Cây Diệp hạ châu (Chó đẻ) dần dần trở thành một cái tên dược liệu phổ biến rộng khắp trong nhân dân vì tiếng lành đồn xa rằng cây này trị bệnh gan rất tốt. Trong quá trình tìm hiểu chúng tôi đã được nghe kể nhiều về các trường hợp trị khỏi bệnh gan mãn tính nhờ uống Diệp hạ châu. Có thể mua uống dưới dạng cây tươi, dược liệu khô, các sản phẩm thuốc điều trị hỗ trợ trên thị trường. Ngày càng có nhiều chế phẩm từ dược liệu mà thành phần chính là Diệp hạ châu được sản xuất và bán rộng rãi. Y học hiện đại cũng đã chứng minh các thành phần trong cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn có công dụng hữu ích trong điều trị viêm gan, làm sạch kháng nguyên bề mặt HbsAg, tăng hoạt tính của enzyme gan, ít độc với cơ thể. Chi Phyllanthus còn có nhiều cây có tác dụng làm thuốc như Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus emblica L., Phyllanthus niruri L,… Đặc biệt là thành phần lignan (phyllanthin và hypophyllanthin) có trong cây P. amarus được cho là có tác dụng chính trong việc bảo vệ tế bào gan, có khả năng chống khối u. Tuy nhiên không phải loài Phyllanthus nào cũng chứa các thành phần này. Hiện nay có rất nhiều chế phẩm từ Phyllanthus trên thị trường nhưng chưa có một phương pháp kiểm nghiệm nào đầy đủ để định tính, định lượng hàm lượng các thành phần lignan có trong các sản phẩm trên thị trường nếu đi mua, và hàm lượng trong từng loài dược liệu Diệp hạ châu nếu chúng ta thu hái về. Uống thuốc không đúng lượng, đúng thuốc càng nguy hiểm hơn không uống, có thể gây những tác hại về sau không kiểm soát được. Trong khuôn khổ bài khóa luận tốt nghiệp chúng tôi đặt vấn đề “Xây dựng quy trình định lượng phyllanthin trong cây Diệp hạ châu đắng (P. amarus) bằng phương pháp HPLC”, với các mục tiêu cụ thể : • Xác định độ tinh khiết của mẫu thu hái. • Khảo sát các điều kiện định lượng phyllanthin trong chi Phyllanthus bằng phương pháp HPLC. • Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC. • Ứng dụng quy trình để định lượng phyllanthin trong một số mẫu thu thập được.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THÙY TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus Schum.et Thonn Euphorbiaceae) KHÓA ḶN TỚT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phớ Hờ Chí Minh – 2009 i ii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .viii DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ .viii CHƯƠNG MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ CHƯƠNG TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1 Vị trí phân loại của chi/loài 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Vị trí phân loại 1.2 Giới thiệu về loài 1.2.1 Sơ lược về loài Diệp hạ châu 1.2.2 Phân biệt loài Diệp hạ châu TỔNG QUAN VẾ HÓA HỌC .6 2.1 Lignan 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Cấu trúc 2.1.3 Phân bố thực vật 2.1.4 Tác dụng dược lý 2.1.5 Lignan chi Phyllanthus 2.2 Alkaloid 2.3 Tannin 2.4 Flavonoid .10 2.5 Các chất khác 10 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG .10 3.1 Tác dụng dược lý 10 3.2 Công dụng 12 3.2.1 Công dụng y học cổ truyền 12 3.2.2 Các bài thuốc trị bệnh gan 13 3.2.3 Sản phẩm thị trường 13 iii CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM .15 4.1 Định tính 15 4.2 Định lượng 16 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) 18 5.1 Định nghĩa 18 5.2 Cấu tạo .18 5.3 Ứng dụng HPLC kiểm nghiệm, nghiên cứu, dược liệu và hợp chất tự nhiên 19 5.3.1 Định tính dược liệu và hợp chất tự nhiên [20] 19 5.3.2 Định lượng dược liệu và hợp chất tự nhiên 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21 1.1 Nguyên liệu 21 1.2 Dung môi hóa chất 21 1.3 Trang thiết bị và vật liệu nghiên cứu 21 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nghiên cứu thực vật học .22 2.2 Nghiên cứu hóa học .22 2.3 Xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin 22 2.3.