XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO RAU má và CAO DIẾP cá

Trong vài thập kỷ gần đây, các nước trên thế giới đang đẩy mạnh việc nghiên cứu các chế phẩm thuốc mới từ cây thuốc. Thị trường dược liệu và thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đang đem lại nguồn thu lớn cho các quốc gia có tiềm năng về cây thuốc. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dược liệu nói chung. Trong đó, có hai loại dược liệu phổ biến là dược liệu rau má và dược liệu diếp cá, được nhân dân ta sử dụng hàng ngày trong các bữa ăn ngoài ra còn được sử dụng làm thuốc với công dụng của rau má là mát gan, giải độc gan, mau liền sẹo 5, còn diếp cá được dùng để điều trị trĩ, táo bón, làm thuốc bảo vệ thành mạch 6. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình nghiên cứu về dược liệu rau má như “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất kem chữa bỏng Dermafix từ dầu mù u, mỡ trăn, saponin rau má”, ngoài ra còn có một số chế phẩm trên thị trường được bào chế từ dược liệu rau má, diếp cá như Helaf®, Cenditan®… Tuy nhiên, để được xem như một nguồn nguyên liệu làm thuốc, các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu phải có chất lượng được đảm bảo, tiêu chuẩn khoa học rõ ràng… đạt các yêu cầu làm thuốc theo các quy định của GMP. Trong khi đó, công nghiệp chiết xuất dược liệu của Việt Nam chưa phát triển mạnh, phương pháp chiết xuất chỉ là dạng thô sơ như nấu cao, cô cao trực tiếp. Hạn chế lớn nhất hiện nay của nước ta trong việc khai thác sử dụng cây thuốc và các sản phẩm từ cây thuốc là vấn đề chất lượng, do một số nguyên nhân sau: • Do không được tiêu chuẩn hóa và kiểm định đúng mức, các cây thuốc, cao thuốc có chất lượng không ổn định, không đồng nhất, nhiều khi không có tác dụng điều trị do không có hoặc chứa ít hoạt chất. • Việc kiểm nghiệm các dược liệu, nguyên liệu và thành phẩm từ dược liệu chỉ được thực hiện sơ sài, không đến nơi đến chốn do thiếu tiêu chuẩn và phương pháp thích hợp. Phương pháp kiểm nghiệm của Dược điển Việt Nam hiện nay không phản ánh được chất lượng của dược liệu. Vì vậy, việc hoàn thiện quy trình chiết xuất và nâng cao chất lượng các cao chiết xuất từ dược liệu để cung cấp cho công nghiệp bào chế dược phẩm là việc làm cấp bách và thực tế. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình chiết xuất cao Rau má và cao Diếp cá”. Nội dung nghiên cứu bao gồm: • Kiểm nghiệm dược liệu Rau má và Diếp cá. • Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid asiaticcao Rau má. • Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetincao Diếp cá. • Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao Rau má và cao Diếp cá. • Đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao Rau má và cao Diếp cá.

NGUYỄN THỊ LINH TUYỀN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

CAO RAU MÁ VÀ CAO DIẾP CÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2009

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO RAU MÁ VÀ CAO DIẾP CÁ

Chuyên ngành: Bào chế - Công nghiệp Dược

Mã số: 60.73.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người thực hiện:

DS Nguyễn Thị Linh Tuyền

Người hướng dẫn khoa học:

GS TS Nguyễn Minh Đức

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Thị Linh Tuyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ RAU MÁ 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ DIẾP CÁ 8

1.3 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG 12

1.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 13

1.5 NỘI DUNG CỦA MỘT TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU RAU MÁ 34

3.2 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU DIẾP CÁ 36

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT CAO RAU MÁ 40

3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT CAO DIẾP CÁ 48

3.5 KIỂM NGHIỆM VÀ ĐỀ XUẤT TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO RAU MÁ 56

3.6 ĐỀ XUẤT PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CAO DIẾP CÁ 62

Chương 4 BÀN LUẬN 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

(Relative Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.8 Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu Diếp cá 38

Bảng 3.10 Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu Diếp cá 39

Bảng 3.13 Các thông số sắc ký của mẫu acid asiatic chuẩn 41

Bảng 3.15 Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 42Bảng 3.16 Độ chính xác của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 43Bảng 3.17 Độ đúng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 43Bảng 3.18 Dữ liệu thực nghiệm quy trình chiết xuất cao Rau má 44Bảng 3.19 Liên quan nhân quả trong QTCX cao Rau má 45Bảng 3.20 Đánh giá các mô hình nhân quả đối với cao Rau má 46Bảng 3.21 Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán của dược liệu Rau má 47Bảng 3.22 Các thông số sắc ký của mẫu quercetin chuẩn 49

Bảng 3.24 Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 50Bảng 3.25 Độ chính xác của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 51Bảng 3.26 Độ đúng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 51Bảng 3.27 Kết quả dữ liệu thực nghiệm của dược liệu Diếp cá theo thiết kế 52Bảng 3.28 Liên quan nhân quả trong quy trình chiết xuất cao Diếp cá 53Bảng 3.29 Đánh giá các mô hình nhân quả đối với cao Diếp cá 55Bảng 3.30 Kết quả thực nghiệm và giá trị dự đoán của dược liệu Diếp cá 56Bảng 3.31 Cắn không tan trong nước của cao Rau má 57

