KHẢO sát THÀNH PHẦN ALKALOID TRONG câu kỷ tử

Qua nhiều thời kỳ phát triển của xã hội, con người ngày càng đạt được những thành tựu to lớn trong khoa học, đặc biệt là trong y học. Nhiều thuốc mới được tổng hợp, nhiều phương pháp chữa bệnh hiện đại được tìm ra giúp con người chiến thắng bệnh tật và kéo dài tuổi thọ. Tuy nhiên, cùng với những thay đổi về sinh thái, môi trường sống…, tỉ lệ bệnh tật ngày càng gia tăng và xuất hiện thêm nhiều căn bệnh mới nguy hiểm. Trong khi đó, các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học thường có nhiều phản ứng phụ, độc tính và giá thành cao. Vì vậy, việc tìm ra những hoạt chất mới có nguồn gốc từ thiên nhiên đã một lần nữa trở thành xu hướng chung của nền y học thế giới. Họ Cà (Solanaceae) là một họ có nhiều loài cây thường được sử dụng trong dân gian để làm thực phẩm như cà chua (Solanum lycopersicum L.), khoai tây (Solanum tuberosum L.), ớt (Capsicum annuum L.)… Họ Solanaceae cũng nổi tiếng vì chứa một loạt các glycosid alkaloid đa dạng. Một trong các nhóm quan trọng nhất là nhóm alkaloid nhân tropan, bao gồm atropin, scopolamin, hyoscyamin. Về mặt dược học, đây là những chất kháng cholin mạnh nhất hiện có, sử dụng quá liều có thể gây các triệu chứng khô miệng, giãn đồng tử, mất điều hòa, bí tiểu, ảo giác, co giật, hôn mê và tử vong. Mặc dù là những chất độc, các alkaloid tropan vẫn là một loại dược phẩm quan trọng khi sử dụng đúng liều chỉ định. Cây Câu kỷ thuộc họ Cà là một trong những cây thuốc được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền. Câu kỷ được sử dụng rất thông dụng từ hơn 2000 năm nay ở châu Á như một trong những thực phẩm giàu dinh dưỡng. Từ khoảng đầu thế kỷ 21, ở Mỹ và những quốc gia phát triển khác đã bắt đầu công nhận vai trò của Câu kỷ vì hoạt tính chống oxy hóa và giàu chất dinh dưỡng. Năm 2006, từ Câu kỷ có 54 sản phẩm mới dưới dạng thực phẩm chức năng được giới thiệu đến thế giới. Câu kỷ Lycium chinense Mill. được mô tả lần đầu bởi nhà thực vật học người Scotlen Philip Miller trong cuốn The Gardener’s Dictionary xuất bản năm 1768. Câu kỷ tử quả của cây Câu kỷ có mặt trong hầu hết các thang thuốc bổ trong Đông y với vai trò thuốc dẫn. Tháng 62007, FDA đã chính thức cho phép Câu kỷ tử được lưu hành trên thị trường như một loại thực phẩm bổ sung. Tuy nhiên, cho đến nay, dù đã có mặt trong nhiều chế phẩm thuốc bổ cũng như nhiều tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của Câu kỷ tử đã được công bố, thì ngoài phát hiện về alkaloid Kukoamin trong vỏ rễ Câu kỷ, vẫn chưa có nghiên cứu nào khác tiến hành khảo sát về thành phần alkaloid trong Câu kỷ tử. Từ thực tế đó, chúng tôi đặt vấn đề “Khảo sát thành phần alkaloid trong Câu kỷ tử Fructus Lycii” với mục đích góp phần khảo sát đầy đủ hơn về thành phần alkaloid của Câu kỷ tử. Mục tiêu của đề tài: Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của Câu kỷ tử Fructus Lycii. Chiết xuất và phân lập alkaloid trong Câu kỷ tử. Tinh khiết hóa chất phân lập được.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ THỦY KHẢO SÁT THÀNH PHẦN ALKALOID TRONG CÂU KỶ TỬ (Fructus Lycii) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phớ Hờ Chí Minh – 2009 i BỢ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ THỦY KHẢO SÁT THÀNH PHẦN ALKALOID TRONG CÂU KỶ TỬ (Fructus Lycii) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Giáo viên hướng dẫn: TS Huỳnh Ngọc Thụy Thành phố Hồ Chí Minh – 2009 ii Lời cảm ơn Lời cảm ơn chân thành sâu sắc em xin gửi đến cô TS Huỳnh Ngọc Thụy, người trực tiếp tận tình hướng dẫn giúp đỡ em nhiều suốt thời gian qua để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ Môn Dược Liệu tạo điều kiện cho em thực tốt khóa luận Em xin cảm ơn thầy TS Võ Văn Lẹo thầy TS Nguyễn Viết Kình tận tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm động viên em suốt thời gian thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn anh chị môn quan tâm giúp đỡ em thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến q thầy giảng dạy khoa Dược – Đại học Y Dược Tp HCM truyền đạt cho em kiến thức quý báu năm theo học Cảm ơn bạn Dược 2004 làm khóa luận Bộ Mơn Dược liệu hết lòng động viên, chia sẻ buồn vui giúp vượt qua khó khăn để hồn thành tốt khóa luận Xin cảm ơn Cha Mẹ yêu thương, chăm sóc nuôi dạy vững bước vào đời iii MỤC LỤC MỤC LỤC IV DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VII DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VII DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VIII CHƯƠNG MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ CHƯƠNG TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1 Vị trí phân loại của chi Lycium 1.2 Tổng quan họ Solanaceae 1.2.1 Mô tả thực vật họ Solanaceae .4 1.2.2 Tổng quan hóa học 1.3 Tổng quan chi Lycium 1.3.1 Mô tả thực vật .5 1.3.2 Phân bố 1.3.3 Các loài Lycium có Việt Nam [3] 1.4 Tổng quan Lycium chinense Mill 1.4.1 Mô tả thực vật .6 1.4.2 Phân bố 1.4.3.Bộ phận dùng .7 1.4.4 Thu hái sơ chế .8 1.4.5 Bảo quản .8 TỔNG QUAN VẾ HÓA HỌC 2.1 Thành phần hóa học L chinense Mill 2.2 Thành phần hóa học vỏ L chinense Mill 10 2.3 Thành phần hóa học vỏ rễ L chinense Mill .10 2.4 Thành phần hóa học L chinense Mill 11 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG 12 3.1 Tác dụng dược lý .12 3.1.1 Tác dụng bảo vệ gan 12 3.1.2 Tăng cường miễn dịch 12 3.1.3 Tác dụng làm chậm suy lão 13 3.1.4 Tác dụng với hệ thống máu .13 3.1.5 Các tác dụng khác .13 3.2 Công dụng 14 3.2.1 Các thuốc y học cổ truyền 14 3.2.2 Các chế phẩm y học đại 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 1.1 Nguyên liệu 17 1.2 Dung mơi hóa chất 17 iv 1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 17 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Xác định độ tinh khiết của dược liệu .18 2.2 Khảo sát hóa học 18 2.2.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 18 2.2.2 Khảo sát phương pháp chiết xuất alkaloid 19 2.2.3 Khảo sát điều kiện chiết xuất alkaloid toàn phần từ dược liệu 19 2.2.4 Chiết tách phân doạn 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 20 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ TINH KHIẾT CỦA DƯỢC LIỆU 20 1.1 Cảm quan 20 1.2 Độ ẩm .20 1.3 Độ tro .20 1.4 Hàm lượng % chất chiết 20 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 21 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP ALKALOID 22 3.1 Kết khảo sát quy trình chiết 22 3.1.1 Thăm dò quy trình chiết 22 3.1.2 Thăm dò phương pháp chiết .23 3.2 Kết khảo sát điều kiện chiết xuất alkaloid 24 3.2.1 Khảo sát pH acid .24 3.2.2 Khảo sát dung môi hữu chiết alkaloid base 24 3.2.3 Khảo sát pH kiềm 25 3.3 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ Câu kỷ tử .26 3.4 Phân lập tinh chế alkaloid 28 3.4.1 Phân tách cao alkaloid toàn phần 28 3.4.2 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 7A 30 3.4.3 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 8A (cột C) .33 3.4.4 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 10A (cột D) .35 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI 37 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 v DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT L chinense : Lycium chinense EtOAc : Ethyl acetat CHCl3 : Cloroform MeOH : Methanol n-He : n-Hexan Bz : Benzen HCl : Acid hydrocloric NH4OH : Amoniac DĐVN : Dược điển Việt Nam TT : Thuốc thử TP : Toàn phần SKLM : Sắc ký lớp mỏng SKC : Sắc ký cột SPE : Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction) vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 So sánh