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất định lượng phyllanthin P amarus HPLC 22 2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 2.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin P amarus HPLC 23 2.3.5 Định lượng loài Phyllanthus thu thập 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT HỌC 24 1.1 Đặc điểm hình thái 24 1.1.1 Diệp hạ châu đắng (P amarus) 24 1.1.2 Diệp hạ châu cưa (P urinaria) 24 1.1.3 Diệp hạ châu (P sp.) 24 1.2 Đặc điểm giải phẫu 26 1.2.1 Lỗ khí 26 1.2.2 Vi phẫu 26 1.2.2.Vi phẫu thân 27 THỬ TINH KHIẾT 27 iv XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN 28 3.1 Khảo sát quy trình định lượng phyllanthin 28 3.1.1 Xây dựng đường cong chuẩn 28 3.1.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống của chuẩn 29 3.2 Khảo sát dung môi chiết 29 3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 30 3.3.1 Khảo sát tốc độ dòng 30 3.3.2 Khảo sát tỉ lệ dung môi .32 3.4 Khảo sát phương pháp chiết 34 3.5 Khảo sát lần chiết 34 3.6 Quy trình chiết Phyllanthin từ P amarus .35 3.7 Thẩm định quy trình định lượng lignan phương pháp HPLC 37 3.7.1 Khảo sát tính tuyến tính 37 3.7.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống .37 3.7.3 Khảo sát độ lặp lại 37 3.5.4 Khảo sát độ 38 3.8 Quy trình định lượng lignan từ P amarus 42 3.8.1 Chuẩn bị mẫu 42 3.8.2 Điều kiện sắc ký 42 3.8.3 Tiến hành sắc ký 42 3.8.4 Tính toán kết 42 3.9 Định lượng loài thuộc chi Phyllanthus thu thập 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI 45 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ KẾT LUẬN 45 ĐỀ NGHỊ .46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT P amarus : Phyllanthus amarus P urinaria : Phyllanthus urinaria H2O : nước MeOH : Methanol Dd : dung dịch HPLC : High Pressure Liquid Chromatography HP-TLC : High Pressure- Thin Layer Chromatography TB : trung bình SD : độ lệch chuẩn RSD : hệ số phân tán K’ : hệ số dung lượng, N : số đĩa lý thuyết tR : thời gian lưu As : hệ số kéo đuôi S : diện tích đỉnh PP : phương pháp BĐM : bình định mức CHCl3 : cloroform SPE : Solid Phase Extraction PDA : Photo Diod Array Detector H2SO4 : acid sulfuric vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Phân biệt loài Diệp hạ châu [1] Bảng 2.2: Điều kiện chạy phương pháp 16 Bảng 4.3: So sánh kiểu lỗ khí lồi Diệp hạ châu 26 26 Bảng 4.4: So sánh vi phẫu loài Diệp hạ châu 27 Bảng 4.5: So sánh vi phẫu loài Diệp hạ châu 27 27 Bảng 4.6: Kết thử tinh khiết loài Diệp hạ châu 28 Bảng 4.7: Tương quan nồng độ diện tích đỉnh 28 Bảng 4.8: Tính tương thích hệ thống chuẩn 29 Bảng 4.9: Kết so sánh PP chiết .34 Bảng 4.10: Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử 37 Bảng 4.11: Kết độ lặp lại 38 Bảng 4.12: Kết khảo sát cách thêm chuẩn 39 Bảng 4.13: Kết khảo sát cách hòa tan lọc .40 40 Bảng 4.14: Kết khảo sát độ .41 Bảng 4.15: Kết khảo sát độ phục hồi hệ thống 41 vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Sắc ký đồ phương pháp, (2) phyllanthin 17 Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo máy HPLC 18 Hình 4.3.Hình ảnh loài Diệp hạ châu .25 Hình 4.4: Cành mang lồi Diệp hạ châu 25 Hình 4.5: Lỗ khí lồi Diệp hạ châu 26 Hình 4.6: Vi phẫu P.amarus 26 Hình 4.7: Vi phẫu P.urinaria 26 Hình 4.8: Vi phẫu thân lồi Diệp hạ châu 27 Hình 4.9: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,7 ml/phút 31 Hình 4.10: Sắc ký đồ với tốc độ dòng ml/phút 31 Hình 4.11: Sắc ký đồ tốc độ dòng khác nhau: (- ): ml/phút; ( - ): 0,7 ml/phút; 32 ( -): 0,8 ml/phút; ( - ): 0,9 ml/phút .32 Hình 4.12: Sắc ký đồ MeOH:H2O (30:70) 33 Hình 4.13: Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (33:67) 33 Hình 4.14: Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (35:65) 33 Hình 4.15: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại 38 Hình 4.16: Sắc ký đồ 3D P amarus 43 Hình 4.17: Sắc ký đồ mẫu P amarus 44 Hình 4.18: Sắc ký đồ mẫu P sp 44 Hình 4.19: Sắc ký đồ mẫu P urinaria 44 DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Đồ thị đường cong chuẩn phyllanthin 28 Biểu đồ 4.2: Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo dung môi chiết 30 viii Biểu đồ 4.3: Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo số lần chiết 35 Sơ đồ 4.1: Quy trình chiết xuất phyllanthin từ P amarus .36 ix Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang CHƯƠNG MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ Cây Diệp hạ châu (Chó đẻ) trở thành tên dược liệu phổ biến rộng khắp nhân dân vì tiếng lành đồn xa này trị bệnh gan tốt Trong trình tìm hiểu nghe kể nhiều về trường hợp trị khỏi bệnh gan mãn tính nhờ uống Diệp hạ châu Có thể mua uống dưới dạng tươi, dược liệu khô, sản phẩm thuốc điều trị hỗ trợ thị trường Ngày càng có nhiều chế phẩm từ dược liệu mà thành phần chính là Diệp hạ châu sản xuất và bán rộng rãi Y học hiện đại chứng minh thành phần Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn có công dụng hữu ích điều trị viêm gan, làm sạch kháng nguyên bề mặt HbsAg, tăng hoạt tính của enzyme gan, ít độc với thể Chi Phyllanthus có nhiều có tác dụng làm thuốc Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus emblica L., Phyllanthus niruri L,… Đặc biệt là thành phần lignan (phyllanthin và hypophyllanthin) có P amarus cho là có tác dụng chính việc bảo vệ tế bào gan, có khả chống khối u Tuy nhiên loài Phyllanthus nào chứa thành phần này Hiện có nhiều chế phẩm từ Phyllanthus thị trường chưa có phương pháp kiểm nghiệm nào đầy đủ để định tính, định lượng hàm lượng thành phần lignan có sản phẩm thị trường nếu mua, và hàm lượng loài dược liệu Diệp hạ châu nếu thu hái về Uống thuốc không lượng, thuốc càng nguy hiểm không uống, có thể gây tác hại về sau khơng kiểm sốt Trong khn khổ bài khóa luận tốt nghiệp đặt vấn đề “Xây dựng quy trình định lượng phyllanthin Diệp hạ châu đắng (P amarus) phương pháp HPLC”, với mục tiêu cụ thể : • Xác định độ tinh khiết của mẫu thu hái • Khảo sát điều kiện định lượng phyllanthin chi Phyllanthus phương pháp HPLC • Xây dựng quy trình định lượng phương pháp HPLC • Ứng dụng quy trình để định lượng phyllanthin số mẫu thu thập Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang với đỉnh kế cận, nhiên thời gian lưu lại kéo dài (tR 19,77) Kết luận: qua khảo sát thay đổi tỉ lệ pha động tăng dần độ phân cực