Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao đan sâm

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge., Lamiaceae) là dược liệu được dùng để chữa một số bệnh như cao huyết áp, rối loạn nhịp tim, đau thắt ngực, rối loạn kinh nguyệt…Hiện nay nhu cầu trong nước và thế giới về cao Đan sâm là rất lớn. Một số công ty dược phẩm trong nước hiện đã sản xuất cao Đan sâm. Tuy nhiên, việc chiết xuất các cao này vẫn chưa đáp ứng yêu cầu sản xuất tại các nhà máy đạt GMP vì quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa nên hiệu suất chiết chưa cao, chất lượng cao Đan sâm còn thấp, không ổn định. Do đó, tác dụng điều trị không đảm bảo vì chứa ít hoặc không có các hoạt chất. Chiết xuất dược liệu là một quá trình dùng dung môi để chiết tách một hoặc nhiều hoạt chất có tác động sinh học từ pha rắn là các bộ phận của dược liệu có thể là thân, rễ, quả, lá, hoa… Mối liên quan giữa các điểu kiện chiết xuất (dược liệu, dung môi và kỹ thuật) với kết quả chiết xuất (hiệu suất, tỷ lệ hoạt chất, tỷ lệ tạp chất…) được gọi là mối liên quan giữa nhân và quả. Bằng con đường dò dẫm theo kinh nghiệm, nhà chiết xuất khó lòng xác định các mối liên quan ấy một cách định lượng nên có thể khảo sát yếu tố thứ yếu mà bỏ qua yếu tố trọng yếu, tốn thì giờ mà không tìm ra các thông số phù hợp. Ngày nay, việc xây dựng một quy trình chiết xuất dược liệu có thể được thực hiện một cách khoa học bằng cách kết hợp phương pháp thực nghiệm truyền thống với sự hỗ trợ của bộ ba phần mềm gồm: a). Phần mềm thống kê: thiết kế mô hình thí nghiệm để định hướng cho thực nghiệm chiết xuất. b). Phần mềm thông minh sử dụng công nghệ thần kinhlogic mờ có thể phân tích: xu hướng, mức độ và quy luật liên quan giữa điểu kiện chiết xuất và kết quả chiết xuất. c). Phần mềm thông minh kết hợp mạng thần kinh nhân tạo với hệ diễn tả gen có thể xác lập mô hình liên quan giữa nhân và quả và trên cơ sở đó tối ưu hóa điểu kiện chiết xuất sao cho kết quả chiết xuất như mong muốn. Do đó, đề tài “Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Đan sâm” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu như sau: a. Kiểm kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm và thẩm định phương pháp định lượng tanshinon IIA. b. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trên hiệu suất, hàm lượng tanshinon IIA và tạp chất trong quy trình chiết xuất cao Đan sâm. c. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Đan sâm sao cho hiệu suất cao nhất, hàm lượng tanshinon IIA cao nhất và tạp chất tối thiểu.

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge., Lamiaceae) là dược liệu được dùng để

chữa một số bệnh như cao huyết áp, rối loạn nhịp tim, đau thắt ngực, rối loạnkinh nguyệt…Hiện nay nhu cầu trong nước và thế giới về cao Đan sâm là rấtlớn Một số công ty dược phẩm trong nước hiện đã sản xuất cao Đan sâm.Tuy nhiên, việc chiết xuất các cao này vẫn chưa đáp ứng yêu cầu sản xuất tạicác nhà máy đạt GMP vì quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa nên hiệusuất chiết chưa cao, chất lượng cao Đan sâm còn thấp, không ổn định Do đó,tác dụng điều trị không đảm bảo vì chứa ít hoặc không có các hoạt chất

Chiết xuất dược liệu là một quá trình dùng dung môi để chiết tách một hoặcnhiều hoạt chất có tác động sinh học từ pha rắn là các bộ phận của dược liệu

có thể là thân, rễ, quả, lá, hoa… Mối liên quan giữa các điểu kiện chiết xuất(dược liệu, dung môi và kỹ thuật) với kết quả chiết xuất (hiệu suất, tỷ lệ hoạtchất, tỷ lệ tạp chất…) được gọi là mối liên quan giữa nhân và quả Bằng conđường dò dẫm theo kinh nghiệm, nhà chiết xuất khó lòng xác định các mốiliên quan ấy một cách định lượng nên có thể khảo sát yếu tố thứ yếu mà boqua yếu tố trọng yếu, tốn thì giờ mà không tìm ra các thông số phù hợp

Ngày nay, việc xây dựng một quy trình chiết xuất dược liệu có thể được thựchiện một cách khoa học bằng cách kết hợp phương pháp thực nghiệm truyền

thống với sự hỗ trợ của bộ ba phần mềm gồm: a) Phần mềm thống kê: thiết

kế mô hình thí nghiệm để định hướng cho thực nghiệm chiết xuất b) Phần

mềm thông minh sử dụng công nghệ thần kinh-logic mờ có thể phân tích: xu

hướng, mức độ và quy luật liên quan giữa điểu kiện chiết xuất và kết quảchiết xuất c) Phần mềm thông minh kết hợp mạng thần kinh nhân tạo với hệdiễn tả gen có thể xác lập mô hình liên quan giữa nhân và quả và trên cơ sở