Bảng 3.34 Tro không tan trong acid của cao Rau má 58

Bảng 3.35 Tro tan trong nước của cao Rau má 58

Bảng 3.38 Hàm lượng acid asiatic trong cao Rau má 60Bảng 3.39 Đề xuất tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Rau má 61Bảng 3.40 Cắn không tan trong nước của cao Diếp cá 62

Bảng 3.43 Tro không tan trong acid hydrochlorid của cao Diếp cá 63

Bảng 3.46 Giới hạn kim loại nặng của cao Diếp cá 64

Bảng 3.48 Kết quả định lượng quercetin trong cao Diếp cá 65Bảng 3.49 Đề xuất tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Diếp cá 66

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC ở quy trình xử lý 1 và 2 40Hình 3.6 Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 42Hình 3.7 Minh họa mối liên quan giữa hàm lượng với độ cồn, số lần chiết 46Hình 3.8 Hình SKLM dịch chiết quercetin bằng CHCl3 48Hình 3.9 Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 50Hình 3.10 Minh họa mối liên quan giữa hiệu suất với độ cồn, TL DL/DM 54Hình 3.11 Minh họa mối liên quan giữa hàm lượng với độ cồn và số lần chiết 54

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất cao Rau má, Diếp cá 21

Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý 1 để định lượng acid asiatic/cao Rau má 23

Sơ đồ 2.3 Quy trình xử lý 2 để định lượng acid asiatic/cao Rau má 24

Sơ đồ 2.4 Quy trình xử lý mẫu để định lượng quercetin/cao Diếp cá 26

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ sinh thái phong phú

và đa dạng, một tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyêndược liệu nói chung Trong đó, có hai loại dược liệu phổ biến là dược liệu rau má vàdược liệu diếp cá, được nhân dân ta sử dụng hàng ngày trong các bữa ăn ngoài racòn được sử dụng làm thuốc với công dụng của rau má là mát gan, giải độc gan,mau liền sẹo [5], còn diếp cá được dùng để điều trị trĩ, táo bón, làm thuốc bảo vệthành mạch [6] Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình nghiên cứu về dược liệu rau

má như “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất kem chữa bỏng Dermafix từ dầu

mù u, mỡ trăn, saponin rau má”, ngoài ra còn có một số chế phẩm trên thị trườngđược bào chế từ dược liệu rau má, diếp cá như Helaf®, Cenditan®…

Tuy nhiên, để được xem như một nguồn nguyên liệu làm thuốc, các sản phẩm cónguồn gốc từ dược liệu phải có chất lượng được đảm bảo, tiêu chuẩn khoa học rõràng… đạt các yêu cầu làm thuốc theo các quy định của GMP Trong khi đó, côngnghiệp chiết xuất dược liệu của Việt Nam chưa phát triển mạnh, phương pháp chiếtxuất chỉ là dạng thô sơ như nấu cao, cô cao trực tiếp

Hạn chế lớn nhất hiện nay của nước ta trong việc khai thác sử dụng cây thuốc vàcác sản phẩm từ cây thuốc là vấn đề chất lượng, do một số nguyên nhân sau:

 Do không được tiêu chuẩn hóa và kiểm định đúng mức, các cây thuốc, caothuốc có chất lượng không ổn định, không đồng nhất, nhiều khi không có tácdụng điều trị do không có hoặc chứa ít hoạt chất

 Việc kiểm nghiệm các dược liệu, nguyên liệu và thành phẩm từ dược liệu chỉđược thực hiện sơ sài, không đến nơi đến chốn do thiếu tiêu chuẩn vàphương pháp thích hợp Phương pháp kiểm nghiệm của Dược điển Việt Namhiện nay không phản ánh được chất lượng của dược liệu.

Vì vậy, việc hoàn thiện quy trình chiết xuất và nâng cao chất lượng các cao chiếtxuất từ dược liệu để cung cấp cho công nghiệp bào chế dược phẩm là việc làm cấpbách và thực tế Chính vì thế, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình chiếtxuất cao Rau má và cao Diếp cá” Nội dung nghiên cứu bao gồm:

 Kiểm nghiệm dược liệu Rau má và Diếp cá

 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid asiatic/cao Rau má

 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin/cao Diếp cá

 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao Rau má và cao Diếp cá

 Đề xuất phương pháp kiểm nghiệm cao Rau má và cao Diếp cá

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ RAU MÁ

Còn có tên là tích tuyết thảo

Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb., (Hydrocotyle asiatica L., Trisanthus

cm trong những nhánh thường Cụm hoa hình tán đơn mọc ở kẽ lá, gồm 1 – 5 hoanhỏ không cuống, màu trắng hoặc phớt đỏ Quả dẹt rộng 3 – 5 mm, có sống hơi rõ [2,3,6]