lên, thấy hệ MeOH: H2O (33:67) cho thông số sắc ký tốt nên chọn hệ này làm hệ pha động cho quy trình định lượng phyllanthin P amarus phương pháp HPLC 3.4 Khảo sát phương pháp chiết Tiến hành khảo sát phương pháp chiết để lựa chọn phương pháp chiết tối ưu cho quy trình chiết xuất phyllanthin từ P amarus PP 1: Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu cho vào bình nón nút mài 250ml, cho tiếp vào bình nón này 10 ml MeOH, ngâm 15 phút Sau đó đặt bếp cách thủy và gắn với hệ thống sinh hàn đun 95 0C 30 phút, lấy xuống, lọc qua dịch chiết lần 1, lập lại lần (các lần sau không cần ngâm 15 phút) Gộp dịch chiết, cô đến cắn Hòa từ từ cắn này cho tan với chính xác 20 ml MeOH, lọc từ từ qua giấy thấm dung môi vào BĐM 20 ml Thực hiện mẫu M1A, M1B, M1C PP 2: Cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, cho tiếp vào bình nón nút mài này 10 ml MeOH, ngâm 15 phút Sau đó đem siêu âm nhiệt độ 600Ctrong 10 phút, lấy ra, lọc qua dịch chiết lần 1, làm lần (các lần sau không cần ngâm 15 phút) Gộp dịch chiết, đến cắn Hòa từ từ cắn với chính xác 20 ml MeOH, lọc từ từ qua giấy thấm dung môi vào BĐM 20 ml Thực hiện mẫu M2A, M2B, M2C Triển khai mẫu máy HPLC, tính toán phần mềm Excel Kết bảng 4.9 Bảng 4.9: Kết so sánh PP chiết PP Mẫu Diện tích (S) PP1 PP2 M1A M1B M1C M2A M2B M2C 18494428 17400010 20440350 18862004 18669995 19242536 TB : 18778262,7; SD : 1539915,1 TB : 18924845; SD : 291397,6 RSD: 8,2% RSD: 1,54% Nhận xét: So sánh RSD của hai PP, nhận thấy PP2 cho RSD thấp hơn, quy trình chiết ít thời gian Vậy chọn PP2 làm PP chiết xuất phyllanthin P amarus để xây dựng quy trình định lượng 3.5 Khảo sát lần chiết Mẫu: cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100ml Chiết 34 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang lần, lần 10ml MeOH Lấy chính xác 5ml dịch chiết của lần chiết pha loãng bình 10ml Lọc qua giấy lọc Triển khai HPLC với điều kiện khảo sát, tính toán hàm lượng phyllanthin có lần chiết So sánh thay đổi hàm lượng của lần chiết sau với lần đầu để chọn số lần chiết phù hợp Biểu đồ 4.3: Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo số lần chiết Nhận xét: tới lần chiết thứ hàm lượng phyllanthin chiết khơng đáng kể, lại ít so với lần trước đó Chọn chiết lần làm số lần chiết cho qui trình chiết mẫu để xây dựng phương pháp định lượng 3.6 Quy trình chiết Phyllanthin từ P amarus Quy trình chiết: Cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, hút 10 ml MeOH cho vào bình nón trên, ngâm 15 phút để dược liệu thấm đều dung môi Đặt bình nón vào máy siêu âm, siêu âm 10 phút với nhiệt độ 60 C Lấy bình nón ra, gạn lọc dịch qua dịch chiết lần 1, dịch đựng cốc có mỏ 50 ml, làm lần (các lần sau không ngâm 15 phút) Gộp dịch chiết, cô đến cắn Hòa từ từ cắn này với chính xác 20 ml MeOH, lọc từ từ qua giấy thấm MeOH vào BĐM 20 ml Dịch lọc định lượng HPLC Dùng kiêm tiêm ml hút dịch chiết của mẫu chuẩn bị lọc qua đầu lọc 0,45µm (Sartorius) 35 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang Sơ đồ 4.1: Quy trình chiết xuất phyllanthin từ P amarus 36 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang 3.7 Thẩm định quy trình định lượng lignan phương pháp HPLC 3.7.1 Khảo sát tính tuyến tính Đã thực hiện mục 3.1.1 3.7.