Staphyllococcus aureus ở nồng độ 50 γ/ml, nấm Trychotyphon gypcum ở

nồng độ 25 γ/ml [5]

1.2.5.4 Tác dụng trên da

Curcumin ức chế vi khuẩn Propiobacterium acnes Kem Nghệ được điều trị cho thỏ

đã gây bỏng thực nghiệm cho kết quả tốt Trong điều trị bỏng, kem Nghệ có tác

dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ tổ chức hoại tử bỏng, có tác dụng kích thíchtái lập tổ chức và liền sẹo [15].

1.2.5.5 Tác dụng chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hoá của curcumin là do nhóm hydroxyl Kim loại tạo phức vớicurcumin ở vị trí nguyên tử oxy của hai nhóm hydroxyl Vì vậy, những phức nàykhông còn hoạt tính [6]

Curcumin có màu vàng chanh sáng đẹp và bền vững nên được dùng để nhuộm vàngthực phẩm, nhuộm len tơ, nhuộm da, giấy Trong dược phẩm, curcumin còn dùnglàm chất nhuộm màu để bao viên

Nghệ được dùng ngoài để chữa bong gân và các vết thương Nước sắc thân rễ Nghệdùng trong viêm tấy có mủ Nước ép tươi chữa giun sán và chống ký sinh trùngtrong nhiều bệnh ngoài da Nghệ cũng được dùng làm thuốc chống dị ứng

Ngoài ra, Nghệ còn được dùng để điều trị rối loạn kinh nguyệt, tăng tuần hoàn, làmtan cục máu đông, trị nhiễm khuẩn đường tiết niệu, đau bụng, ngực và lưng, tiêuchảy, thấp khớp, ho, lao phổi Nghệ là thuốc chống co thắt, trị viêm lợi, có tác dụngdiệt côn trùng, diệt nấm, diệt giun tròn [1]

1.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

Chiết xuất dược liệu là một quá trình kỹ thuật dùng dung môi để chiết tách mộthoặc nhiều hoạt chất có tác động sinh học (alkaloid, flavonoid, anthraquinon…) từpha rắn là các bộ phận của dược liệu có thể là thân, rễ, quả, lá, hoa… bởi pha lỏng

là dung môi nước, cồn…

1.3.1 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu:

Nguyên liệu

Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất Bề dày củavách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trong nhất Độ dày củavách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tương càng lớn thì quá trình hòa tanchiết xuất càng chậm Đường kính các kênh bào tương càng lớn, các chất qua lạivách tế bào càng dễ dàng Quá trình chiết xuất càng xảy ra nhanh Nguyên liệu càngchia nhỏ thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn Tuynhiên, càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiếtcàng có nhiều tạp chất

Chất tan

Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh.Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tếbào càng giảm

Dung môi

Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càng nhanhlàm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn Khả năng hòa tan các chất trong dungmôi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và dungmôi Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào, sự khuếch tán củachất tan và dung môi xảy ra dễ dàng, quá trình chiết xảy ra càng nhanh

Kỹ thuật chiết

Chênh lệch nồng độ càng lớn, tốc độ khuếch tán càng cao Việc tăng lượng dungmôi làm tăng sự chênh lệch nồng độ nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn Sự khuấytrộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bên ngoài các tiểu phândược liệu bằng phương pháp cơ học Sự chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tếbào tăng lên nên quá trình thẩm tích xảy ra nhanh hơn Tăng nhiệt độ làm tăng khảnăng hòa tan của chất tan vào dung môi và đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làmtăng chuyển động nhiệt của phân tử Giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khảnăng và tốc độ hòa tan, tăng quá trình khuếch tán làm cân bằng nồng độ Tăng ápsuất làm tăng tốc độ thấm dung môi vào nguyên liệu [2]

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất được minh họa ở Sơ đồ 1.1.