đặc điểm loài Lycium Bảng 4.1 Kết độ tro của Câu kỷ tử 20 Bảng 4.2 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật Câu kỷ tử 21 Bảng 4.3 So sánh quy trình chiết xuất alkaloid tòan phần từ Câu kỷ tử 22 Bảng 4.4 So sánh nồng độ cồn chiết xuất alkaloid 23 Bảng 4.5 So sánh phương pháp chiết nóng chiết ngấm kiệt .23 Bảng 4.6 Kết khảo sát pH acid 24 Bảng 4.7 So sánh dung môi hữu có khả hòa tan alkaloid base/Câu kỷ tử 24 Bảng 4.8 Kết khảo sát pH kiềm 25 Bảng 4.9 Kết khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký .27 Bảng 4.10 Các phân đoạn thu từ cột A 28 Bảng 4.11 So sánh độ nhạy thuốc thử alkaloid với phân đoạn 29 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỜ Sơ đồ Vị trí phân loại của chi Lycium Sơ đồ Chiết xuất alkaloid toàn phần từ Câu kỷ tử 26 Sơ đồ Rửa phân đoạn 8A với MeOH 33 vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Nhân tropan .4 Hình 1.2 Scopolamin .4 Hình 1.3 Hyoscyamin Hình 1.4 Nicotin .5 Hình 1.5 Lycium chinense Mill [7] Hình 1.6 Câu kỷ tử Hình 1.7 Cấu trúc của Zeaxanthin Dipalmitat Hình 1.8 Cấu trúc của Betain Hình 1.9 Cấu trúc của cerebroside 10 Hình 1.10 Cấu trúc của dẫn xuất pyrrole 10 Hình 1.11 Cấu trúc của kukoamin .11 Hình 1.12 Cấu trúc Lycium A 11 Hình 1.13 Trà Terra Vita 16 Hình 1.14 Bột vỏ rễ Lycium 16 Hình 1.15 Viên bao đường Thập Vị Bổ 16 Hình 1.16 Viên bổ sung dinh dưỡng Forever Lycium Plus 16 Hình 4.1 Quả của Câu kỷ L chinense Mill .20 Hình 4.2 Sắc ký đồ phân đoạn cột chân không (cột A) 29 Hình 4.3 Sắc ký đồ phân đoạn cột cổ điển (cột B) 31 Hình 4.4 Sắc ký đồ phân đoạn S1 S2 32 Hình 4.5 Sắc ký đồ phân đoạn cột rây phân tử (cột C) 34 Hình 4.6 Sắc ký đồ phân đoạn cột D .35 viii Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy CHƯƠNG MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ Qua nhiều thời kỳ phát triển của xã hội, người ngày đạt thành tựu to lớn khoa học, đặc biệt y học Nhiều thuốc tổng hợp, nhiều phương pháp chữa bệnh đại tìm giúp người chiến thắng bệnh tật kéo dài tuổi thọ Tuy nhiên, với thay đổi sinh thái, môi trường sống…, tỉ lệ bệnh tật ngày gia tăng xuất thêm nhiều bệnh nguy hiểm Trong đó, thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học thường có nhiều phản ứng phụ, độc tính giá thành cao Vì vậy, việc tìm hoạt chất có nguồn gốc từ thiên nhiên lần trở thành xu hướng chung của y học giới Họ Cà (Solanaceae) họ có nhiều lồi thường sử dụng dân gian để làm thực phẩm cà chua (Solanum lycopersicum L.), khoai tây (Solanum tuberosum L.), ớt (Capsicum annuum L.)… Họ Solanaceae tiếng chứa loạt glycosid alkaloid đa dạng Một nhóm quan trọng nhóm alkaloid nhân tropan, bao gồm atropin, scopolamin, hyoscyamin Về mặt dược học, chất kháng cholin mạnh có, sử dụng q liều gây triệu chứng khơ miệng, giãn đồng tử, điều hòa, bí tiểu, ảo giác, co giật, hôn mê tử vong Mặc dù chất độc, alkaloid tropan loại dược phẩm quan trọng sử dụng liều định Cây Câu kỷ thuộc họ Cà thuốc sử dụng nhiều y học cổ truyền Câu kỷ sử dụng thông dụng từ 2000 năm châu Á thực phẩm giàu dinh dưỡng Từ khoảng đầu kỷ 21, Mỹ quốc gia phát triển khác bắt đầu cơng nhận vai trò của Câu kỷ hoạt tính chống oxy hóa giàu chất dinh dưỡng Năm 2006, từ Câu kỷ có 54 sản phẩm dạng thực phẩm chức giới thiệu đến giới Câu kỷ Lycium chinense Mill mô tả lần đầu nhà thực vật học người Scotlen Philip Miller The Gardener’s Dictionary xuất năm 1768 Câu kỷ tử của Câu kỷ có mặt hầu hết thang thuốc bổ Đơng y với vai trò thuốc dẫn Tháng 6/2007, FDA thức cho phép Câu kỷ tử lưu hành thị trường loại thực phẩm bổ sung Tuy nhiên, nay, dù có mặt nhiều chế phẩm thuốc bổ nhiều Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy tài liệu nghiên cứu thành phần hóa học của Câu kỷ tử cơng bố, ngồi phát alkaloid Kukoamin vỏ rễ Câu kỷ, chưa có nghiên cứu