Nghiên cứu mối liên quan nhân quả và tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae) dựa trên hiệu suất chiết cao và hàm lượng các chất điểm chỉ ginsenosid-Rg1 (G-Rg1), majonosid-R2 (M-R2) và ginsenosid-Rb1 (G-Rb1).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT SÂM VIỆT NAM Trần Thị Thu Vân*, Nguyễn Đức Hạnh**, Đỗ Quang Dương**, Nguyễn Minh Đức**,*** TÓMTẮT Mục tiêu: Nghiên cứu mối liên quan nhân tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae) dựa hiệu suất chiết cao hàm lượng chất điểm ginsenosid-Rg1 (G-Rg1), majonosid-R2 (M-R2) ginsenosid-Rb1 (G-Rb1) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Mười bốn thí nghiệm chiết xuất Sâm Việt Nam khô phương pháp đun hồi lưu thiết kế phần mềm Design-Expert 6.0.6 nhằm khảo sát ảnh hưởng biến độc lập (độ cồn, số lần chiết tỷ lệ dung môi/dược liệu) biến phụ thuộc (hiệu suất chiết cao, hàm lượng chất điểm G-Rg1, M-R2 G-Rb1) Hàm lượng G-Rg1, M-R2 G-Rb1 mẫu thử xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Mối liên quan nhân biến độc lập biến phụ thuộc khảo sát, sử dụng phần mềm BCPharSoft OPT Quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam tối ưu xác định với yêu cầu hiệu suất chiết cao, hàm lượng chất điểm G-Rg1, MR2 G-Rb1 đồng thời mức tối đa Kết quả: Cả ba biến độc lập (số lần chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu độ cồn) ảnh hưởng đến biến phụ thuộc Số lần chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu độ cồn tối ưu quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam 3, 13 trung bình Tại điều kiện chiết xuất tối ưu, hiệu suất chiết cao thu 56,25%, hàm lượng G-Rg1, M-R2 G-Rb1 6,80%, 11,01%, 2,06% Kết luận: Đây nghiên cứu khảo sát mối liên quan nhân tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sâm Việt Nam, tạo tiền đề cho việc nâng cao chất lượng cao Sâm Việt Nam sản phẩm liên quan Từ khóa: Panax vietnamensis, Sâm Việt Nam, quy trình chiết xuất, liên quan nhân ABSTRACT OPTIMIZATION OF VIETNAMESE GINSENG EXTRACTION CONDITIONS Tran Thi Thu Van, Nguyen Duc Hanh, Do Quang Duong, Nguyen Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 ‐ No 2‐ 2019: 242‐248 Objectives: This study aimed at the cause-effect relations and optimization of Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae) extraction process by heat reflux method based on the extraction yield and the contents of ginsenosid-Rg1 (G-Rg1), majonosid-R2 (M-R2) and ginsenosid-Rb1 (G-Rb1) Materials and methods: 14 experiments were designed using Design-Expert 6.0.6 software to investigate the effects of three independent variables (extraction times, solvent/material ratios, ethanol concentrations) on dependent variables (the extraction yield and the contents of G-Rg1, M-R2 and G-Rb1) G-Rg1, M-R2 and G-Rb1 contents were analyzed by using a validated HPLC method The cause-effect relations between the independent and dependent variables were investigated and the optimized extraction process was determined using BCPharSoft OPT software Results: All three independent variables (extraction times, solvent/material ratios and ethanol concentrations) were found to affect all dependent varibles (the extraction yield and the contents of G-Rg1, * Khoa Dược, Đại Học Lạc Hồng Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh *** Khoa Dược, Đại Học Tơn Đức Thắng Tác giả liên lạc: GS TS Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908988820 ** 242 Email: nguyenminhduc@tdtu.edu.vn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học M-R2 and G-Rb1) The optimized extraction times, material/solvent ratio and ethanol concentration of the extraction process were found to be 3, 13 and medium, respectively Conclusion: This study reports for the first time the cause-effect relations and optimization of Vietnamese Ginseng extraction process which is important for producing its high quality extract and the related products Key words: Panax vietnamensis, extraction process, cause-effect relations việc làm cấp thiết Phần mềm ĐẶTVẤNĐỀ thơng minh xây dựng mối liên quan Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et nhân từ liệu thực nghiệm giúp tối Grushv.) thuốc quý, độc đáo ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu Vì vậy, đề đặc hữu Việt Nam, phát vào tài thực nhằm mục tiêu xây dựng quy năm 1973(7) Các cơng trình nghiên cứu khoa trình chiết xuất SVN với hỗ trợ phần học chứng minh Sâm Việt Nam (SVN) có mềm thơng minh cho hiệu suất chiết cao thành phần saponin đặc trưng với hàm hàm lượng saponin quan tâm thu đồng lượng saponin toàn phần khoảng 12‐15% (tính dược liệu khơ), cao thời mức tối ưu loài thuộc chi Panax nghiên cứu ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU giới với nhiều tác dụng dược lý Đối tượng, nguyên liệu hóa chất nghiên cứu công dụng tương tự Nhân sâm (P ginseng Thân rễ rễ củ khô SVN trồng (6 CA Meyer)(6,7) Do vậy, giá trị kinh tế mà tuổi), chất đối chiếu ginsenosid‐Rb1 (hàm SVN mang lại lớn lượng 99,17%), ginsenosid‐Rg1 (hàm lượng Nhằm thu tối đa hợp chất có 96,43%) majonosid‐R2 (hàm lượng 98,86%) hoạt tính sinh học từ dược liệu, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí khâu quan trọng cần đầu tư Minh cung cấp Acetonitril, methanol nước nghiên cứu quy trình chiết xuất Kỹ thuật cất đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC chiết xuất cần phải linh hoạt, đơn giản, an Phương pháp chiết xuất SVN toàn hiệu mặt kinh tế Trong Mẫu g bột SVN (kích thước 0,5‐1,0 mm) nghiên cứu chiết xuất saponin từ dược liệu chiết xuất phương pháp đun hồi thuộc chi Panax, có nhiều phương pháp lưu có khuấy trộn nhiệt độ 60 ± 2oC Thời đại cho hiệu tốt, tiết kiệm thời gian gian lần chiết Các thông số nồng chiết xuất có hỗ trợ vi sóng, chiết xuất độ ethanol, số lần chiết tỷ lệ dung xung điện trường, chiết áp suất cao, môi/dược liệu thay đổi theo thiết kế chiết hệ thống tăng tốc dung mơi(1,3,4,5) Tồn dịch chiết lần 1, lần lần Tuy nhiên, phương pháp chưa gộp lại, cô cách thủy sấy chân áp dụng rộng rãi điều kiện thực tế để thu cao khô sản xuất Việt Nam Phương pháp chiết Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa xuất hồi lưu phương pháp phổ biến 14 thí nghiệm thiết kế phần nhiều nhà máy đầu tư cho mềm Design‐Expert 6.0.6 (Stat‐Ease Inc., Mỹ) dây chuyền sản xuất cao thuốc thuốc theo mơ hình D‐optimal với mức yêu có nguồn gốc dược liệu Việc xây dựng cầu biến độc lập biến phụ thuộc quy trình chiết xuất tối ưu cho dược liệu nói trình bày Bảng chung dược liệu quý SVN nói riêng Chuyên Đề Dược 243 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 1: Ý