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống Chuẩn bị mẫu: mẫu chuẩn bị mục 3.6 Tiến hành: bơm lần liên tục mẫu thử Tính toán số liệu thống kê Kết trình bày bảng 4.10 Bảng 4.10: Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử Lần bơm tR S K’ As N 15,006 19208441 8,31 1,25 8266 15,112 18903069 8,48 1,21 8198 15,023 18946585 8,52 1,23 8321 15,047 19021576 8,32 1,27 8277 15,128 19132843 8,65 1,24 8311 15,016 18847651 8,44 1,21 8432 TB 15,055 19010028 8,453 1,235 8300,83 SD 0,05 138864,1 0,128 0,023 77,55 RSD (%) 0,35 0,73 1,52 1,9 0,93 Nhận xét: %RSD của thông số sắc ký bao gồm diện tích đỉnh, thời gian lưu tR đều < 2% Các thông số hệ số K’, As, N đều đạt yêu cầu Như tính tương thích hệ thống đối với mẫu thử đạt yêu cầu 3.7.3 Khảo sát độ lặp lại Chuẩn bị mẫu: chiết mục 3.6, chiết mẫu riêng biệt của dược liệu (lá P amarus) Tiến hành: triển khai mẫu HPLC, bơm mẫu lần, lấy số liệu, tính toán thống kê để khảo sát Kết khảo sát bảng 4.11 37 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang Hình 4.15: Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại Bảng 4.11: Kết độ lặp lại TT Khối lượng mẫu thử (g) Diện tích đỉnh (S) Hàm (mg) lượng 0,5001 19005879 0,246 n =6 0,5000 18924768 0,245 p=0,95; t = 2,57 0,5002 17973979 0,233 Xtb = 0,248 0,5001 20146192 0,261 0,5003 18550465 0,240 0,5002 19968572 0,259 SD = 0,01 RSD = 4,35% e = ± 0,01 Nhận xét: phương pháp có độ lăp lại với RSD là 4,35% Với quy định độ lặp lại khoảng nồng độ 0,1-1 mg/ml là 3,7-5,3% [19] thì kết phù hợp 3.5.4 Khảo sát độ Để thực hiện độ đúng, trước đó tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến kết khảo sát độ đúng: khảo sát phương pháp thêm chuẩn, khảo sát phương pháp hòa tan và lọc Tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến kết khảo sát độ 3.5.4.1 Khảo sát phương pháp thêm chuẩn Việc thêm chuẩn vào dược liệu khác có thể ảnh hưởng tới độ phục hồi của quy trình chiết và định lượng nên tiến hành khảo sát phương pháp thêm 38 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang chuẩn khác Pha dung dịch mẹ có nồng độ 1mg/ml, lấy 1,2 ml dd mẹ vào BĐM ml, thêm MeOH cho vừa đủ ml có dd nồng độ 0,24 mg/ml Chuẩn bị mẫu theo cách sau: Cách 1: Cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu vào bình nón nút mài 100 ml, cho vào bình nón này 10 ml MeOH, ngâm 15 phút, tiếp tục thêm vào 0,24 ml dd mẹ Tiến hành chiết xuất theo qui trình ghi sơ đồ Cách 2: Cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, cho vào bình nón nút mài này 10 ml MeOH, ngâm 15 phút, sau đó cho vào ml dung dịch có nồng độ 0,24 mg/ml Chiết xuất theo qui trình ghi sơ đồ Cách 3: Cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, cho trực tiếp 0,24 ml dd mẹ vào bình nón nút mài trên, sau đó cho vào 10 ml MeOH, ngâm 15 phút Chiết xuất theo qui trình ghi sơ đồ Triển khai mẫu này HPLC, tính toán kết Kết khảo sát bảng 4.12 Bảng 4.12: Kết khảo sát cách thêm chuẩn Hàm lượng mẫu thử (mg) Hàm lượng thêm vào (mg) Hàm lượng thu (mg) Tỉ lệ phục hồi (%) Cách 0,215 0,24 257,23 17,6 Cách 0,215 0,24 270,34 23,1 Cách 0,215 0,24 250,6 14,8 Nhận xét: Cách cho chuẩn vào dược liệu có làm dao động kết quả, nhiên ít ảnh hưởng đến kết độ đúng, chưa có độ phục hồi cần thiết Nhận thấy cách cho độ phục hồi cao cách khác Chọn áp dụng cách cho khảo sát độ sau này 3.5.4.2 Khảo sát q trình hòa tan cắn lọc Trong q trình hòa tan cắn và lọc qua giấy (còn cắn khơng tan giấy) vào BĐM 20 ml, lọc giấy có thể làm giữ lại lượng phyllanthin cần lấy lại nên tiến hành khảo sát