khác tiến hành khảo sát thành phần alkaloid Câu kỷ tử Từ thực tế đó, chúng tơi đặt vấn đề “Khảo sát thành phần alkaloid Câu kỷ tử Fructus Lycii” với mục đích góp phần khảo sát đầy đủ thành phần alkaloid của Câu kỷ tử Mục tiêu của đề tài: - Phân tích sơ thành phần hóa thực vật của Câu kỷ tử Fructus Lycii - Chiết xuất phân lập alkaloid Câu kỷ tử - Tinh khiết hóa chất phân lập Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Kết luận: Từ kết trên, chọn quy trình (3) – dùng cồn acid để chiết xuất alkaloid tồn phần từ dược liệu Đây quy trình chiết alkaloid hiệu so với quy trình lại cho hàm lượng cắn alkaloid tồn phần cao hơn, phản ứng với thuốc thử chung của alkaloid rõ * Thăm dò độ cồn thích hợp chiết xuất alkaloid toàn phần từ Câu kỷ tử: Do chọn quy trình chiết alkaloid tồn phần phương pháp chiết với cồn - acid, tiến hành thăm dò độ cồn sử dụng chiết xuất Kết thể bảng 4.4: Bảng 4.4 So sánh nồng độ cồn chiết xuất alkaloid Phản ứng với thuốc thử Độ cồn Khối lượng cắn alkaloid toàn phần Màu sắc Vị 45% 0,80 g Vàng nhạt 70% 0,85 g 96% 0,51 g Dragendorff Bertrand Valse Mayer Chua + +++ +++ Vàng đậm Chua + +++ +++ Nâu nhạt Chua + ++ ++ Nhận xét: Cắn alkaloid toàn phần chiết từ Câu kỷ tử với cồn 45% cồn 70% có khối lượng cao cho phản ứng dương tính với thuốc thử alkaloid rõ cắn alkaloid toàn phần chiết từ cồn 90% Kết luận: Nồng độ cồn lựa chọn để tiến hành quy trình chiết xuất cao alkaloid tồn phần Câu kỷ tử cồn 70%, phần bã dược liệu lại chiết kiệt với cồn 45% 3.1.2 Thăm dò phương pháp chiết Tiến hành chiết xuất alkaloid toàn phần Câu kỷ tử theo quy trình (3)_chiết với cồn – acid, độ cồn thích hợp 70%, thăm dò phương pháp chiết nóng chiết ngấm kiệt với đồng lượng dược liệu (30 g Câu kỷ tử) Kết thể bảng 4.5: Bảng 4.5 So sánh phương pháp chiết nóng chiết ngấm kiệt Phản ứng với thuốc thử Phương pháp Khối lượng cắn Chiết nóng 0,81 g Nâu đỏ Chua Chiết ngấm kiệt 0,55 g Vàng đậm Chua Màu sắc Vị 25 Dragendorff Bertrand Valse Mayer ++ +++ +++ + ++ + Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Nhận xét: Cắn alkaloid toàn phần từ phương pháp chiết nóng cho kết dương tính rõ với nhóm thuốc thử alkaloid cắn từ phương pháp chiết ngấm kiệt Phương pháp chiết nóng tiết kiệm thời gian so với chiết ngấm kiệt Kết luận: Chọn phương pháp chiết nóng với quy trình (3), nồng độ cồn 70% 3.2 Kết khảo sát điều kiện chiết xuất alkaloid Câu kỷ tử 3.2.1 Khảo sát pH acid Sau lựa chọn phương pháp chiết alkaloid toàn phần với cồn - acid, tiến hành thăm dò pH acid hóa Kết thể bảng 4.6: Bảng 4.6 Kết khảo sát pH acid Phản ứng với thuốc thử pH Dragendorff Bertrand Valse Mayer 4–5 - - - - - - ++ +++ +++ Nhận xét: Ở pH = 2, cắn alkaloid cho phản ứng dương tính với thuốc thử chung alkaloid, cắn chiết pH lại cho phản ứng âm tính Kết luận: pH acid ảnh hưởng đến trình chiết xuất, chọn pH = để acid hóa tiến hành chiết xuất alkaloid Câu kỷ tử 3.2.2 Khảo sát dung môi hữu chiết alkaloid base Từ alkaloid dạng muối tan nước chiết xuất theo quy trình chiết với cồn acid, tiếp tục tách alkaloid dạng base tan dung môi hữu phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng Kết lựa chọn loại dung môi thể bảng 4.7: Bảng 4.7 So sánh dung môi hữu có khả hòa tan alkaloid base/Câu kỷ tử Cắn/dung môi Phản ứng với thuốc thử Dragendorff Bertrand Valse Mayer CHCl3 - - - EtOAc ++ +++ +++ MeOH + ++ ++ 26 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Nhận xét: Cắn alkaloid chiết từ CHCl cho phản ứng âm tính với nhóm thuốc thử alkaloid, cắn EtOAc MeOH cho phản ứng dương tính rõ Do MeOH hỗn hòa với cồn, nước, cần phải loại dung mơi hồn tồn đến cắn dùng MeOH để chiết alkaloid base Kết luận: EtOAc có khả hòa tan tốt alkaloid phù hợp chiết xuất alkaloid số lượng nhiều theo phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng Vì vậy, chọn EtOAc để chiết xuất alkaloid Câu kỷ tử 3.2.3 Khảo sát pH kiềm Thăm dò pH kiềm hóa để chuyển alkaloid dạng muối thành alkaloid base tan dung môi hữu cơ, kết thể bảng 4.8: Bảng 4.8 Kết khảo sát pH kiềm pH Phản ứng với thuốc thử Dragendorff Bertrand Valse Mayer - - - 10 +++ +++ +++ 11 - 12 + ++ ++ Kết luận: chọn pH = 10 để kiềm hóa tiến hành chiết xuất alkaloid Câu kỷ tử 3.3 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ Câu kỷ tử Cân khoảng 10 kg Lycium chinense Mill xay nhỏ vào bình chiết hình trụ nắp có gắn sinh hàn hồi lưu, thêm cồn 70% cho ngập mặt dược liệu, ngâm Lắp sinh hàn đun cách thủy (80oC), lọc qua bơng gòn thu dịch chiết cồn 70% Chiết nhiều lần dịch chiết cồn bốc khơng lớp cắn mờ lam kính Gộp dịch chiết loại dung môi áp suất giảm thu 3,8 kg cao cồn 70% toàn phần (đã trừ độ ẩm) Phần bã tận thu chiết lại với cồn 45%, thu 0,6 kg cao cồn 45% (đã trừ độ ẩm) Dùng kg cao cồn 70% toàn phần, chiết xuất alkaloid toàn phần theo phương pháp chiết cồn - acid Phần cao cồn 70% lại cao cồn 45% chưa có thời gian để lại xử lý sau 27 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Thuốc thử alkaloid Sơ đồ Chiết xuất alkaloid toàn phần từ Câu kỷ tử 28 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Kết quả: Từ kg cao cồn 70% (đã trừ độ ẩm), sau chiết xuất tinh chế, thu 10 g cắn EtOAc toàn phần cao alkaloid tồn phần Hàm lượng alkaloid toàn phần dược liệu Câu kỷ tử khoảng 0,143% 3.4 Phân lập tinh chế alkaloid 3.4.1 Phân tách cao alkaloid toàn phần Cao alkaloid toàn phần khai triển SKLM để kiểm tra với nhiều hệ dung môi: Bảng 4.9 Kết khảo sát hệ dung môi chạy sắc ky Hệ dung môi Tỉ lệ Khả tách nHe - CHCl3 6:4 - nHe - EtOAc 9:1 + nHe - EtOAc 7:3 + Bz – EtOAc 7:3 - CHCl3 - EtOAc 9:1 ++ CHCl3 - EtOAc 7:3 ++ CHCl3 – MeOH 9:1 +++ CHCl3 – MeOH 7:3 ++ Ghi Khai triển lần Nhận xét: Hệ CHCl3-MeOH (9:1) cho vết alkaloid tách rõ sử dụng làm pha động cho việc tách alkaloid SKC chân không (cột A) * Phân tách cao alkaloid toàn phần sắc ky cột chân khơng (cột A): - Mẫu: 10 g cao alkaloid tồn phần hòa tan lượng tối thiểu CHCl - Dụng cụ: cột thủy tinh có lưới xốp (lưới số 3), dài 30 cm, đường kính 3,5 cm - Chất hấp phụ: silica gel Merck hạt vừa (40 – 63 µm), sấy 110 oC giờ, khối lượng 150g - Hệ dung môi khai triển: CHCl - MeOH với tỉ lệ MeOH tăng dần (10:0; 9,5:5; 9:1; 8,5:1,5) - Nhồi cột: silica gel nhồi vào cột theo phương pháp bột khô Nén chặt khối chất hấp phụ áp suất hút phía cột Ởn định cột dòng dung mơi chảy 29 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy qua cột nhờ áp suất hút - Nạp mẫu: mẫu nạp dạng dung dịch Khi lớp dung mơi dùng để ổn định cột mặt chất hấp phụ khoảng 1-2 mm nạp mẫu Từ lúc nhồi cột thu phân đoạn trì áp suất - Khai triển cột: thể tích phân đoạn 50 ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi CHCl 3-MeOH (9:1), khai triển lần, phát UV-254 nm, UV-365 nm thuốc thử Dragendorff cho vết màu cam Các phân đoạn có thành phần giống gộp chung thành phân đoạn lớn Kết quả: Sau khai triển phân đoạn cột A SKLM, phát UV-254 nm, UV365 nm, kiểm tra phân đoạn với nhóm thuốc thử chung alkaloid, thu 11 phân đoạn trình bày bảng 4.10 hình 4.2 Các phân đoạn đặt tên từ 1A, 2A, đến 11A Bảng 4.10 Các phân đoạn thu được từ cột A Phân đoạn Cảm quan UV – 254, 365 nm 1A Màu vàng, dạng dầu Nhiều vết - 2A Màu vàng, dạng dầu Nhiều vết - 3A Màu đỏ Nhiều vết - 4A Màu đỏ Nhiều vết - 5A Màu đỏ, dạng dầu Nhiều vết - 6A Màu vàng, dạng dầu Nhiều vết - 7A Màu đỏ Nhiều vết +++ 8A Màu đỏ Nhiều vết +++ 9A Màu đỏ, có tủa Nhiều vết - 10A Màu đỏ, có tủa Nhiều vết +++ 11A Màu đỏ, có tủa Nhiều vết - 30 Thuốc thử chung alkaloid Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Nhận xét: phân đoạn 7A, 8A 10A dương tính với nhóm thuốc thử