nghĩa mức biến theo thiết kế D-optimal Phương pháp định lượng đồng thời G-Rb1, G-Rg1 M-R2 cao SVN HPLC Biến độc lập Mức Mức Mức X1: Độ cồn (%) Thấp Trung bình Cao X2: Số lần chiết X3: Tỷ lệ dung môi/dược liệu 10 25 45 (ml/g) Biến phụ thuộc Điều kiện ràng buộc Y1: Hàm lượng G-Rg1 Tối đa cao (%) Y2: Hàm lượng M-R2 Tối đa cao (%) Y3: Hàm lượng G-Rb1 Tối đa cao (%) Y4: Hiệu suất chiết cao (%) Tối đa Các giá trị Y1, Y2, Y3 xác định phương pháp định lượng đồng thời G‐Rb1, G‐Rg1 M‐R2 cao khô SVN thu phương pháp xác định hiệu suất chiết cao Cân xác khoảng 40 mg cao khơ SVN, cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng ml methanol 70%, siêu âm 10 phút, để yên 10 phút, thêm dung môi vừa đủ 10 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần lấy kết trung bình lần thử nghiệm Sử dụng phần mềm BCPharSoft OPT (Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ) để nghiên cứu mối liên quan nhân tối ưu hóa quy trình chiết xuất Quy trình chiết xuất tối ưu thực nghiệm kiểm chứng lặp lại lần Áp dụng trắc nghiệm t (one‐sample t test) để so sánh kết thực nghiệm với kết dự đoán Phương pháp xác định hiệu suất chiết cao Dịch chiết lần chiết gộp chung, trộn lọc thu thể tích dịch chiết V (ml) Lấy 50 ml dịch lọc cô bếp cách thủy đến cắn khô Cắn tiếp tục sấy 105oC giờ, để nguội bình hút ẩm thời gian 30 phút xác định khối lượng cao m (g) Hiệu suất chiết cao Y4 (%) xác định phương trình sau: đó, M (g) khối lượng SVN khô mAU Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC Agilent Infinity 1260 (Mỹ), đầu dò DAD Ct Zorbax Eclipse PlusC18 (150 ì 4,6 mm; àm) Thể tích tiêm mẫu 20 µl Tốc độ dòng: ml/phút Nhiệt độ cột 30oC Bước sóng phát 196 nm Pha động bao gồm nước (A) acetonitril (B) với chương trình rửa giải gradient dung mơi B: 0‐15 phút (19,5‐30%); 15‐35 phút (30‐40%); 35‐40 phút (40‐95%); 40‐55 phút (95%); 55‐56 phút (95‐19,5%); 56‐66 phút (19,5%) KẾTQUẢ Phương pháp định lượng đồng thời G-Rb1, G-Rg1 M-R2 cao SVN HPLC Quy trình định lượng đồng thời G‐Rb1, G‐Rg1 M‐R2 cao SVN HPLC thẩm định theo hướng dẫn ICH, đạt yêu cầu phương pháp phân tích (tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại độ đúng) với sắc ký đồ HPLC trình bày Hình G-Rg1 300 200 100 G-Rb1 M-R2 10 20 30 Hình 1: Sắc ký đồ HPLC định lượng đồng thời G-Rg1 (Rt =10,12 phút), M-R2 (Rt =16,02 phút) G-Rb1 (Rt =22,15 phút) cao SVN 244 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Mơ hình thực nghiệm, tương quan hồi quy biến độc lập biến phụ thuộc Bảng 2: Kết thực nghiệm theo mơ hình D-Optimal Thí nghiệm 10 11 12 13 14 Biến độc lập x1 x2 Thấp Trung bình Trung bình Cao Cao Trung bình Thấp Thấp Trung bình Thấp Trung bình Thấp Cao Cao x3 25 40 40 40 40 10 40 10 25 10 10 25 25 10 y1 6,8132 6,7026 6,6102 7,1590 7,0805 6,9583 6,7208 6,8629 7,0121 6,4946 6,8377 6,6508 7,1427 7,5178 y2 10,9642 11,2211 10,7700 12,3712 11,5822 11,5507 11,2202 10,9421 11,5313 10,4128 11,1164 10,0965 11,3884 12,2663 Biến phụ thuộc y3 2,0043 2,0420 1,9906 2,1789 2,1265 2,0730 2,0226 2,0382 2,1510 1,9652 2,0414 1,9950 2,1615 2,2331 y4 56,7481 55,4320 57,2433 52,0320 53,0378 53,3018 56,5129 55,0954 53,0406 58,1668 54,4321 58,0160 52,2532 50,1850 Ghi chú: Y = giá trị trung bình ± SD Dữ liệu 14 thử nghiệm (Bảng 2) chọn làm đầu vào cho phần mềm BCPharSoft OPT để