Bài viết nghiên cứu xác định các thông số tối ưu cho quá trình làm giàu tinh bột kháng bằng Enzyme Pullulanaza từ đậu xanh có hàm lượng Amyloza cao và xác định sự thay đổi về một số tính chất hóa lý của tinh bột thu được.
KHOA H C CƠNG NGH T I U HĨA CÁC Y1U T &NH H 'NG 1N QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU TINH B T KHÁNG VÀ S THAY [I M T S TÍNH CH T LÝ-HĨA T] TINH B T NU XANH CÓ HÀM L 0NG AMYLOZA CAO BWNG ENZYME PULLULANAZA Nguy„ Nguy„n Th Mai H2_ng H2_ng1, Phan Ng… Ng…c Hòa Hòa2, Ph m V#n Hùng3 TĨM T T MRc tiêu cPa nghiên c u nhcm xác - nh thơng sT tTi 2u cho q trình làm giàu tinh b6t kháng (Resistant Starch-RS) bcng enzyme pullulanaza (thXi gian thPy phân, nkng -6 enzyme, tJ l tinh b6t: n23c) tg -7u xanh có hàm l2>ng amyloza cao xác - nh s` thay -^i vB m6t sT tính chDt lý-hóa cPa tinh b6t thu -2>c (hàm l2>ng tinh b6t kháng enzyme, hàm l2>ng amyloza, hình d ng, kích th23c, cDu trúc tinh th5, m c -6 polyme hóa, kh< n#ng tr2_ng nG) GiTng -7u xanh DX044 -2>c l`a ch…n tg n#m giTng ph^ biUn G Vi t Nam có m c amyloza cao nhDt - t 30,44% TTi 2u hóa trình làm giàu v3i ba -iBu ki n vB thXi gian thPy phân tg 8—24 giX, nkng -6 enzyme v3i khoc xác - nh bcng test kit cPa Mega Enzyme, tính chDt lý-hóa -2>c xác - nh tr23c sau làm giàu G -iBu ki n tTi 2u KUt qu< cho thDy, mQu -7u xanh DX044 tTi 2u t i -iBu ki n 17,5 giX thPy phân; nkng -6 enzyme 45U/g; tJ l tinh b6t: n23c 1:20; v3i RS tTi 2u 60,98% (t#ng gDp -ôi so v3i tr23c làm giàu) Hàm l2>ng amyloza t#ng lên tg 30,44%-60,47%, hàm l2>ng tinh b6t kháng dao -6ng tg 23,5 -Un 57,95% CDu trúc tinh th5 lo i C cho c< mQu tr23c sau làm giàu Hình d ng thay -^i tg d ng h t sang d ng khTi kUt tinh DPn gic Tg khóa: TTi 2u hóa, pullulanaza enzyme, tinh b6t -7u xanh, tinh b6t kháng, tính chDt lý hóa M /U Tinh b6t kháng enzyme tiêu hóa (Resistant Starch-RS) lo i tinh b6t có kh< n#ng kháng l i s` thPy phân cPa enzyme h tiêu hóa, chúng -óng m6t vai trò quan tr…ng vi c ng#n ngga s` tích tR m†, làm ging RS thu6c nhóm rDt rDt d„ b biUn -^i bGi nhi t, RS3 lo i biUn tính ch u nhi t -2>c 2u tiên sl dRng, RS4 lo i biUn tính hóa h…c nên vi c ng dRng vào th`c phEm d2>c phEm b h n chU (A P Nugent et al., 2005; Englyst et al., 1992) NhiBu nghiên c u -ã ch] rcng có mTi liên h ch t gi0a hàm l2>ng amyloza nguyên li u ban -9u -Un hàm l2>ng RS2 c< biUn tính bcng v7t lý sinh h…c -5 t o RS3 nh2ng G m c -6 khác tác -6ng khác tùy bi n pháp biUn tính (Birkett AM, & Brown IL (2008), NÔNG NGHIệP Và PHáT TRIểN NÔNG THÔN - kỳ - Tháng 3/2018 KHOA H C CÔNG NGH Sievert, D., & Pomeranz, Y (1989) Tinh b6t -7u xanh lo i có ch a hàm l2>ng amyloza cao, khong tinh b6t kháng khiêm tTn MRc tiêu cPa nghiên c u nhcm xác - nh thông sT tTi 2u cho trình làm giàu tinh b6t kháng bcng enzyme pullulanaza tg -7u xanh có hàm l2>ng amyloza cao xác - nh s` thay -^i vB m6t sT tính chDt lý-hóa cPa tinh b6t thu -2>c -5 làm c_ sG cho nghiên c u phát tri5n ng dRng tiUp theo V#T LI$U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Nguyên li u 7u xanh sl dRng nghiên c u gkm lo i giTng: DX044, VN123, DX108, VN07, TN182 -2>c cung cDp bGi Trung tâm Nghiên c u Phát tri5n -7u -n thu6c Vi n Cây l2_ng th`c Cây th`c phEm Vi t Nam Tinh b6t -7u xanh DX044 -2>c tách d`a theo ph2_ng pháp cPa Hung c6ng s` (2013) v3i m6t vài thay -^i nhs t i phòng thí nghi m Tr2Xng - i h…c Cơng nghi p thành phT Hk Chí Minh Tinh b6t -7u xanh có ch] tiêu nh2 -6 tinh khiUt: 98,45%; Em: 8.56%; amyloza: 30,44; hàm l2>ng RS: 11,34% -2>c bc sDy khô G 450C 24h -5 thu l i tinh b6t sau làm giàu (-6 Em khong RS tinh b6t -2>c -o bcng test kit cPa Megaenzyme d`a quy trình xác - nh RS -2>c tiUn hành theo ph2_ng pháp AOAC 2002.02: MQu tinh b6t -5 khô G nhi t -6 phòng, cân xác 100±5 mg B^ sung ml enzyme gkm α-amylaza (10U/ml) amyloglycosideaza (3U/ml), P 16h G nhi t -6 37OC tP lfc (200 vòng/phút) Thêm 4ml ethanol 99% lfc m nh, ly tâm 1500 vòng/phút 10 phút Lo i bs d ch, b^ sung thêm 2ml ethanol 50%, tr6n -Bu sau -ó b^ sung tiUp 6ml ethanol 50% ly tâm 1500 vòng/phút 10 phút (l p l i l9n) Tách bs ph9n d ch, b^ sung 2ml KOH 2M vào ph9n c n, lfc -Bu cTc n23c l nh 20 phút, thêm 8ml - m natriacetate 1,2M (pH=3,8) 0,1ml enzyme amyloglycosidaza (300U/ml), P 50OC 30 phút Chuy5n tồn b6 vào bình - nh m c, - nh m c 100ml Hút 0,1ml tg bình - nh m c vào Tng nghi m, b^ sung thêm 3ml thuTc thl glucoza oxidaza/peroxidaza (GOPOD) P G 50OC 20 phút Sau -ó mang -i -o OD G b23c sóng 510 nm Hàm l2>ng RS -2>c tính theo cơng th c: RS (g//100g mQu) = ∆E x F x 100/0,1 x 1/1000 x 1/W x 162/180 = ∆E x x 90 Trong -ó: ∆E: -6 hDp thu cPa mQu F: giá tr cPa chuy5n -^i giá tr hDp thu tg µg glucoza, F = 100µg glucoza/giá tr hDp thu cho 100µg glucoza ml) 100/0,1: hi u ch]nh th5 tích (0,1 ml lDy tg 100 1/1000: chuy5n -^i tg microgram sang miligram NÔNG NGHIệP Và PHáT TRIểN NÔNG THÔN - kỳ - Tháng 3/2018 63 KHOA H C CÔNG NGH W: khTi l2>ng khô cPa mQu, W = khTi l2>ng x [(100 — -6 Em)/100)] Trong -ó: y nkng -6 glucoza (µg/ml); x giá tr -o quang thu -2>c 100/W: ch] sT bi5u th ph9n tr#m RS khTi l2>ng cPa mQu thl LDy ml mQu/glucoza chuEn (5µg/l) rki thêm 0,5ml dung d ch A 0,5ml dung d ch B un sôi 15 phút Làm ngu6i, thêm 2,5 ml dung d ch C yên 20 phút rki -o -6 hDp thu G 715nm 162/180: h sT chuy5n -^i tg glucoza thành tinh b6t - Hàm l2>ng amyloza -2>c xác - nh bcng ph2_ng pháp quang ph^ hDp thu iod theo ch] dQn cPa Takeda Hizukuri (1983) v3i m6t sla -^i nhs Tinh b6t (10 mg, db) -2>c phân tán 0,2 ml ethanol 99% ml n23c cDt, -7y kín -un cách thPy G 1000C phút Sau làm ngu6i -Un nhi t -6 phòng, 0,5 ml dung d ch NaOH 1M -2>c thêm vào dung d ch -2>c hòa tan hồn tồn bcng cách -un cách thPy 10 phút lfc mni phút Sau -ó, huyBn phù -2>c -iBu ch]nh pH 6,5 v3i HCl 1M pha loãng thành 10 ml bcng n23c cDt LDy 0,4 ml dung d ch mQu thêm vào 0,4 ml