alkaloid, độ nhạy của thuốc thử với phân đoạn khác nhau, thể bảng 4.11: Bảng 4.11 So sánh độ nhạy thuốc thử alkaloid với phân đoạn Phân đoạn Định tính với thuốc thử Dragendorff Bertrand Valse Mayer 7A +++ +++ +++ 8A + +++ +++ 10A + +++ +++ Hình 4.2 Sắc ky đồ phân đoạn cột chân không (cột A) Nhận xét: Trong 11 phân đoạn thu từ cột A, phân đoạn 7A, 8A 10A dương tính với nhóm thuốc thử chung của alkaloid Tuy nhiên, phân đoạn nhiều vết khác sắc ký đồ (hình 4.2), cần tiếp tục phân tách qua SKC cổ điển để thu chất tinh khiết Ngoài ra, alkaloid phân đoạn có độ nhạy khác thuốc thử Dragendorff, nên cần kiểm tra thêm với thuốc thử Bertrand Valse Mayer 3.4.2 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 7A Với hệ dung môi sắc ký mỏng thăm dò bảng 4.7, hệ CHCl - MeOH (9:1) cho khả tách tốt vết có Rf cao, nên phân lập alkaloid từ phân đoạn 7A chọn hệ dung môi khai triển cột CHCl – EtOAc (9:1) với Rf thấp hơn, 31 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy dung môi CHCl3 tăng dần tỉ lệ EtOAc 3.4.2.1 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 7A qua sắc ký cột cổ điển (cột B) - Mẫu: g phân đoạn 7A thu từ cột A, hòa tan lượng tối thiểu CHCl3 - Dụng cụ: cột thủy tinh dài 45 cm, đường kính 3,5 cm - Chất hấp phụ: silica gel Merck hạt vừa (40 – 63 µm), sấy 110 oC giờ, khối lượng 80g - Hệ dung môi khai triển: CHCl3 - EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng dần (10:0, 9:1, 8:2) - Nhồi cột: silica gel nạp vào cột theo phương pháp hỗn dịch Thời gian ổn định cột (chạy không tải) khoảng Sau cột ổn định, mẫu nạp vào cột - Nạp mẫu: mẫu nạp dạng dung dịch Khi lượng dung môi dùng để ổn định cột mặt chất hấp phụ khoảng 1-2 mm nạp mẫu Bảo vệ mặt cột lớp silica gel mỏng, sau tiến hành khai triển cột - Khai triển cột: + Tốc độ: 60 giọt/ phút + Dụng cụ hứng: ống nghiệm cm x 7,5 cm, thể tích phân đoạn 10 ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi CHCl 3-MeOH (9:1), khai triển lần, phát UV-254 nm, UV-365 nm thuốc thử Dragendorff - Các ống có thành phần giống gộp lại thành phân đoạn Kết quả: Sau khai triển phân đoạn cột B SKLM, phát UV-254 nm, UV365 nm định tính với nhóm thuốc thử chung của alkaloid, thu phân đoạn sắc ký đồ hình 4.3 Các phân đoạn từ cột B đặt tên từ 1B, 2B, đến 9B Trong có phân đoạn 7B dương tính rõ với thuốc thử Bertrand Valse Mayer, màu nhanh với thuốc thử Dragendorff 32 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Hình 4.3 Sắc ky đồ phân đoạn cột cổ điển (cột B) Nhận xét: Trong phân đoạn phân đoạn 7B dương tính với nhóm thuốc thử alkaloid, phân đoạn nhiều vết sắc ký đồ nên tinh chế lại kỹ thuật chiết pha rắn để thu chất tinh khiết 3.4.2.2 Tinh chế phân đoạn 7B kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) Phân đoạn 7B lẫn nhiều tạp phân cực, dùng dung mơi khai triển Benzen để loại tạp phân cực, sau tăng dần tỉ lệ CHCl - Mẫu: 1,2 g phân đoạn 7B hòa tan lượng tối thiểu CHCl - Cột : SPE Strata SI-1 from Phenomenex - Khai triển cột với Benzen, tăng dần tỉ lệ CHCl3 + Tốc độ: không dùng áp suất hút, để cột tự chảy trọng lực + Dụng cụ hứng: ống cm x 3,5 cm, thể tích phân đoạn khoảng ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi CHCl 3-MeOH (9:1), khai triển lần, phát UV-254 nm, UV-365 nm thuốc thử Dragendorff - Các ống có thành phần giống gộp lại thành phân đoạn 33 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Kết quả: Từ cột SPE, tách phân đoạn: + Phân đoạn (S1): vết alkaloid (A1) (A2) phân cực, dương tính rõ với thuốc thử Dragendorff, Bertrand Valse Mayer Các vết có màu vàng chanh mỏng chưa màu + Phân đoạn (S2): vết alkaloid (A3) phân cực trung bình, dương tính rõ với thuốc thử Dragendorff, Bertrand Valse Mayer Vết có màu vàng chanh mỏng chưa màu Hình 4.4 Sắc ky đồ phân đoạn S1 S2 Nhận