khảo sát liên quan nhân tối ưu hóa quy trình chiết xuất SVN Mơ hình hóa Điều kiện: ‐ Nhóm thử (Y1(3,5), Y2(5,10), Y3(3,4), Y4(4,12)) ‐ Thuật toán: Back Propagation Learning Kết tương quan hồi quy phương pháp tối ưu hóa thể mức độ liên quan nhân trình bày Bảng Bảng 3: Đánh giá mơ hình nhân quy trình chiết xuất cao SVN Biến phụ thuộc R luyện R thử Y1 0,98 0,98 Y2 0,98 0,99 Y3 0,99 0,98 Y4 1,00 0,98 Các giá trị R2 luyện R2 thử từ 0,98 – 1,00 nên mơ hình dự đốn xây dựng từ phần mềm BCPharSoft OPT tốt Mơ hình sử dụng làm sở để khảo sát liên quan nhân‐quả, tối ưu hóa dự đốn biến phụ thuộc Tối ưu hóa Điều kiện: ‐ Ràng buộc (đối với Xi): số nguyên dương Chuyên Đề Dược ‐ Hàm mục tiêu (đối với Yi): Y1, Y2, Y3 Y4 yêu cầu tối đa Quy luật nhân liên quan Kết từ biểu đồ 3D cho thấy mức độ ảnh hưởng yếu tố khảo sát tính chất sản phẩm Qua đó, số quy luật rút sau: Đối với hàm lượng G‐Rg1 (Y1): Nếu X1 (nồng độ ethanol) tăng Y1 tăng; X1 cao X3 cao Y1 trung bình; X2 = X3 trung bình Y1 cao; X2 = X3 cao thấp Y1 trung bình; X2 = Y1 thấp (Hình 2) Đối với hàm lượng M‐R2 (Y2): Nếu X1 tăng Y2 tăng; X2 = Y2 cao; X2 = Y2 thấp (Hình 3) Đối với hàm lượng G‐Rb1 (Y3): Nếu X1 tăng Y3 tăng; X1 cao X3 cao Y3 trung bình; X3 trung bình Y3 cao; X3 cao thấp Y3 thấp (Hình 4) Đối với hiệu suất chiết (Y4): Nếu X1 tăng Y4 giảm; X2 = X3 trung bình Y4 thấp; X2 = X3 trung bình hay cao Y4 cao (Hình 5) 245 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Hình 2: Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hàm lượng G-Rg1 (Y1) Hình 3: Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hàm lượng M-R2 (Y2) Hình 4: Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hàm lượng G-Rb1 (Y3) Hình 5: Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hiệu suất chiết cao (Y4) 246 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin lại tăng lên Điều phù hợp với Điều kiện chiết xuất tối ưu giá trị dự đoán biến Y phần mềm BCPharSoft OPT trình bày Bảng nghiên cứu Kwon J H cộng (2003), Bảng 4: Điều kiện chiết xuất tối ưu giá trị dự đoán biến Y saponin toàn phần cao nồng độ 60‐75%; Kết tối ưu Giá trị dự đoán X1 X2 X3 Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) Giá trị Trung 13 6,675 10,880 2,034 56,368 bình Biến số Thực lặp lại lần quy trình chiết xuất tối ưu Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0 để so sánh kết thực nghiệm kết dự đốn Kết thống kê trình bày Bảng Bảng 5: So sánh kết dự đoán thực nghiệm kiểm chứng (n=3) Kết Y1 (%) Y2 (%) Y3 (%) Y4 (%) Thực 6,80 ± 0,11 11,01 ± 0,08 2,06 ± 0,04 56,25 ± 1,05 nghiệm Dự đoán 6,675 10,880 2,034 56,368 kết cho thấy hiệu suất chiết ginsenosid tối ưu nồng độ ethanol 45‐60% hàm lượng hay báo cáo Kim SJ cộng (2007) hiệu suất chiết cao Nhân Sâm đạt tối ưu chiết nước ethanol 70% cho hàm lượng ginsenosid tăng lên đáng kể(2,4) Bởi nồng độ ethanol thấp tạp chất phân cực chất nhầy, tinh bột, đường, dễ dàng di chuyển khỏi dược liệu, làm gia tăng khối lượng dịch chiết, dẫn đến làm tăng hiệu suất chiết Khi tăng nồng độ ethanol, khả hòa tan chọn lọc dung môi tăng, nên hàm lượng saponin (độ phân cực trung bình) tăng lên Thực nghiệm cho thấy Trắc nghiệm t (Bảng 5) cho thấy kết dự nồng độ ethanol cao, hàm lượng ginsenosid đoán kết kiểm chứng khác không tăng lên đáng kể hiệu suất chiết thấp