đó tối ưu hóa điểu kiện chiết xuất sao cho kết quả chiết xuất như mong muốn

Do đó, đề tài “Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Đan sâm” đượcthực hiện với các mục tiêu nghiên cứu như sau:

a Kiểm kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm và thẩm định phương pháp định lượng tanshinon IIA.

b Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trên hiệu suất, hàm lượng tanshinon IIA

và tạp chất trong quy trình chiết xuất cao Đan sâm.

c Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Đan sâm sao cho hiệu suất cao nhất, hàm lượng tanshinon IIA cao nhất và tạp chất tối thiểu

2 TỔNG QUAN

2.1 Dược liệu Đan sâm

2.1.1 Thực vật học

Tên khoa học và phổ thông

Tên khoa học: Salvia miltiorrhiza Bunge., Lamiaceae ( Họ hoa môi).

Tên Việt Nam : Đan sâm, Huyết sâm, Xích sâm, Huyết căn,…

Tên nước ngoài: Dan shen, Chi shen, Zi Dan shen

Mô tả thực vật

Đan sâm là một loại cây thảo, sống lâu năm, cao 30-80cm, toàn thân manglông ngắn màu vàng nhạt Rễ mảnh có đường kính 0,5-1,5cm, phân nhánhnhiều, màu đo nâu Thân vuông trên có các gân dọc Lá kép lông chim, mọcđối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có đến 7, hình trứng hoặc trái xoan Lá chétgiữa thường lớn hơn cả Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa Láchét dài 2-7,5cm, rộng 0,8-5cm Mép lá chét có răng cưa tù Mặt trên lá chétmàu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lôngnhưng dài hơn Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá chét thành múi nho Cụmhoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu ngọn thành bông gồm nhiều vòng sít nhau ở ngọn,mỗi vòng có 3-10 hoa màu lơ tím nhạt; đài chia 2 môi, môi trên dài hơn ống

tràng và cong hình lưỡi liềm, môi dưới chia 2; nhị 3 Quả bế nho, đầu tù, dài

3 mm Mùa hoa: tháng 5-8; mùa quả : tháng 6-9 [3,4]

Sơ đồ 2.1 Phân loại thực vật Đan sâm

2.1.2 Phân bố và bộ phận dùng

Phân bố

Salvia L là một chi lớn trong họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới

ấm và cận nhiệt đới, chỉ có ít loài ở vùng nhiệt đới Ở Việt Nam có 4-5 loài,trong đó Đan sâm là cây nhập nội Cây Đan sâm trồng ở nước ta có xuất xứ từTrung Quốc Cây trồng ở trại thuốc Sa Pa (Viện Dược liệu) to ra thích nghivới điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tươngđối tốt; ra hoa quả hàng năm; hạt giống thu được đã gieo đi gieo lại nhiềunăm Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởngkém hơn Đam sâm chưa được đưa vào sản xuất Những cây còn lại ở Sa Pachỉ có ý nghĩa để giữ giống [2,3,4,12]

2.1.3 Thành phần hóa học

Cho đến nay, hơn 70 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Đan

sâm Salvia miltiorrhiza Bunge với các hàm lượng rất khác nhau Các thành

phần chính trong Đan sâm có thể được phân thành 2 nhóm hợp chất: phân cựcnhư các acid salvianolic và kém phân cực như các tanshinon [25,26]

Hình 2.2 Hoa và rễ Đan sâm

Nhóm Tanshinon

Nhóm tanshinon trong Đan sâm là các diterpenoid kiểu abietanoid có màu

Khoảng 50 hợp chất tanshinon đã được phân lập từ rễ của loài Salvia miltiorrhiza [28]

Nhóm polyphenol

Cho đến nay, khoảng 30 hợp chất polyphenol phân cực đã được phân lập từĐan sâm Hầu hết là các tổ hợp từ các monomer acid caffeic, isoferulic hay

acid protocatechuic [14]

Một số chất đã gặp nhiều ở các loài khác (acid caffeic, acid isoferulic, acidrosmarinic, methyl rosmarinat, acid protocatechuic, protocatechualdehyd),

nhưng cũng có 1 số hợp chất tương đối chuyên biệt đối với chi Salvia (acid

salvianic, các acid salvianolic A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, acid lithospermic,ethyl lithospermat, ethyl lithospermat B, acid prolithospermic, danshensu,salviaflasid, salvinal ) Dẫn xuất của chúng được chia thành 4 nhóm chínhdựa trên số đơn phân acid caffeic [14]

− Acid caffeic monomer: nhóm này bao gồm acid isoferulic, acid caffeic,

danshensu và 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-lactamid

− Acid caffeic dimer: gồm acid rosmarinic, methyl rosmarinate, acid

salvianic C, acid salvianolic D, acid salvianolic F, acid prolithospermic,acid salvianolic G

− Acid caffeic trimer: gồm acid salvianolic A, acid lithospermic, methyl

lithospermat, dimethyl lithospermat, acid salvianolic C, acid salvianolic J,acid salvianolic I

− Acid caffeic tetramer: nhóm này cũng có thể coi như là dẫn chất dimer của

acid rosmarinic, gồm acid salvianolic E, acid salvianolic B, ethyllithospermat, magie lithospermat B và kali-amoni lithospermat B