Sơ đồ 1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu

Dung môi

Chất phụ gia

pH

Tỷ lệ dược liệu/dung môi

Loại dung môi Nồng độ dung môi

Dược liệuXuất xứ Thời vụ - Tháng

Thời gianNhiệt độ

Áp suấtKhuấy trộn

1.3.2 NHÂN VÀ QUẢ TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

Mối liên quan giữa điều kiện chiết xuất với tính chất của sản phẩm (Sơ đồ 1.1)

được gọi là mối liên quan giữa nhân và quả, gọi tắt là liên quan nhân quả Trong đó,nhân là điều kiện sản xuất hay biến độc lập x (thông số) và quả là tính chất sảnphẩm hoặc biến phụ thuộc y

Theo con đường dò dẫm, nhà chiết xuất khó biết biến số nào ảnh hưởng tính chấtsản phẩm và quy luật nào chi phối nên có thể khảo sát cái không cần mà bỏ sót cáicần nghiên cứu

1.3.3 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM

Việc thử nghiệm thường tốn nhiều thời gian và công sức, nhà nghiên cứu cần môhình thực nghiệm để thu thập tối đa thông tin với số lượng thí nghiệm tối thiểu.Trong thực tế người ta có thể áp dụng mô hình ràng buộc hay không ràng buộc.Ngày nay, phần mềm Design Expert [4] có thể thiết kế nhanh chóng các mô hìnhthực nghiệm Một số mô hình thường dùng là D-Optimal, Taguchi OA…

1.3.4 PHÂN TÍCH LIÊN QUAN NHÂN QUẢ

Việc rút ra kết luận có ích từ dữ liệu được gọi là khai thác dữ liệu hay khám phá trithức (knowledge discovery) Một số phần mềm thông minh như FormRules [12], sửdụng công nghệ logic mờ - thần kinh, có thể khám phá phần lớn tri thức trong chiếtxuất dược liệu, trình bày thông tin dưới dạng quy luật nhân quả

1.3.5 TỐI ƯU HÓA THÔNG SỐ

Nhằm xác định thông số tối ưu cho quy trình chiết xuất, đặc biệt đối với trường hợp

dữ liệu phức tạp và không tuyến tính Phương pháp thông minh có nhiều ưu điểm sovới phương pháp truyền thống Phần mềm thông minh INForm [14], áp dụng mạngthần kinh với thuật toán di truyền, có thể ước tính các thông số tối ưu của quy trìnhchiết xuất theo mục tiêu đề ra, đồng thời dự đoán tính chất sản phẩm

Như một chiến lược nghiên cứu có hiệu quả nhất, nhà chiết xuất có thể áp dụngFormRules ở giai đoạn đầu để biết xu hướng, mức độ và quy luật liên quan Sau đó,

có thể áp dụng INForm để tìm thông số tối ưu cho quy trình hay dự đoán tính chấtsản phẩm

1.4 NỘI DUNG CỦA MỘT TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU

Yêu cầu cao nhất của một dược phẩm khi được sử dụng trên người là tính an toàn

và hiệu quả trị liệu Một dược phẩm tốt phải là một dược phẩm ít có những tác dụng

có hại, có hiệu quả trị liệu cao và ổn định đối với người sử dụng Để đánh giá vàthống nhất các tiêu chuẩn cho một thành phẩm để đưa ra thị trường, các phươngpháp thử và tiêu chuẩn chất lượng cần phải được xây dựng

Số lượng các cao dược liệu hiện đang lưu hành trên thị trường khá lớn Tuy nhiên,chỉ có 5 cao dược liệu được ban hành tiêu chuẩn trong DĐVN III (cao đặc Actiso,cao gạc Hươu, cao Hy thiêm, cao Ích mẫu và cao Lương khương) Trong các caodược liệu trên, cao đặc Actiso có nhiều tiêu chuẩn nhất (mô tả, cắn không tan, pH,mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, định tính, định lượng), các cao còn lạichỉ có một vài tiêu chuẩn Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho cao dược liệu làyêu cầu cấp bách và thường xuyên được đặt ra [2]

Dựa vào tiêu chuẩn của một số cao thuốc trong DĐVN III, tiêu chuẩn cơ sở của một

số cao thuốc của các cơ sở sản xuất, tiêu chuẩn của dược liệu, nội dung của một tiêuchuẩn cao dược liệu gồm các phần sau đây:

- Đặc điểm mô tả: mô tả đặc điểm thể chất, màu sắc, mùi, vị của cao dược liệu

- Các chỉ số vật lý: độ tan, pH, riêng đối với cao lỏng thì có thêm chỉ tiêu về khốilượng riêng, tỷ trọng, hàm lượng ethanol, độ trong và độ đồng nhất