dung d ch iod 0,2% -iBu ch]nh cho -Un 10 ml bcng n23c cDt Hnn h>p -2>c gi0 G nhi t -6 phòng 1-2h Sau -ó, dung d ch -o -6 hDp phR c`c - i chi th`c hi n vi c quét dc -o theo b23c quy trình cPa Takeda c6ng s` (1983) Xác - nh hàm l2>ng amyloza theo ph2_ng pháp AACC 61-03 (AACC, 1995) v3i m6t sla -^i nhs M6t -2Xng cong hi u chuEn -ã -2>c thiUt l7p sl dRng hnn h>p amyloza amylopectin phân -o n tg tinh b6t lúa mì hàm l2>ng amyloza cao theo ph2_ng pháp Klucinec Thompson (1998) hàm l2>ng amyloza -ã -2>c tính tốn bcng cơng th c: AM (%)=110,78 x BV — 24,481, R2=0,9995 Trong -ó: BV giá tr màu xanh cPa tinh b6t -2>c -o G 620 nm - Hình d ng cDu trúc hi5n vi cPa tinh b6t -7u xanh -2>c xác - nh thơng qua hình c phân tích bcng ph2_ng pháp nhi„u x tia X (X-ray) ThiUt b -o màu Minolta CR- 300/310 -2>c dùng -5 xác - nh màu cPa tinh b6t chuTi - M c -6 polyme hóa (DPn) -2>c th`c hi n theo ph2_ng pháp cPa Takeda c6ng s` (1981) Ph2_ng trình -2Xng chuEn glucoza nh2 sau: y=18,29x + 0,0287 (R2=0,9972) 64 Dung d ch A: 1g K3Fe(CN)6 pha lit n23c cDt, -2a vB pH 9,5 v3i KOH 1N Dung d ch B: 4,8g Na2CO3; 9,2g NaHCO3; 0,65g KCN - nh m c lên lít v3i n23c cDt Dung d ch C: 3g FeNH4(SO4)2.12H2O; 2,72ml H2SO4 -7m - c, - nh m c lên lít v3i n23c cDt - Kh< n#ng tr2_ng nG cPa tinh b6t -2>c xác - nh theo ph2_ng pháp cPa Sasaki Matsuki (1988) -2>c mô t< bGi Hung Morita (2005) Cho 0,16g tinh b6t -2>c chuEn b Tng nghi m 5ml dung d ch AgNO3 0,1% -2>c thêm vào thay cho n23c cDt -5 vô ho t enzyme α-amylaza Sau -ó, hnn h>p -2>c lfc -Bu 10 phút, -un cách thPy G nhi t -6 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC 10 phút TiUp theo, hnn h>p -2>c làm ngu6i nhanh bcng n23c l nh phút ly tâm tách n23c phút v3i tTc -6 ly tâm 1700 vòng/ phút CuTi cùng, khTi l2>ng ph9n lfng -…ng Tng ly tâm -2>c cân, kh< n#ng tr2_ng nG -2>c xác - nh ph9n lfng -…ng l i so v3i mQu ban -9u (g/g) 2.4 Ph2_ng Ph2_ng pháp xl xl lý lý sT sT li u - ST li u trung bình cPa l9n l p l i thí nghi m KUt qu< -2>c phân tích thTng kê ph9n mBm Microsoft Excel Statgaphics v3i p < 0,05 - Ph9n mBm Modde 5: thiUt kU th`c nghi m tTi 2u hóa, xl lý sT li u tTi 2u hóa -2a ph2_ng trình hki quy K T QU VÀ TH O LU#N 3.1 KU KUt qu< qu< tT tTi 2u hóa q trình trình làm giàu tinh b6t kháng tinh b6 b6t amyloza cao (DX044) KUt qu< tTi 2u hóa làm giàu tinh b6t kháng v3i tinh b6t -7u xanh có hàm l2>ng amyloza cao -2>c th5 hi n qua bc là: Y = 57,22 + 5,77X1 + 7,39X2 — 10,64X12 — 5,90X22 — 2,01X1X2 Theo ph2_ng trình hki quy, biUn X3, X32, X1X3, X2X3 khơng có ý nghya thTng kờ Cỏc thụng sT R2, Q2 NÔNG NGHIệP Và PHáT TRIểN NÔNG THÔN - kỳ - Th¸ng 3/2018 KHOA H C CƠNG NGH p-value thsa mãn -iBu ki n -2>c -2a Trong -ó, nkng -6 yUu tT có s c 0,9, Q2>0,6 (J Gabrielsson c6ng s`, 2002) nên ph2_ng trình hki quy t2_ng thích v3i sT li u th`c nghi m -ã có (Hình 1) k th mơ t< mTi t2_ng quan cPa yUu tT khc trình bày G hình Thơng sT tTi 2u cPa