Các nhóm hợp chất khác

Ngoài các nhóm hợp chất chính có tác dụng sinh học, trong Đan sâm cònchứa nhiều hợp chất cao phân tử như các polysaccharid (tinh bột, đường ),lignan, các polypeptid, protein Các hợp chất này dễ tan trong nước và sẽđược lôi kéo theo trong quá trình chiết xuất cao nên được gọi là các chất

không mong muốn cần hạn chế trong quá trình chiết xuất [25]

Bảng 2.1 Các hợp chất phân lập từ Salvia miltiorrhiza Bunge

Acid salvianic A,B,C Tanshinon I,IIA,IIB,V, VI Acid salvianolic A,B,C,D,E,G Cryptotanshinon

Monomethyl lithospermat Hydroxytanshinon IIA Dimethyl lithospermat Methyl tanshinonat

Acid lithospermic B Dihydroisotanshinon I Protocatechualdehyd Neocryptotanshinon

Cryptoacetalid Miltiodiol Miltipolon Tanshinlacton Formyltanshinenon Danshen-spiroketallacton Miltipolon

Nor-salvioxid

O O

O

O O

O

O O

O

O O

O

O

O O

O

O

O O

O

O O

O

O O OH

tanshinon IIA dihydro-tanshinon IIA 1-hydroxy-tanshinon IIA

O

O O

OH

O

O O

OH

O

O O

CH2OH

tanshinon IIB dihydro-tanshinon IIB tanshinon A

Hình 2.3 Công thức hóa học một số chất thuộc nhóm tanshinon.

O O

OH OH

O H O H

O H

O

O O

OH

O

HO HO

HO HO

OH OH

O COOH

Tanshinon IIA phân lập từ Đan sâm được chứng minh có độc tính trên tế bàoung thư ở người, là chất có tiềm năng trong điều trị ung thư máu Cơ chế đượccho là tanshinon IIA có vai trò trong ức chế con đường tăng sinh của tế bào.Thêm vào đó, tanshinon IIA cũng gây ra sự chết hàng loạt của tế bào ung thưgan Hep G2 [26]

Hoạt tính chống oxy hóa

Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol trong Đan sâm dựa trên 3 cơ chế làngăn chặn phản ứng peroxy hóa lipid, loại bo gốc tự do và chống oxy hóalipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) Kết quả so sánh về tác dụng chống oxy hóa

giữa 3 loài Salvia miltiorrhiza, S verticillata và S przewalskii cho thấy dịch chiết rễ của S miltiorrhiza có tác dụng chống oxy hóa cao nhất Acid

salvianolic B có hiệu quả trên điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh có liênquan đến stress oxy hóa (oxidative stress) Nó có tác dụng đảo ngược chutrình chết tế bào gây bởi 6-hydroxydopamin trên tế bào khối u SH-SY5Y Xử

lý trước tế bào SH-SY5Y với salvianolic B làm giảm đáng kể lượng hydroxydopamin gây ra các phản ứng oxy hóa và ngăn ngừa tăng calci nộibào Acid salvianolic B còn có tác dụng bảo vệ não khoi tổn thương do thiếu máucục bộ ở chuột, bằng cách giảm lipid peroxid, loại bo gốc tự do và cải thiệnchuyển hóa năng lượng [17] Tác dụng chống oxy hóa của acid salvianolic B

6-mở ra một con đường cho việc điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh nhưParkinson [22]

Tác dụng trên bệnh thiếu máu cục bộ và nhồi máu cơ tim

Dịch chiết rễ Đan sâm được chứng minh là có tác dụng cải thiện rối loạn tuầnhoàn máu, bảo vệ những cơ quan khoi tổn thương do biến chứng của thiếu

máu cục bộ và nhồi máu cơ tim Tác dụng cải thiện rối loạn tuần hoàn máucủa Đan sâm được giải thích bằng nhiều cơ chế khác nhau như loại bo cácperoxid, ức chế kết tập tiểu cầu, bạch cầu, ngăn sự bám dính bạch cầu, tiểucầu lên tế bào nội mô mạch máu, giảm lượng tế bào mast, giảm phóng thíchchất trung gian hóa học gây viêm [26,28]

Thành phần không phân cực và thành phần phân cực trong Đan sâm đều cótác dụng bảo vệ tim, não, gan, thận, phổi khoi bị tổn thương 3,4-dihydroxyphenyl lactic acid, acid salvianolic B, acid lithospermic B, tanshinonIIA bảo vệ tim khoi suy Acid salvianolic A, acid salvianolic B, tanshinon IIA,tanshinon IIB bảo vệ não Các chất phân cực trong rễ Đan sâm cải thiện tìnhtrạng tổn thương của gan và phổi Acid lithospermic B, magie lithospermat Bbảo vệ thận Khi bị thiếu máu cục bộ, do suy giảm ATP, các chất dẫn truyềnthần kinh như norepinephrin tăng lên gây tổn hại cho não bằng cách oxy hóa

để sản xuất các gốc oxy hoặc các cơ chế khác Đan sâm được chứng minh là

có thể giảm việc giải phóng của norepinephrin, dopamin và serotonin trongnão thiếu máu cục bộ do tác dụng ức chế men chuyển [2,3,14,26]

Tác dụng hạ huyết áp

Đan sâm được chứng minh là có tác dụng ức chế men chuyển (tác dụng lênangiotensin II) gây hạ huyết áp, giãn động mạch và giảm đông máu Mộtnghiên cứu khác đã xác định tác dụng hạ huyết áp của Đan sâm có thể là dogiãn động mạch vành Uống magie lithospermat B có tác dụng hạ huyết áptâm trương và tâm thu trên chuột Tác dụng này là do magiesium tanshinoat Bkích thích giải phóng oxid nitric (NO) và các chất chuyển hóa của nó, oxidnitric là một chất giãn mạch mạnh và đóng vai trò trong việc điều hòa trương

lực thành mạch Acid prolithospermic cũng có thể gây ra sự giãn mạch độngmạch chủ chậm nhưng kéo dài trên chuột [2,26].