- Định tính: các phản ứng hóa học hay phương pháp sắc ký để xác định các hoạtchất chính trong cao dược liệu

- Thử tinh khiết: mô tả các yêu cầu về độ tinh khiết của một cao dược liệu (tạp chất,

độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrochlorid, tro tan trong nước, trosulfat, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, các chất độc do ô nhiễm, giới hạn kim loạinặng, giới hạn tạp chất phóng xạ)

- Xác định hàm lượng: phương pháp xác định hoạt chất hay một nhóm hợp chấttrong dược liệu, yêu cầu về hàm lượng cần đạt của dược liệu

- Một số nội dung không có tính chất ràng buộc về tiêu chuẩn chất lượng như: bảoquản, tính vị quy kinh, công năng, chủ trị, liều dùng…

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ

2.1.1 NGUYÊN LIỆU VÀ CHẤT CHUẨN

Lá Diệp hạ châu đắng (Folium Phyllanthi amari), lô sản xuất DHC310808, đạt tiêu

chuẩn cơ sở của công ty TNHH SX & TM Hồng Đài Việt (Phụ lục 2).

Thân rễ Nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae), lô sản xuất NN010309, đạt tiêu

chuẩn cơ sở của công ty TNHH SX & TM Hồng Đài Việt (Phụ lục 3).

Cả hai dược liệu trên được cung cấp bởi Công ty TNHH Sản xuất Thương mạiHồng Đài Việt (188/117/13, Tôn Thất Thuyết, Quận 4) do Trung Tâm Nghiên Cứu

và Sản Xuất Dược Liệu Miền Trung, tỉnh Phú Yên sản xuất Dược liệu được lưumẫu tại ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, khoa Dược, Đại học Y Dược thànhphố Hồ Chí Minh

Phyllanthin chuẩn (độ tinh khiết 98,90 %) do viện Công Nghệ Hóa Học thành phố

Hồ Chí Minh cung cấp

Curcumin I chuẩn (độ tinh khiết 98,75%) do ban Nghiên cứu Khoa học, KhoaDược, Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

2.1.2 HÓA CHẤT, DUNG MÔI

Dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích dùng trong SKLM: methanol, cloroform,butanol, ethyl acetat, n-hexan…

Dung môi dùng chiết xuất cao dược liệu: ethanol đạt tiêu chuẩn cơ sở của công ty

cổ phần Dược phẩm OPC (Phụ lục 1).

Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254, cỡ hạt 0,015-0,04 mm

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu thực vật, hóa học: thuốc thử định tínhflavonoid, tanin, alkaloid …

Dung môi dùng cho HPLC: aetonitril (Merck), methanol (Merck), acid acetic(Merck), nước cất 2 lần.

2.1.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

Cân phân tích Libror AEX – 120G và cân Libror AEL – 40SM (Nhật)

Máy soi UV 2 bước sóng 254 nm và 365 nm VilBer Lourinat (Pháp)

Tủ sấy Gallenkamp (Anh), tủ nung Carbolite Funaces (Anh)

Bể siêu âm Sonorex RK510H (Pháp), máy cô quay Buchi R200 (Thụy sĩ)

Bộ dụng cụ đun hồi lưu dùng để chiết xuất (Hình 2.1.a), máy sấy phun sương Labplant (Hình 2.1.b), máy HPLC hiệu Waters 2695 (Mỹ) (Hình 2.1.c).

Bộ dụng cụ xác định lượng nước bằng phương pháp cất với dung môi

Hình 2.1 Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị đun hồi

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU

Lá Diệp hạ châu đắng được qua rây để có kích thước dược liệu khoảng 1-6 mm.Thân rễ Nghệ được xay thô và qua rây để có kích thước khoảng 2-6 mm

2.2.2 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

Dược liệu Diệp hạ châu đắng không có chuyên luận trong DĐVN III nên sẽ đượckiểm nghiệm theo tiêu chuẩn cơ sở và tiêu chuẩn hóa với các chỉ tiêu: mô tả, soibột, định tính, độ ẩm, độ tro

Dược liệu Nghệ được kiểm nghiệm theo chuyên luận về Nghệ trong DĐVN III(trang 423 – 424) với các chỉ tiêu: mô tả, soi bột, định tính, độ ẩm, tro toàn phần,định lượng tinh dầu, định lượng các chất chiết được trong dược liệu