có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, kết nồng độ thấp trung bình Do đó, để cân thực nghiệm chứng điều kiện chiết xuất hiệu suất chiết chất lượng cao tối ưu phù hợp với kết dự đoán phần chiết, quy trình chiết xuất tối ưu xây dựng từ mềm BCPharSoft OPT phần mềm phù hợp Các kết thực BÀNLUẬN Phương pháp chiết hồi lưu có khuấy trộn (thiết bị chiết đa năng) áp dụng nhiều cơng nghiệp tính hiệu quả, nhanh nghiệm kiểm chứng có tính lặp lại phù hợp với kết dự đoán từ phầm mềm BCPharSoft OPT KẾTLUẬN chóng, tiêu thụ dung mơi Giá thành Thơng số tối ưu quy trình chiết xuất thiết bị công nghiệp không đắt Các SVN xác định nồng độ ethanol trung saponin bền điều kiện nhiệt độ chiết bình, số lần chiết tỷ lệ dung môi/dược xuất nóng hồi lưu nên phương pháp khả liệu 13 quy trình chiết xuất đạt tối ưu thi điều kiện sản xuất Việt Nam đồng thời hiệu suất chiết (56,25%) hàm Xem xét mối quan hệ biến độc lập biến phụ thuộc biểu đồ 3D cho thấy ảnh hưởng nồng độ ethanol hiệu suất chiết hàm lượng saponin khảo sát đáng kể Khi tăng nồng độ ethanol hiệu suất chiết giảm dần, hàm lượng Chuyên Đề Dược lượng saponin khảo sát (hàm lượng G‐Rg1, M‐R2 G‐Rb1 6,80%, 11,01% 2,06%) Quy trình chiết xuất tối ưu đạt đóng vai trò quan trọng việc nâng cao hiệu suất chất lượng dịch chiết, nâng cao chất lượng cao SVN thu 247 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 TÀILIỆUTHAMKHẢO Hou J, He S, Ling M, Li W, Dong R, Pan Y, Zheng Y (2010), “A method of extracting ginsenosides from Panax ginseng by pulsed electric field”, J Sep Sci, 33(17‐18), pp.2707‐2713 Kim SJ, Murthy HN, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2007), “Parameters affecting the extraction of ginsenosides from the adventitious roots of ginseng (Panax ginseng CA Meyer)”, Sep Purif Technol, 56(3), pp.401‐406 Kwon JH, Bélanger JM, Paré JJ (2003), “Optimization of microwave‐assisted extraction (MAP) for ginseng components by response surface methodology”, J Agric Food Chem, 51(7), pp.1807‐1810 Kwon JH, Lee GD, Bélanger JM, Jocelyn Paré JR (2003), “Effect of ethanol concentration on the efficiency of extraction of ginseng saponins when using a microwave‐assisted process (MAP™)”, Int J Food Sci Technol, 38(5), pp.615‐622 248 Lee HS, Lee HJ, Yu HJ, Ju DW, Kim Y, Kim CT (2011), “A comparison between high hydrostatic pressure extraction and heat extraction of ginsenosides from ginseng (Panax ginseng CA Meyer)”, J Sci Food Agric, 91(8), pp.1466‐1473 Nguyễn Thượng Dong (2003),“Nghiên cứu phát triển Sâm Việt Nam”, Dược liệu, 8(2), pp.59‐60 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam số thuốc thuộc họ Nhân sâm, Nhà xuất khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 Chuyên Đề Dược ... mối liên quan Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et nhân từ liệu thực nghiệm giúp tối Grushv.) thuốc quý, độc đáo ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu Vì vậy, đề đặc hữu Việt Nam, phát vào... suất chiết cao (Y4) 246 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin lại tăng lên Điều phù hợp với Điều kiện chiết xuất. .. nhân tối ưu hóa quy trình chiết xuất SVN Mơ hình hóa Điều kiện: ‐ Nhóm thử (Y1(3,5), Y2(5,10), Y3(3,4), Y4(4,12)) ‐ Thuật toán: Back Propagation Learning Kết tương quan hồi quy phương pháp tối ưu