cách lọc khác Cách 1: Cân chính xác khoảng 0,5 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, cho vào 10 ml MeOH, ngâm 15 phút, cho ml dd chuẩn nồng độ 0,24 mg/ml vào bình nón nút mài Chiết với hỗ trợ của siêu âm 10 phút, gạn lọc qua 39 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang lấy dịch chiết, làm thêm lần nữa, lần 10 ml MeOH Gộp dịch chiết, cô đến cắn Lấy chính xác 20 ml MeOH cho vào bình định mức 20 ml, dùng MeOH này hòa tan cắn từ từ, lọc qua giấy lọc thấm MeOH vào bình định mức 20ml Cách 2: làm cách đến bước cô dịch chiết thành cắn Cắn này hòa tan từ từ chính xác 50 ml MeOH, q trình hòa tan có hỗ trợ siêu âm để cắn tan lại hoàn tồn Gạn dịch vào BĐM 50 ml, thêm dung mơi cho vừa đủ 50 ml, dịch chiết này lọc qua giấy (khơng thấy cắn giấy) Song song đó chuẩn bị mẫu thử (thử 1) cách không thêm chuẩn vào Triển khai mẫu chuẩn bị máy HPLC Tính toán kết phục hồi Kết phục hồi bảng 4.13 Bảng 4.13: Kết khảo sát cách hòa tan lọc Hàm lượng mẫu thử Hàm lượng chuẩn thêm vào (mg) Cách 0,215 0,24 Cách 0,092 0,096 Hàm lượng (mg) 270,34 100,84 thu Tỉ lệ phục hồi (%) 23,1 9,2 Nhận xét: cách hòa tan và lọc có ảnh hưởng tới độ phục hồi Cách cho độ phục hồi cao hơn, nên chọn cách này để thực hiện khảo sát độ phục hồi cho quy trình chiết xuất và định lượng 3.5.4.3 Khảo sát độ Tiến hành khảo sát độ của phương pháp: thêm chính xác lượng chuẩn (phyllanthin) vào mẫu thử (dược liệu) xác định hàm lượng phyllanthin Với nồng độ chuẩn thêm vào thực hiện mẫu chiết khác Thực hiện thêm chuẩn nồng độ của chuẩn khác Tính hàm lượng phần trăm phyllanthin tìm lại so với hàm lượng ban đầu thêm vào Kết bảng 4.14 40 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang Bảng 4.14: Kết khảo sát độ Hàm lượng có sẵn (mg) Hàm lượng thêm vào (mg) Hàm lượng thu Tỉ lệ phục hổi (%) 0,226 0,2 0,305 39,5 0,226 0,2 0,299 36,5 0,226 0,2 0,308 41 0,226 0,24 0,32 39,2 0,226 0,24 0,314 36,6 0,226 0,24 0,319 38,75 0,226 0,28 0,311 30,36 0,226 0,28 0,323 34,64 0,226 0,28 0,319 33,2 TB (%) 39 38,18 32,73 Độ phục hồi trung bình từ 45,5% – 32,73% Không đạt độ phục hồi cần thiết (95-105%) [19] Tiếp tục tiến hành thêm thí nghiệm khảo sát độ phục hồi của hệ thống để tìm yếu tố ảnh hưởng vào kết độ hồi phục 3.5.4.3 Khảo sát độ phục hồi hệ thống Tiến hành: Mẫu thử: lấy chính xác 2,5 ml mẫu thử cho vào BĐM ml, thêm MeOH vào cho đủ ml, lắc đều mẫu pha loãng lần của thử Mẫu thêm chuẩn: lấy chính xác 2,5 ml mẫu thử + chính xác 0,24 ml dd mẹ mg/ml, thêm MeOH cho đủ ml, lắc đều mẫu thử thêm chuẩn Triển khai HPLC mẫu trên, tính kết độ phục hồi Kết độ phục hồi bảng 4.15 Bảng 4.15: Kết khảo sát độ phục hồi hệ thống Hàm lượng mẫu thử (mg) Hàm lượng chuẩn thêm vào (mg) Hàm lượng tìm thấy (mg) Tỉ lệ phục hồi 0,0235 0,048 0,0491 53,3 (%) Kết độ phục hồi chưa đạt Kết luận: qui trình định lượng chưa có độ phục hồi yêu cầu, chưa phát hiện nguyên nhân, thời gian hạn hẹp nên khóa luận tạm dừng không khảo sát thêm 41 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang 3.8 Quy trình định lượng lignan từ P amarus 3.8.1 Chuẩn bị mẫu Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu cho vào bình nón nút mài 100ml Hút 10 ml MeOH cho vào bình nón trên, đậy nắp bình nón, ngâm 10 15 phút Sau đó đặt vào bề siêu âm chiết với hỗ trợ của siêu âm 10 phút nhiệt độ 60 0C, , gạn lọc qua vào bercher 50 ml lấy dịch chiết lần 1, làm thêm lần (các