2.2.3 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

Kích thước bột dược liệu Diệp hạ châu đắng trong khoảng 1–6 mm

Thời gian của 1 lần chiết: 120 phút

Nhiệt độ chiết: 70oC

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao Diệp hạ châu đắng

- Đun cách thủy hồi lưu với dung môi cồn

- LọcDiệp hạ châu

Dịch chiết

Cao Diệp hạ châu đắng

- Sấy phun bằng máy Labplant

2.2.4 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CẮN CLOROFORM TỪ CAO

DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN

Cân khoảng 1g cao Diệp hạ châu đắng và chiết theo quy trình sau để thu được cắncloroform và định lượng bằng phương pháp HPLC

Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết xuất cắn cloroform từ cao Diệp hạ châu đắng

2.2.5 PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG

CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

2.2.5.1 Pha dung dịch thử nghiệm và dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 2 mg phyllanthin chuẩn cho vào bình định

mức 5 ml, hòa tan trong dung môi pha động, siêu âm và điền dung môi vừa đủ đếnvạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng0,4 mg/ml

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 1 g cao Diệp hạ châu đắng, cho vào bình nón,

siêu âm với 30 ml CHCl3 trong 5 phút Tiếp tục thêm 2 lần nữa Gộp tất cả dịchchiết thu được, cô đến cắn Cân khoảng 3,5 mg cắn cho vào bình định mức 5 ml,

Cao Diệp hạ châu đắng

hòa tan bằng dung môi pha động, siêu âm và bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều,lọc qua màng lọc 0,45 µm

2.2.5.2 Điều kiện HPLC định lượng phyllanthin

2.2.6 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO NGHỆ

Kích thước dược liệu Nghệ trong khoảng 2 – 6 mm

Thời gian của 1 lần chiết: 120 phút

Nhiệt độ chiết: 70oC

Sơ đồ 3.3 Quy trình chiết xuất cao Nghệ

- Đun cách thủy hồi lưu với dung môi cồn

- LọcNghệ

Dịch chiết

Cao Nghệ

- Cô dưới áp suất giảm

2.2.7 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CẮN ETHYL ACETAT TỪ CAO NGHỆ

ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN I

Cân khoảng 1g cao Nghệ và chiết theo quy trình sau để thu được cắn ethyl acetat vàđịnh lượng bằng phương pháp HPLC

Sơ đồ 3.4 Quy trình chiết xuất cắn ethyl acetat từ cao Nghệ

2.2.8 PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN I TRONG CAO NGHỆ

2.2.8.1 Pha dung dịch thử nghiệm và dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 2 mg curcumin I chuẩn cho vào bình định

mức 10 ml, hòa tan trong dung môi pha động, siêu âm và điền dung môi pha độngvừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch chuẩn đối chiếu cónồng độ khoảng 0,2 mg/ml

- Lắc với 30 ml nước cất x 3 lần

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 1,50 mg cắn ethyl acetat Hòa tan cắn trong

dung môi pha động, siêu âm và điền dung môi pha động vừa đủ 10 ml, lắc đều, lọcqua màng lọc 0,45 µm

2.2.8.2 Điều kiện HPLC định lượng curcumin I

Bảng 2.1 Chương trình gradient dung môi HPLC định lượng curcumin I

Thời gian (phút) Acetonitril (ml) Dung dịch acid acetic 0,05% (ml)

08101524

5060706050

5040304050

2.2.9 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Khảo sát tính tương thích hệ thống

Bơm 6 lần dung dịch thử Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh, hiệulực cột, độ phân giải, hệ số bất đối xứng

- Xử lý thống kê các giá trị sau:

Tính thích hợp của phương trình = f(x) được đánh giá bằng trắc nghiệm F

Ý nghĩa của các hệ số B và Bo được kiểm tra đánh giá bằng trắc nghiệm t

Khảo sát độ đúng

Thêm lượng chất chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% hàm lượng chất cần địnhlượng (phyllanthin, curcumin I) có trong mẫu thử Bơm vào hệ thống HPLC và ghinhận diện tích đỉnh ở bước sóng phù hợp Xác định tỷ lệ phục hồi trung bình