mơ hình - t G thXi gian: 17,5h; nkng -6: 45U/g t] l tinh b6t: n23c 1:20 Giá tr RS cao nhDt - t -2>c 60,98% Theo hình 2, hàm l2>ng RS - t cao nhDt nkng -6 thXi gian t2_ng tác t i nh0ng -i5m có màu -s t i v trí uTn cong cPa bB m t -áp ng Khi thXi gian thPy phân cPa enzyme thDp nkng -6 enzyme thPy phân phc kUt qu< cao Ki5m tra tính xác cPa ph2_ng trình hki quy, kUt qu< thu -2>c hàm l2>ng RS 61,35% sT li u tính tốn mơ hình 60,98% (png amyloza m c -6 polyme hóa (DPn) Ch] tiêu Hàm l2>ng amyloza (%) tr23c làm giàu Hàm l2>ng amyloza (%) sau làm giàu DPn tr23c làm giàu (-_n v Glucoza) DPn sau làm giàu (-_n v Glucoza) MQu tinh b6t DX044 30,44±0,65 67,15±1,79 36 Tr23c làm giàu, m c -6 trùng h>p l…ai tinh b6t -7u xanh l3n, mni nhánh trung bình có 36 -_n v glucoza Sau b b“ nhánh bGi enzyme pullulanaza, kích th23c chuni glucoza ging amyloza tg 30,44% lên 67,15%, sau thối hóa, kh< n#ng kUt tinh t o xofn kép cPa amyloza cao, qua -ó làm giàu hàm l2>ng RS 3.2.2 KUt qua chRp SEM Hình Hình chR chRp ZAM h t tinh b6 b6t DX044 tr2 tr23c sau làm giàu KUt qu< chRp SEM cPa tinh b6t tr23c sau làm giàu -2>c mô t< hình Tinh b6t -7u xanh t` nhiên có nhiBu hình d ng khác nhau, kích th23c nhs tg 7,75 -13,3µm, bB m t tr_n láng KUt qu< phù h>p v3i nghiên c u cPa El-Sayed Ali Abdel-Rahman c6ng s` (2008) Kích th23c nhs g…n v3i bB m t nh”n m n nh0ng tiêu chí kh•ng - nh kh< n#ng kháng cPa tinh b6t -7u xanh kh< n#ng tiUp xúc v3i enzyme tiêu hóa khó kh#n h_n Tuy nhiên tinh b6t sau làm giàu th5 hi n bB m t gk ghB -óng vón, kUt dính iBu cho thDy -ã có s` xofn cPa m ch amyloza kUt dính ch t v3i t o khTi v7y tính kháng cPa tinh b6t t#ng lên 3.2.3 KUt qua chRp X-ray 66 KUt qu< chRp XRD cPa lo i h t tinh b6t -7u xanh tr23c sau làm giàu xuDt hi n peak -_n G 50, 110, 150, peak kép G 180 220 (Hình 4) cho thDy tinh b6t -7u xanh khc chia thành giai -o n rõ r t: giai -o n tr2_ng nG ch7m tg 500C -Un 600C giai -o n tr2_ng nG rDt nhanh tg 600C -Un 900C Sau làm giàu, kUt qu< cho thDy kh< n#ng tr2_ng nG ging amyloza m ch amyloza t o sau -2>c b“ nhánh bcng pullalaza có s` tái sfp xUp l i t o vùng kUt tinh hoàn hng amyloza nhiBu h_n sh tr2_ng nG ch7m h_n so v3i h t tinh b6t giàu amylopectin (Colonna & Mercier, 1985) Quá trình tr2_ng nG cPa tinh b6t sau làm giàu cing -2>c chia làm pha rõ r t h_n so v3i tinh b6t tr23c làm giàu K T LU#N Thông sT tTi 2u cho mQu DX044 45U/g; 17,5h thPy phân; tJ l tinh b6t: n23c 1:20 Hàm l2>ng RS cao nhDt - t -2>c 60,98% Tinh b6t tr23c sau làm giàu -Bu có cDu trúc tinh th5 lo i C Hình d ng thay -^i tg d ng h t sang d ng khTi kUt tinh DPn ging amyloza (%) tr23c làm giàu Hàm l2>ng amyloza (%) sau làm giàu DPn tr23c làm giàu (-_n v Glucoza) DPn sau làm giàu. .. nghi m tTi 2u hóa, xl lý sT li u tTi 2u hóa -2a ph2_ng trình hki quy K T QU VÀ TH O LU#N 3.1 KU KUt qu< qu< tT tTi 2u hóa trình trình làm giàu tinh b6t kháng tinh b6 b6t amyloza cao (DX044) KUt