lần này không ngâm 15 phút), lần 10 ml MeOH Gộp dịch chiết, cô đến cắn Lấy chính xác 20 ml MeOH cho vào bình định mức 20 ml, dùng MeOH này hòa từ từ vào cắn, lọc từ từ qua giấy lọc thấm dung môi vào bình định mức 20ml Mẫu làm mẫu thử để định lượng 3.8.2 Điều kiện sắc ký Máy HPLC Waters 2695 (Alliance) Detector PDA 2996 Bước sóng phát hiện: 205nm Pha tĩnh: cột C18 (4,6 ì 250mm, 5àm) Nhiờt ct: 25oC Pha động: MeOH:H2O (33:67) Rửa giải đẳng dòng Tốc độ dòng: 1ml/phút Thời gian phân tích: 30 phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl 3.8.3 Tiến hành sắc ký Tiến hành mẫu chuẩn, lấy diện tích đỉnh của mẫu chuẩn Chọn mẫu chuẩn có nồng độ gần với nồng độ của mẫu thử Chuẩn bị mẫu nêu mục 3.8.1 Triển khai máy HPLC Tính toán kết 3.8.4 Tính tốn kết Hàm lượng phyllanthin có Diệp hạ châu tính theo công thức: X = Trong đó, St Sc × Cc × k m(100 − h ) ×100 × 100 X: hàm lượng phyllanthin có Diệp hạ châu (%) Sc: diện tích đỉnh thu của mẫu chuẩn St: diện tích đỉnh thu của mẫu thử 42 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang k: độ pha loãng mẫu đo m: khối lượng dược liệu (mg) h: hàm ẩm dược liệu Cc: nồng độ mẫu phyllanthin chuẩn (mg/ml) 3.9 Định lượng loài thuộc chi Phyllanthus thu thập Mẫu Độ ẩm Tro toàn phần Tro không tan acid (%) Hàm lượng phyllanthin (%) (%) (%) P amarus 11,41 5,95 0,69 0,047 P urinaria 11,59 7,32 0,41 Không phát hiện P sp 11,4 7,01 0,57 9,7 ×10-5 Nhận xét: hàm lượng phyllanthin P amarus cao nhất, P urinaria không có xuất hiện của đỉnh phyllanthin chứng tỏ không có phyllanthin mẫu thu thập của loài này Trong P.sp có đỉnh phyllanthin hàm lượng thấp Hình 4.16: Sắc ký đồ 3D P amarus 43 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang Hình 4.17: Sắc ký đồ mẫu P amarus Hình 4.18: Sắc ký đồ mẫu P sp Hình 4.19: Sắc ký đồ mẫu P urinaria 44 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ KẾT LUẬN Qua thời gian tiến hành đề tài, so với mục tiêu đề ra, thực hiện công việc sau : Về mặt tài liệu : Tổng hợp tài liệu về thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học, số chế phẩm có thành phần có chứa Diệp hạ châu Tổng hợp phương pháp định tính và định lượng phyllanthin loài Diệp hạ châu Nghiên cứu tài liệu về HPLC Về mặt thực vật : Thu hái và mô tả hình thái mẫu Phyllanthus amarus, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus sp Khảo sát hình thái, vi phẫu, mô tả chi tiết đặc điểm giải phẫu của loài Diệp hạ châu Thử tinh khiết : Xác định tiêu độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan acid HCl Về khảo sát định lượng : Đã khảo sát khoảng tuyến tính, tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn phyllanthin Đã khảo sát qui trình chiết xuất phyllanthin từ Phyllanthus amarus để áp dụng cho qui trình định lượng Đã hảo sát điều kiện sắc ký HPLC cho phương pháp định lượng Đã khảo sát độ lặp lại của phương pháp Đã khảo sát yếu tố có thể ảnh hưởng tới độ của qui trình định lượng Đã khảo sát độ của quy trình định lượng Đã xây dựng quy trình định lượng Công thức định lượng Đã định lượng loài Diệp hạ châu thu thập Có hàm lượng phyllanthin loài Diệp hạ châu : P amarus có hàm lượng phyllanthin cao loài, P urinaria không phát hiện phyllanthin, P sp có phyllanthin hàm lượng thấp 45 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang ĐỀ NGHI Khảo sát tiếp điều kiện có thể ảnh hưởng tới kết của độ để hoàn chỉnh việc thẩm