Tác dụng chống kết tập tiểu cầu

Tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu được giải thích là do tác dụng ức chế menchuyển và tác dụng lên receptor α2β1 Acid salvianolic B có tác dụng chốngkết tập tiểu cầu do tác dụng lên receptor α2β1 Tác dụng trên receptor α2β1 củaacid salvianolic B có đặc điểm là chỉ tác dụng lên collagen chứ không tácdụng lên fibrinogen Acid acetylsalvianolic A là một dẫn xuất bán tổng hợp từcác acid salvianolic cũng có tác dụng chống kết tập tiểu cầu Acid rosmarinic

và các acid salvianolic có tác dụng ức chế thomboxan B2, ngăn sự kết tập lạicủa các tiểu cầu [2,26]

Tác dụng khác

Acid rosmarinic, lithospermic và dẫn xuất methyl ester của những chất này ứcchế adenylat cyclase trong cả não và hồng cầu chuột Acid salvianolic Achống loét do ức chế hoạt động của bơm H+, K+-ATPase Acid salvianolic B

có thể ức chế mảng ngoại bào β-protein amyloid hình thành, đây là một trongnhững nguyên nhân gây bệnh Alzheimer Các dẫn xuất magie và kali amonicủa acid salvianolic B tác động có lợi trong triệu chứng urê huyết do giảm urêhuyết, creatin, methylguanidin và acid succinic guanidin ở chuột suy thậnmãn tính Acid salvianolic A, B cũng được chứng minh là chất ức chế 5-lipoxygenase và aldose reductase tham gia vào phản ứng dị ứng và chuyểnhóa các galactose Dịch chiết Đan sâm không có tác dụng giống như insulin ởliều thử nghiệm 10 µg/ml, nhưng nó lại có tác dụng cảm ứng enzym ở liều

trên 1µg/ml Đan sâm còn được sử dụng để trị sốt xuất huyết, ho gà, mất ngủ,viêm mũi dị ứng, glaucom [14]

2.1.5 Công dụng và cách dùng

Ðan sâm là một vị thuốc còn dùng trong phạm vi nhân dân để làm thuốc bổcho phụ nữ, phụ nữ chưa chồng da vàng, ăn uống thất thường, chữa tử cungxuất huyết, kinh nguyệt không đều, đau bụng, các khớp xương sưng đau Còndùng để chế thuốc xoa bóp Liều dùng 6-12 g dưới dạng thuốc sắc [3]

2.1.6 Đơn thuốc và chế phẩm có chứa Đan sâm

Đơn thuốc chứa Đan sâm

Chữa phụ nữ kinh nguyệt không đều, hoặc sớm hoặc muộn, nhiều hay ít, thaikhông yên, sinh xong máu hôi ra chưa hết, đau khớp xương (Bản thảo cươngmục): Ðan sâm rửa sạch, thái phơi khô, tán nho Ngày uống 8 g, chia làm 2hay 3 lần uống [3]

Chữa kinh nguyệt không ra, đau đớn (Diệp Quyết Tuyền): Ðan sâm 10 g,Hương phụ 6 g, Đương quy 10 g, Bạch thược 5 g, Xuyên khung 5 g, Địahoàng 10 g, Nước 600 ml Sắc còn 200 ml, chia làm 3 lần uống trong ngày[8]

Chế phẩm chứa Đan sâm trên thị trường

Đan sâm tam thất (Domesco)

Thiên sứ hộ tâm đan (Công ty dược phẩm Á Âu)

Ích thận vương (Công ty dược phẩm Á Âu)

Phụ lạc cao (Công ty dược phẩm Á Âu)

Hình 2.5 Các chế phẩm Đan sâm trên thị trường

2.2 Chiết xuất dược liệu

Chiết xuất dược liệu là một quá trình kỹ thuật dùng dung môi (nước, cồn…)

để chiết tách một hoặc nhiều hoạt chất có tác động sinh học (alkaloid,

Đan sâm - Tam thất (Công ty cổ phần dược phẩm Domesco)

Thiên sứ hộ tâm đan

(Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu) (Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu)Phụ lạc cao

flavonoid, anthraquinon…) từ pha rắn là các bộ phận của dược liệu (thân, rễ,quả, lá, hoa…) [10]

2.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu

Nguyên liệu

Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất Bềdày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọngnhất Độ dày của vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tương càng lớn

thì quá trình hòa tan chiết xuất càng chậm Đường kính các kênh bào tương

càng lớn, các chất qua lại vách tế bào càng dễ dàng Quá trình chiết xuất càngxảy ra nhanh Nguyên liệu càng chia nho thời gian thẩm thấu qua vách giảmlàm cho quá trình chiết nhanh hơn Tuy nhiên, càng chia nho nguyên liệu, tínhchọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết càng có nhiều tạp chất [10,11]