xét: phân đoạn S1 S2 có kết tinh chưa Do thời gian khóa luận có hạn, chúng tơi chưa tiếp tục tinh chế phân đoạn 3.4.3 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 8A (cột C) Phân đoạn 8A rửa lại với MeOH, xuất tủa trắng mịn (tủa M) Tủa M phần dung dịch MeOH lại dương tính với thuốc thử Bertrand Valse Mayer, lên màu yếu nhanh màu với thuốc thử Dragendorff Sau kiểm tra tủa M SKLM, phát thấy nhiều vết sắc ký đồ, thời gian khóa luận có hạn, tập trung xử lý trước phần dịch MeOH từ phân đoạn 8A 34 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Sơ đồ Rửa phân đoạn 8A với MeOH Dịch MeOH cô đến cắn tiếp tục phân lập với kỹ thuật SKC rây phân tử - Mẫu: g cắn MeOH (Me) từ phân đoạn 8A - Dụng cụ: cột thủy tinh dài m, đường kính 3,5 cm - Pha tĩnh: Sephadex LH-20 nhồi vào cột môn Dược liệu - Dung môi khai triển: MeOH - Nạp mẫu: mẫu nạp dạng dung dịch Khi lượng dung mơi dùng để ổn định cột mặt chất hấp phụ khoảng 1-2 mm nạp mẫu, sau tiến hành khai triển cột - Khai triển cột: + Tốc độ: 60 giọt/ phút + Dụng cụ hứng: ống nghiệm 1,6 cm x 16 cm, thể tích phân đoạn 10 ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi CHCl 3-MeOH (9:1), khai triển lần, phát UV-254 nm, UV-365 nm - Các ống có thành phần giống gộp lại thành phân đoạn Kết quả: Sau khai triển phân đoạn cột C SKLM, phát UV-254 nm, UV365 nm định tính với nhóm thuốc thử chung của alkaloid, thu phân đoạn sắc ký đồ hình 4.5 Các phân đoạn đặt tên từ 1C, 2C, đến 7C Trong có phân đoạn 3C dương tính với thuốc thử alkaloid 35 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy Hình 4.5 Sắc ky đồ phân đoạn cột rây phân tử (cột C) Nhận xét : Phân đoạn 3C dương tính với thuốc thử Bertrand Valse Mayer, màu nhanh với thuốc thử Dragendorff Phân đoạn 3C nhiều vết sắc ký đồ Như vậy, chất phân đoạn có kích thước phân tử khơng chênh lệch rõ rệt, cần phải tiếp tục tinh chế với phương pháp khác Nhưng thời gian khóa luận có hạn, chúng tơi chưa tiếp tục tinh chế phân đoạn 3.4.4 Phân lập alkaloid từ phân đoạn 10A (cột D) Phân đoạn 10A tiếp tục phân lập qua cột cổ điển (cột D) Phân đoạn 10A có alkaloid phân cực nên khảo sát SKLM chọn hệ EtOAc-MeOH (7:3) để khai triển mỏng EtOAc dung môi khai triển cột, tăng dần tỉ lệ MeOH - Mẫu: phân đoạn 10A (3 g), hòa tan lượng tối thiểu CHCl - Dụng cụ: cột thủy tinh dài 45 cm, đường kính 3,5 cm - Chất hấp phụ: silica gel Merck hạt vừa (40 – 63 µm), sấy 110 oC giờ, khối lượng 80g - Hệ dung môi khai triển: EtOAc - MeOH, với tỉ lệ MeOH tăng dần (10:0; 9,5:0,5; 9:1 ) 36 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy - Khai triển cột: + Tốc độ: 60 giọt/ phút + Dụng cụ hứng: ống nghiệm 1,6 cm x 16 cm, thể tích phân đoạn 20 ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi EtOAc - MeOH (7:3), khai triển lần, phát UV-254 nm, UV-365 nm - Các ống có thành phần giống gộp lại thành phân đoạn Kết quả: Sau khai triển phân đoạn từ cột D SKLM, phát UV-254 nm, UV365 nm định tính với nhóm thuốc thử chung của alkaloid, thu phân đoạn sắc ký đồ hình 4.6 Các phân đoạn đặt tên từ 1D, 2D, đến 7D, có phân đoạn 6D 7D dương tính với thuốc thử alkaloid: Hình 4.6 Sắc ky đồ phân đoạn cột D Nhận xét : Phân đoạn 6D 7D có vết phát quang UV-254 nm, cho phản ứng dương tính rõ với thuốc thử Bertrand Valse Mayer, với thuốc thử Dragendorff nhanh bị màu phân đoạn có kết tinh chưa sạch, thời gian của khóa luận có hạn, chúng tơi chưa tiếp tục tinh chế phân đoạn 37 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy CHƯƠNG KÊT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ TÓM TẮT KÊT QUẢ NGHIÊN CỨU Sau thực đề tài, thu số kết sau : - Sơ phân tích thành phần hóa thực vật Câu kỷ tử - Đã khảo sát quy trình, phương pháp điều kiện chiết xuất alkaloid toàn phần từ Câu kỷ tử - Đã chiết xuất 10 kg Câu kỷ tử, thu khoảng 3,8 kg cao cồn 70% toàn phần (đã trừ độ ẩm) 0,6 kg cao cồn 45% chiết từ bã lại (đã trừ độ ẩm) - Dùng kg cao cồn 70% tồn phần chiết theo quy trình khảo sát, sau làm sạch, thu 10 g cắn EtOAc cao alkaloid tồn phần - Từ 10 g cao alkaloid toàn phần này, tiến hành phân tách qua SKC chân không, thu phân đoạn có alkaloid phân đoạn 7A, 8A 10A  Phân đoạn 7A tiếp tục phân tách qua SKC cổ điển (cột B) thu phân đoạn 7B Phân đoạn 7B tiếp tục tinh chế với kỹ thuật chiết pha rắn qua cột SPE, tách alkaloid A1, A2, A3 Trong có A1 A2 phân cực, A3 có độ phân cực trung bình  Đã làm phân đoạn 8A với MeOH, thu tủa M cắn MeOH Cắn MeOH tiếp tục phân tách qua SKC rây phân tử (cột C), thu phân đoạn 3C có alkaloid  Đã phân tách phân đoạn 10A qua SKC cổ điển (cột D), thu phân đoạn 6D 7D có alkaloid ĐÊ NGHỊ Trong thời gian tới để đề tài hoàn thành, chúng tơi có số đề nghị sau : - Tiếp tục xử lý để kết tinh alkaloid A1, A2, A3 - Xử lý phần tủa M phân đoạn 3C, 6D, 7D để thu alkaloid tinh khiết 38 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 2009 Nguyễn Thị Thủy TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi (2004) Từ điển thực vật thông dụng, Tập II, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 1618, 2293 Viện Dược liệu (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt nam, Tập I, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 362-366 Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Tập II, tr 766 Đỗ Tất Lợi (1991) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật, tr 850-851 Bộ Y Tế (2002) Dược điển Việt nam III, Nxb Y học, tr 333 Võ Văn Chi (2007) Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, Nxb Giáo dục, tr 346 http://www.herbmart.or.kr/c.image/exhibit/herb/31/A_0105_1704_31.jpg Sun Yeou Kim et al (1997) “New Antihepatotoxic Cerebroside from Lycium chinense Fruits”, Journal of Natural Products, 60, pp 274-276 Young-Won Chin et al (2003) “Hepatoprotective Pyrrole derivatives of Lycium chinense fruits”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13, pp 79-81 10 Shinji Funayama et al (1995) “Kukoamine B, a spermine alkaloid from Lycium chinense”, Phytochemistry, 38(6), pp 1529-1531 11 Chantrapromma K.; Ganem B (1981) “Total synthesis of kukoamin A, an antihypertensive constituent of Lycium chinense”, Tetrahedron Lett., 22, pp 23-24 12 Yahara S et al (1993) “Cyclic peptides, acyclic diterpene glycosides and other compounds from Lycium chinense Mill.”, Chem Pharm Bull., 41(4), pp 703-709 13 Hiroshi Morita et al (1996) “Configurational and Conformational Analyses of a Cyclic Octapeptide, Lyciumin A, from Lycium chinense Mill.”, Tetrahedron, 52(8), pp.27952808 14 Jing Zhao et al (2002) “Withanolide Derivatives from the Roots of Withania somnifera and Their Neurite Outgrowth Activities”, Chem Pharm Bull., 50(6), pp 760-765 15 Hye Sook Yun-Choi et al (1985) “Modified smear method for screening potential inhibitors of platelet aggregation from plant sources”, Journal of Natural Products, 48(3), pp 363-370 16 Hong Pyo Kim et al (2002) “Zeaxanthin Dipalmitate from Lycium chinense Fruit Reduces Experimentally Induced Hepatic Fibrosis in Rats”, Biol Pharm Bull., 25(3), pp 390-392 39 ... học của Câu kỷ tử cơng bố, ngồi phát alkaloid Kukoamin vỏ rễ Câu kỷ, chưa có nghiên cứu khác tiến hành khảo sát thành phần alkaloid Câu kỷ tử Từ thực tế đó, chúng tơi đặt vấn đề Khảo sát thành... phần alkaloid Câu kỷ tử Fructus Lycii” với mục đích góp phần khảo sát đầy đủ thành phần alkaloid của Câu kỷ tử Mục tiêu của đề tài: - Phân tích sơ thành phần hóa thực vật của Câu kỷ tử Fructus... .23 3.2 Kết khảo sát điều kiện chiết xuất alkaloid 24 3.2.1 Khảo sát pH acid .24 3.2.2 Khảo sát dung môi hữu chiết alkaloid base 24 3.2.3 Khảo sát pH kiềm