Khảo sát độ lặp lại

Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình chiết và định lượng trên cùng một mẫu cao và ghinhận kết quả Tiến hành xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

2.2.10 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT TỐI ƯU VỚI

SỰ TRỢ GIÚP CỦA PHẦN MỀM THÔNG MINH

(Áp dụng cho cả hai quy trình chiết xuất cao Nghệ và cao Diệp hạ châu đắng)

2.2.10.1 Mô hình thực nghiệm

Mô hình thực nghiệm được thiết kế bởi phần mềm Design-Expert gồm 14 quy trìnhchiết xuất

y2= hiệu suất chiết cao từ dược liệu (%)

y3= độ ẩm của cao (%)

2.2.10.2 Quy trình chiết xuất

Thông số độ cồn, tỷ lệ dược liệu: dung môi, số lần chiết thay đổi theo thiết kế,những thông số khác của quy trình được giữ cố định

2.2.11.2 Cắn không tan trong nước

Tiến hành: cân khoảng 1 g cao, hòa trong 50 ml nước cất trong cốc có mỏ Lọc qua

giấy lọc đã cân bì trước, sấy khô ở 100oC, để nguội 1 giờ trong bình hút ẩm Cân,tính phần trăm cắn không tan trong nước so với khối lượng cao

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.6, trang PL-129, phương pháp 2

2.2.11.5 Tro không tan trong acid hydrochlorid

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.5, trang PL-128

2.2.11.6 Tro sulfat

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.7, trang PL-129, phương pháp 1

2.2.11.7 Tro tan trong nước

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.8, trang PL-129

2.2.11.8 Giới hạn nhiễm khuẩn

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 10.7, trang PL 182-188

2.2.11.11 Định tính cao Diệp hạ châu đắng

Phản ứng alkaloid

Lấy khoảng 1,5 g cao Diệp hạ châu đắng, thêm 20 ml ethanol 96%, lắc đều, gạn lấydịch ethanol cô cách thủy đến cắn Hòa cắn trong 5 ml dung dịch HCl 5%, chiadung dịch vào 3 ống nghiệm nhỏ Tiếp theo, làm phản ứng định tính chung vớithuốc thử alkaloid

Phản ứng tanin

Hòa 1 g cao Diệp hạ châu đắng trong cồn 70% Lọc, bốc hơi dịch lọc trên bếp cáchthủy cho tới cắn Hòa tan lại cắn trong nước nóng, để nguội và lọc lấy dịch lọc làmphản ứng định tính Lấy 2 ml dịch lọc, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin-muối,khuấy đều hỗn hợp, so sánh với ống chứng chỉ chứa dịch lọc Nếu có tủa bôngtrắng, có tanin

SKLM

Bản mỏng: silica gel 60 F254 (Merck)

Dung môi triển khai: n-hexan - ethyl acetat (2 : 1)

Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm

Thuốc thử dung dịch H2SO4 10% trong methanol

Dung dịch chuẩn: Hòa tan phyllanthin chuẩn trong methanol

Dung dịch thử: Chiết cao Diệp hạ châu đắng với CHCl3, làm đậm đặc

dịch chiết và chấm sắc ký

2.2.11.12 Định tính cao Nghệ

SKLM

Bản mỏng: silica gel F254 ( Merck)

Dung môi triển khai: cloroform - acid acetic (9:1)

Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 365 nm

Thuốc thử: 15 ml dung dịch acid boric 3% (TT) trộn với

5 ml dung dịch acid oxalic 10% (TT)Dung dịch đối chiếu: curcumin I chuẩn hòa tan trong ethanol

Dung dịch thử: Chiết cao Nghệ với ethanol và làm đậm đặc dịch chiết

2.2.11.13 Định lượng

Chuẩn bị mẫu thử như mục 2.2.5.1 và 2.2.8.1 Tiến hành HPLC xác định diện tích

đỉnh phyllanthin, curcumin I Từ đó, xác định hàm lượng phyllanthin và curcumin Itrong cao Diệp hạ châu đắng và cao Nghệ

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

Mảnh vỏ quả Tinh thể calci oxalat

Mạch xoắn Mạch mạng

Tanin

Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml nước, đun sôi, lọc Lấy 2-3 ml dịch lọc đểnguội, thêm 1-2 giọt dung dịch gelatin 2%, xuất hiện vẩn đục