Chất tan

Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càngnhanh Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năngqua vách tế bào càng giảm [10,11]

Dung môi

Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càngnhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn Khả năng hòa tan các chất

trong dung môi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất củachất tan và dung môi Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tếbào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra dễ dàng, quá trình chiếtxảy ra càng nhanh [10,11]

Kỹ thuật chiết

Chênh lệch nồng độ càng lớn, tốc độ khuếch tán càng cao Việc tăng lượngdung môi làm tăng sự chênh lệch nồng độ nên quá trình chiết xảy ra nhanhhơn Sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bênngoài các tiểu phân dược liệu bằng phương pháp cơ học Sự chênh lệch nồng

độ giữa trong và ngoài tế bào tăng lên nên quá trình thẩm tích xảy ra nhanhhơn Tăng nhiệt độ làm tăng khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi vàđẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử.Giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hòa tan, tăng quátrình khuếch tán làm cân bằng nồng độ Sự tăng áp suất làm tăng tốc độ thấmdung môi vào nguyên liệu [11] Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

được minh họa ở Sơ đồ 2.2.

2.2.2 Các phương pháp chiết xuất

Tùy mục đích sử dụng dịch chiết, căn cứ vào khả năng hòa tan của những chấttrong dược liệu vào dung môi và bản chất dược liệu mà tiến hành chiết xuấttheo một hoặc kết hợp các phương pháp sau: [11]

Phương pháp ngấm kiệt

Phương pháp chiết xuất lấy kiệt hoạt chất trong dược liệu bằng cách cho dungmôi thấm qua lớp dược liệu đã xay nho với kích thước thích hợp

Sơ đồ 2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu.

Tỷ lệ dược liệu/dung môi

Loại dung môi

Áp suất Khuấy trộn

thực hiện trong bình chiết gọi là bình ngấm kiệt: hình dạng, cấu tạo và kíchthước của bình có thể thay đổi tùy theo mục đích sử dụng nhưng thường phầnthân chính của bình có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưulượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu.

Ngấm kiệt cải tiến

Ngấm kiệt ngược dòng: thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết kết hợpnhiều bình nối tiếp nhau, hệ thống được bố trí sao cho dịch chiết loãng củabình chiết trước sẽ là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ramột lượng dịch chiết đậm đặc nhất định

Phương pháp ngâm

− Ngâm lạnh: dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng.

− Ngâm nóng: bao gồm sắc, hầm, hãm hay nấu cao trong y học cổ truyền.

Đây là phương pháp chiết ở nhiệt độ sôi với dung môi là nước

Với các dung môi khác, dụng cụ chiết cần có bộ phận ngưng tụ dung môi nêngọi là phương pháp chiết hồi lưu

Ngoài ra, còn chiết ở điều kiện chân không, chiết ở áp suất nén, chiết dưới tácdụng (siêu âm, chất diện hoạt), chiết bằng CO2 long

2.3. Áp dụng bộ ba phần mềm nghiên cứu-phát triển

Mối liên quan nhân quả

Mối liên quan giữa nhân và quả có tính biện chứng và có tính phổ biến Trongngành Dược, mối liên quan nhân quả có thể được vận dụng trong thành lậpcông thức chế phẩm hay xây dựng quy trình (sản xuất dược phẩm, chiết xuấtdược liệu ) Trong chiết xuất dược liệu, nhân (các biến độc lập) là điều kiệnchiết xuất (dược liệu, dung môi và kỹ thuật); quả (những biến phụ thuộc) làkết quả chiết xuất (hiệu suất, tỷ lệ hoạt chất, tỷ lệ tạp chất…).

Mô hình thí nghiệm

Trong ngành Dược hay gặp 2 loại mô hình thí nghiệm sau đây:

− Mô hình công thức (formulation designs), còn được gọi là mô hình hỗnhợp (mixture designs): hay được dùng trong bào chế hay hóa học

− Mô hình quy trình (process designs), còn được gọi là mô hình yếu tố(factorial designs): hay được dùng cho quy trình sản xuất dược phẩm, quytrình chiết xuất dược liệu

Mô hình yếu tố đầy đủ (full factorial design) có ưu điểm là cho phép khảo sátảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác của chúng Tuy nhiên mô hìnhyếu tố đầy đủ đòi hoi phải có một số lượng thí nghiệm rất lớn khi số yếu tốtăng lên Mô hình yếu tố giản lược (fractional factorial design) cho phép giảmbớt rất nhiều số thí nghiệm mà vẫn khảo sát được một số sự ảnh hưởng củacác yếu tố Thí dụ: D-Optimal, Taguchi OA Khi thiết kế mô hình thínghiệm, nhà phân tích nên chọn các biến độc lập và biến phụ thuộc đã đượcthăm dò là có mối liên quan nhân quả Mô hình thực nghiệm có thể được thiết

kế bởi phần mềm thống kê, thí dụ: FormData [19]

Phân tích liên quan nhân quả

Mối liên quan là sự tương ứng (correspondence) giữa hai biến số x và y.Trường hợp đơn giản trong toán thống kê gọi là tương quan (correlation),Trường hợp phức tạp gọi là mối liên quan nhân-quả (cause-effectrelationship) Ngày nay, trong phân tích dữ liệu có một lãnh vực mới, đó làkhám phá tri thức (knowledge discovery) hay khai thác dữ liệu (data mining).Công nghệ thông minh có tên là logic mờ - thần kinh (neurofuzzy logic), thídụ: phần mềm thông minh FormRules [20], có thế mạnh về lãnh vực này Từ

dữ liệu thực nghiệm theo mô hình thiết kế, mối liên quan nhân quả có thểđược phân tích qua các mặt: xu hướng, mức độ và quy luật liên quan

Tối ưu hóa nhiều biến phụ thuộc

Tối ưu hóa là sự ước tính các biến độc lập (x1, x2 ) sao cho biến phụ thuộc(y1, y2 ) được tối đa hoặc tối thiểu Trong thành lập công thức chế phẩm, chiếtxuất dược liệu, sắc ký long hiệu năng cao nhiều khi phải có sự dung hòa đểcho nhiều giá trị y1, y2 đạt được tối ưu (optimal) thay vì một biến (y) tốithiểu (minimum) hoặc tối đa (maximum) Đây là khái niệm tối ưu hóa nhiềubiến phụ thuộc hay đa đáp ứng (multi-response optimization) Sự tối ưu hóanhiều biến phụ thuộc là hiện thực trong ngành Dược, không phù hợp với cácphương pháp thống kê truyền thống, chỉ được thực hiện bởi các phần mềmthông minh, thí dụ: INForm [23] Phần mềm thông minh INForm kết hợp 2công nghệ thông minh chính: mạng thần kinh (neural networks) – để xác lậpcác mô hình liên quan nhân quả có tính tương thích – và hệ diễn tả gen (geneexpression programming) – để tối ưu hóa các thông số dựa trên cơ sở là các

mô hình liên quan nhân quả So với phương pháp thống kê, phương pháp tối

ưu hóa thông minh có nhiều ưu điểm [6]:

− Không giới hạn về số biến x1, x2, , xk: đáp ứng yêu cầu thiết kế với nhiềubiến về công thức và điều kiện pha chế.

− Có thể tối ưu đồng thời nhiều biến y1, y2, , yk: phù hợp với thực tế mỗisản phẩm thường có rất nhiều tính chất

− Không phụ thuộc mô hình toán học mà dựa vào khả năng luyện mạng với

sự lựa chọn nhiều thông số phù hợp

− Dự đoán chính xác quả (yi) từ nhân (xi) biết trước dựa trên mô hình liênquan nhân quả đã được thiết lập

− Phù hợp với nhiều loại dữ liệu phức tạp, không dùng số (định tính) haythiếu trị số (dùng -99999 thay vì số 0)

− Áp dụng một cách dễ dàng nhờ các hàm tối ưu hóa trực quan (Tent, Up,Down, Flat hay Flat-Tent)

Tình hình áp dụng thực tế

Ngày nay, người ta có xu hướng áp dụng bộ 3 phần mềm trong nghiên cứuphát triển quy trình Thí dụ: phần mềm thống kê FormData: thiết kế mô hìnhthí nghiệm; phần mềm thông minh FormRules: phân tích xu hướng, mức độ

và quy luật liên quan; phần mềm thông minh INForm: tối ưu hóa thông số(nhiều biến số phụ thuộc cùng một lúc) Gần đây, ở Việt nam, có một số đề tàikết hợp phương pháp truyền thống với bộ 3 phần mềm nghiên cứu-phát triểntrong bào chế [9,13] và chiết xuất dược liệu [5,7,15]

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Dược liệu, dung môi và trang thiết bị

Danh sách nguyên liệu và chất chuẩn, hóa chất và dung môi, thiết bị chiếtxuất, thiết bị kiểm nghiệm, phần mềm thống kê và phần mềm thông minh lầnlượt được được trình bày trong các Bảng 3.1., Bảng 3.2., Bảng 3.3., Bảng 3.4

và Bảng 3.5

Bảng 3.1 Danh sách nguyên liệu và chất chuẩn

STT Nguyên liệu và chất chuẩn Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 Rễ Đan sâm Tiêu chuẩn cơ sở Công ty Dược phẩmDanapha