định qui trình định lượng Tiếp tục xây dựng qui trình định lượng cho lignan khác P amarus từ đó so sánh với loài khác 46 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – 2009 Nguyễn Thùy Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO Huỳnh Ngọc Thụy, Nghiên cứu dược liệu Diệp hạ châu Phyllanthus amarus Schum.et Thonn (Euphorbiaceae), Luận án Tiến sĩ Dược học, Đại học Y dược Tp.HCM (2008) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, tr 438,675 Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục, tr 413-414 Mehrotra R., Rawat., S (1990), » In vivo studies on the effect of certain natural products against HBV «, Indian J Med Res., pp.92-133-8 Database entry for Chandra Piedra (1996-2003), Raintree Nutrition, Inc Austin, Texas 78758 F.Notka (2003), »Inhibition of wild-type human immunodeficiency virus and reverse transcriptase inhibitor-resistant variants by Phyllanthus amarus «, Elsevier Science B.V, pp 175-186 K Regi Raphael ang Ramadasan Kuttan (2003), »Inhibition of experimental gastric lesion and inflammation by Phyllanthus amarus extract «, Elsevier Ireland Ltd., pp 193-7 Phyllanthus amarus, Natural Remedies Pvt Ltd Joan B C (1998), »A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology and theraeutic potential «, Med Res rev., 18, pp.614-620 10 Bộ y tế(2002), Dược điển Việt Nam III, Nxb Y học 11 Arvind K T et al (2006), »Quantative determination of Phyllanthin and Hypophyllanthin in Phyllanthus species by High-performance Thin Layer Chromatography«, Phytochem Anal., 17, pp.394-7 12 (2008), Hóa phân tích , Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM, tr 165-6 13 N V Rajeshkumar and Ramadasan Kuttan (2000), »Phyllanthus amarus extract administration increases the life span of rats with hepatocellular carcinoma « , Elsevier Science Ireland Ltd., pp 215-219 14 Atta-ur-Rahman (2002), »New findings on the bioactivity of lignans « , Studies in Natural Products Chemist, Elsevier Science B.V., 26, p.17 15 Donal W (1984), » Review article number 2: Biological activities of lignan « , Phytochemistry, 23 (6), pp 1207-1220 16 Chang C.C ; Lien Y.C (2003), » lignan from P urinaria «, Phytochemistry, 63 (7), pp 825-33 17 SP,Thyagarajan (1988), » Effect of Phyllanthus amarus on chronic hepatitis B virus «, Lancet 2, pp.1017-8 18 Nara T.K ; Gleye J., (1977), » Flavonoids of Phyllanthus niruri L ; P urinaria L and P.orbiculartus L C Rich «, Planta Medica, 11 (2), pp.82-6 19 (2008), Kiểm nghiệm thuốc, Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM, tr 93-5 20 Nguyễn Minh Đức(2006), Sắc ký lỏng hiệu cao, Nxb Y Học, tr 218-36 21 Chen-Yu Wang and Shoei-Sheng Lee(2005), « Analysis and identification of lignan in Phyllanthus urinaria by HPLC - SPE - NMR « , Phytochem Anal., 16, pp 120-26 47 ... sạch, dùng tươi hoặc sấy khơ 1.2.2 Phân biệt lồi Diệp hạ châu 1.2.2.1 Diệp hạ châu đắng (Diệp hạ châu thân xanh) (Phyllanthus amarus).[1] Cây thảo, mọc đứng, cao 20-40 cm, phân nhánh đều từ... biệt loài Diệp hạ châu [1] Bảng 2.2: Điều kiện chạy phương pháp 16 Bảng 4.3: So sánh kiểu lỗ khí lồi Diệp hạ châu 26 26 Bảng 4.4: So sánh vi phẫu loài Diệp hạ châu 27... pháp, (2) phyllanthin 17 Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo máy HPLC 18 Hình 4.3.Hình ảnh lồi Diệp hạ châu .25 Hình 4.4: Cành mang loài Diệp hạ châu 25 Hình 4.5: Lỗ khí lồi Diệp hạ châu