2 Chất chuẩn Tanshinon IIA độ tinh khiết 96.1 % Tiêu chuẩn cơ sở Công ty Chromadex,

Mỹ

3 Chất chuẩn acid salvianolicB độ tinh khiết 76.8 % Tiêu chuẩn cơ sở Công ty Chromadex,Mỹ

Bảng 3.2 Danh sách hóa chất và dung môi

STT Hóa chất và dung môi Độ tinh khiết Nguồn gốc

1 Ethanol 96% Công nghiệp Công ty hóa chấtHóa Nam.

2 Acetonitril HPLC Merk

6 Thuốc thử sắt (III) clorid 5% PA Trung Quốc

Bảng 3.3 Danh sách thiết bị chiết xuất cao

STT Thiết bị chiết xuất Nhãn hiệu Nguồn gốc

Bảng 3.4 Danh sách thiết bị kiểm nghiệm

STT Thiết bị kiểm nghiệm Nhãn hiệu Nguồn gốc

AEX – 120G

2 Cân điện tử 5 số Shimadzu AEL –

5 Máy soi UV 2 bước sóng

7 Bản mong tráng sẵn silica gel F 254 , cỡ hạt 0,015 –

0,04 mm

Bảng 3.5 Danh sách phần mềm thống kê và phần mềm thông minh

STT Tên phần mềm Nhãn hiệu Nguồn gốc

1 FormData v3 (2010) Thiết kế thí nghiệm Intelligensys Ltd.,UK

2 FormRules V3.3

(2007) Nghiên cứu liên quan Intelligensys Ltd.,UK

3 INForm V4.0 (2010) Tối ưu hóa công thức Intelligensys Ltd.,UK

3.2 Thẩm định & Kiểm nghiệm

3.2.1 Xây dựng quy trình định lượng Tanshinon IIA

Quy trình chuẩn bị mẫu

Đối với mẫu thử dược liệu Đan sâm (Quy trình chuẩn bị mẫu tiến hành theo

Dược điển Trung Quốc tập II, 2005.)

Cân chính xác 0.3 g dược liệu khô đã được xay tới bột thô vào bình nón 250

ml có nút mài Thêm chính xác 50 ml methanol, đậy nút và cân chính xác tới 0.01 g Lắp sinh hàn hồi lưu vào bình và đun sôi nhẹ trong 1 giờ Để nguội và cân, điều chỉnh khối lượng bình tới khối lượng ban đầu bằng dung môi Lắc đều và lọc nhanh hỗn hợp qua giấy lọc khô Dịch lọc được sử dụng làm dung dịch thử.

Đối với mẫu thử cao chiết Đan sâm

Dựa vào kết quả thăm dò quy trình xử lí mẫu cao Đan sâm của một đề tài đang tiến hành song song, chọn dicloromethan làm dung môi chiết xuất

tanshinon IIA từ cao Đan sâm để làm mẫu thử:

Cân khoảng 0.5 g cao Đan sâm và chiết theo sơ đồ 3.1 để thu được cắn

dicloromethan Hòa tan cắn bằng methanol và cho vào bình định mức 10 ml, siêu âm và bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Đối với mẫu chuẩn

Cân chính xác khoảng 1 mg tanshinon IIA chuẩn cho vào bình định mức 25

ml, hòa tan trong methanol, siêu âm và điền dung môi vừa đủ đến vạch, lắcđều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng0,04 mg/ml

Thăm dò điều kiện sắc kí

Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA có nhiều nối đôi trong phân tử có thể hấpthu bước sóng ở vùng UV, chọn phương pháp sắc kí long hiệu năng cao

(HPLC) với đầu dò dải di-od quang (PDA) để tiến hành định lượng tanshinonIIA.

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cắn Dicloromethan từ cao Đan sâm

Điều kiện tiến hành sắc kí định lượng tanshinon IIA đã được đưa vào Dượcđiển Trung Quốc, tuy nhiên khi tiến hành định lượng theo điều kiện trên, cácpic thu được trên sắc kí đồ không thoa mãn các yêu cầu của một pic sắc kídùng trong định lượng Do đó, cần tiến hành thăm dò lại điều kiện sắc kí

Hệ dung môi CH3CN - H2O (60:40) được chọn để khởi đầu nghiên cứu, tiến hành sắc kí, dựa vào sắc kí đồ và các thông số sắc kí để điều chỉnh tỉ lệ pha động phù hợp

Công thức tính hàm lượng Tanshinon IIA

Trong dược liệu

Hàm lượng phần trăm tanshinon IIA trong dược liệu được tính dựa theo côngthức:

100

dl c

c t t

m S

F TK C S

X =

Trong cao Đan sâm

Hàm lượng phần trăm tanshinon IIA trong cao Đan sâm được tính dựa theocông thức:

100

c c

c t t

m S

F TK C S

Y =

Trong đó:

3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng Tanshinon IIA

Phương pháp định lượng tanshinon IIA được tiến hành khảo sát tính tương thích hệ thống, thẩm định độ lặp lại, tính tuyến tính, độ đúng

3.2.3 Kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm

Dược liệu Đan sâm được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn:

Dược điển Việt Nam IV (2009):

Xt Hàm lượng (%) của tanshinon IIA trong dược liệu

Yt Hàm lượng (%) của tanshinon IIA trong cao Đan sâm

mdl Khối lượng của dược liệu đã trừ độ ẩm

mc Khối lượng cao đem định lượng đã trừ độ ẩm

− Độ tro

− Chất chiết được trong dung môi

Dược điển Trung Quốc (2005):

− Tro không tan trong acid

− Định tính acid salvianolic B

− Định lượng tanshinon IIA

− Định lượng acid salvianolic B

3.2.4 Xác định tỷ lệ tạp chất trong cao

Quá trình chiết xuất cao Đan sâm bằng cồn – nước ngoài thu được những hợpchất có tác dụng sinh học tốt như tanshinon IIA, acid salvianolic B,… còn kéotheo nhiều hợp chất đại phân tử không có tác dụng sinh học như cácpolysaccharid, lignan, protein, polypeptid, carbohydrat,… Do đó, một quytrình chiết xuất cao tối ưu phải hạn chế sự kéo theo những chất không mongmuốn này

Dựa vào đặc diểm cấu trúc hóa học, tính chất của các đại phân tửpolysaccharid, lignan, protein, polypeptid, carbohydrat,… rất phân cực, dễ tantrong nước, dễ tủa trong cồn cao độ, phương pháp kết tủa trong cồn cao độđược chọn để xác định tỉ lệ tạp chất trong cao Đan sâm

Khảo sát độ cồn dùng để kết tủa

Khảo sát lần lượt các độ cồn 75%, 80%, 85%, 90%

Cách tiến hành : trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6 Thí nghiệm thăm dò độ cồn

Thí nghiệm 1 2 3 4

Hòa tan trong 40 ml nước

cao

tua t

m

m

T =Trong đó:

mtua : Khối lượng tủa thu được (g)

mcao : Khối lượng cao đã trừ độ ẩm (g)

Tủa thu được ở mỗi thí nghiệm đem định tính bằng SKLM so sánh với chất chuẩn tanshinon IIA và acid salvianolic B

Độ cồn được lựa chọn phải kết tủa nhiều tạp chất nhất và không làm mất đithành phần hoạt chất mong muốn là tanshinon IIA và acid salvianolic B

Khảo sát thời gian kết tủa

Chọn độ cồn 80 % để tiếp tục khảo sát thời gian kết tủa

Tiến hành khảo sát lần lượt các mốc thời gian : 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75phút

Cách tiến hành: trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7 Thí nghiệm thăm dò thời gian kết tủa

Thí nghiệm 1 2 3 4

Hòa tan trong 40 ml nước

Giữ yên ở 4 0 C trong khoảng thời gian như sau

Lọc và cân khối lượng tủa thu được

Tỉ lệ (%) chất không mong muốn

100

cao

tua t

m

m

T =

Trong đó:

mtua : Khối lượng tủa thu được (g)

mcao : Khối lượng cao đã trừ độ ẩm (g)

Tủa thu được ở mỗi thí nghiệm đem định tính bằng SKLM so sánh với chất chuẩn tanshinon IIA và acid salvianolic B

Thời gian kết tủa được lựa chọn dựa trên khối lượng tủa thu được nhiều nhất

và không làm mất đi thành phần hoạt chất mong muốn là tanshinon IIA vàacid salvianolic B

3.3 Xây dựng quy trình chiết xuất cao Đan sâm

3.3.1 Mô tả quy trình chiết xuất cao Đan sâm

Thông tin tóm tắt về quy trình chiết xuất cao Đan sâm:

− Khối lượng dược liệu: 100 g

− Kích thước dược liệu: Dạng phiến mong, dài 4 – 7 cm

− Phương pháp chiết: Đun hồi lưu

− Nhiệt độ chiết: 80 oC

− Thời gian 1 lần chiết: 2 giờ

− Dung môi chiết: Cồn

− Độ cồn: Thay đổi

− Tỉ lệ dung môi/dược liệu: Thay đổi

− Số lần chiết: Thay đổi

3.3.2 Xây dựng quy trình chiết xuất cao Đan sâm

a Thăm dò điều kiện chiết xuất (thực nghiệm):

− Điều kiện thăm dò: Nồng độ cồn, tỷ lệ dung môi/dược liệu, số lần chiết

− Kết quả thăm dò: Hiệu suất chiết, hàm lượng tanshinon IIA, tỉ lệ tạp chất

b Thiết kế mô hình thực nghiệm (FormData): Từ kết quả thăm dò, mô hình

thực nghiệm với n = 15 được thiết kế bao gồm 3 biến độc lập (xi) và cácbiến phụ thuộc (yj) được cho là có liên quan

Sơ đồ 3.2 Các giai đoạn chiết xuất cao Đan sâm

c Phân tích liên quan nhân quả (FormRules): Dữ liệu thực nghiệm theo thiết

kế được dùng để phân tích các mối liên quan giữa xi và yj về mức độ, xuhướng và quy luật

d Tối ưu hóa thông số (INForm): Dữ liệu thực nghiệm theo thiết kế cũng

được dùng để tối ưu hóa các biến độc lập (xi) sao cho các biến biến phụthuộc (yj) đạt được chỉ tiêu mong muốn

e Kiểm chứng quy trình tối ưu (thực nghiệm): Quy trình chiết xuất tối ưu

được áp dụng 3 lần liên tiếp, phương pháp phân tích phương sai được sửdụng để đánh giá tính lặp lại của quy trình và so sánh kết quả thực nghiệmvới lý thuyết.

Sơ đồ 3.3 Minh họa quá trình thiết kế và tối ưu hóa quy trình

4 KẾT QUẢ & BÀN LUẬN

4.1 Thẩm định quy trình & Kiểm nghiệm

4.1.1 Xây dựng quy trình định lượng Tanshinon IIA

Nghiên cứu thăm dò

Hệ pha động CH3CN - H2O được thăm dò với các tỉ lệ (60:40), (65:45),(68:32) Kết quả cho thấy với tỉ lệ pha động là (68:32) cho kết quả thông sốsắc kí đạt yêu cầu phân tích, kết quả cụ thể được trình bày trong Hình 4.1 vàBảng 4.1

Hình 4.1 Sắc kí đồ mẫu chuẩn Tanshinon IIA trong hệ CH3 CN - H 2 O (68:32)