Hình 1.1 Cây Rau má

1.1.2 PHÂN BỐ, THU HÁI, CHẾ BIẾN

Mọc hoang tại khắp nơi ở Việt Nam và các nước vùng nhiệt đới như Lào,Campuchia, Indonesia, Ấn Độ, … Toàn cây khi tươi có vị đắng, hăng hơi khó chịu,khi khô thì chỉ có mùi cỏ khô Thu hái quanh năm Dùng tươi hay sao vàng [6,13]

Các glycosid

Saponin quan trọng và chiếm hàm lượng cao là asiaticosid, khi thủy phân sẽ cho raphần aglycon là acid asiatic và phần đường gồm 1 đường rhamnose và 2 đường

glucose Phần đường nối với phần aglycon bằng dây nối ester với nhóm carboxyl ở

vị trí C-28 [6,13,23]

Saponin quan trọng thứ hai là madecassosid, khi thủy phân cho phần aglycon làacid madecassic và phần đường giống như phần đường của asiaticosid Ngoài racòn có các triterpen như brahmosid, brahminosid, thankunisid…[6,13,20]

1.1.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Rau má, nhất là các chất triterpen trong cây có tác dụng rất tốt trong việc trị lành vếtthương, tuy cơ chế tác dụng chưa được hiểu rõ nhưng đã có những nghiên cứu chothấy nhiều kết quả khả quan

Trong những thí nghiệm trên người và động vật được công bố tại Pháp và Anh, cácbác sĩ Boiteau và Ratsimamaga đã chứng minh được tác dụng thúc đẩy tiến trìnhlàm lành vết thương nhanh hơn bình thường [14,18,25]

 Kích thích sự phát triển của lông, tóc, móng

 Làm tăng sự phát triển mạch máu đưa đến mô tế bào hư hại

 Tăng sự tạo thành mucin và các cấu trúc tế bào như acid hyaluronic vàchondroitin sulfat

 Kích thích quá trình keratin hóa của biểu bì thông qua sự kích ứng tạo da của

cơ thể

 Làm chóng lành vết thương và tăng quá trình liền sẹo

Khả năng trị vết thương, vết bỏng [15,18]

Saponin toàn phần của rau má đã được nghiên cứu tác dụng tăng tổng hợp collagen

và fibronectin Tác dụng này có thể giải thích cho khả năng làm chóng lành vếtthương của rau má Madecassosid có hoạt tính kháng viêm, asiaticosid lại kích thíchquá trình làm lành vết thương

Khả năng chữa bệnh mỡ tồn động dưới da [2,25]

Hiệu quả của rau má trong điều trị bệnh mỡ tồn đọng dưới da liên quan đến khảnăng nâng cao cấu trúc mô liên kết và làm giảm sự xơ cứng thông qua việc kíchthích trực tiếp trên nguyên bào sợi

Khả năng chữa bệnh vẩy nến

Vẩy nến là một bệnh ngoài da rất khó trị Một loại kem thử nghiệm tại Đức có phốihợp hoạt chất của rau má đã làm giảm sự đau sưng do tạo vè, vẩy của bệnh nhân vàgiúp lành bệnh sau 2 tháng.

Khả năng chữa sẹo lồi [6,17,21,22]

Trích tinh rau má cho hiệu quả lâm sàng tốt trong điều trị sẹo lồi và sẹo lớn Do tácdụng làm giảm thời kỳ viêm cùng với việc thúc đẩy giai đoạn trưởng thành trongquá trình hình thành sẹo

Khả năng chữa bệnh cùi

Những nghiên cứu được công bố trên tập san “Nature” cho thấy asiaticosid dướidạng oxy hóa làm tan được lớp sáp bao quanh tế bào vi trùng cùi Tác dụng của rau

má được so sánh là tương đương với tác dụng của dược phẩm chính dùng trị cùi làDapson [25]

Khả năng giúp sự lưu thông máu nơi chân [3]

Có khá nhiều nghiên cứu đã chứng minh được tác dụng của rau má trong việc chữatrị bệnh sa mạch máu nơi chân Tác dụng này có lẽ do khả năng của rau má làm ổnđịnh cấu trúc mô liên kết nơi lớp mô tế bào bao quanh tĩnh mạch bớt bị đông cứng

và nhờ đó máu lưu thông dễ dàng hơn

Khả năng tăng hoạt động của não bộ

Các triterpen của rau má cho tác dụng an thần, chống stress, chống lo âu là do tácdụng tăng cường chuyển hóa cholinergic Cơ chế này giúp cho hoạt động trí nãođược tốt [25]

1.1.5 CÔNG DỤNG VÀ LIỀU DÙNG

Nhân dân ta dùng rau má làm rau sống để ăn, nước rau má là loại nước giải khátphổ biến ở các tỉnh phía Nam Kinh nghiệm dân gian cho rằng rau má có tác dụnggiải nhiệt, giải độc, thông tiểu, dùng để chữa sốt, rôm sẩy, mẫm ngứa, các bệnh về

gan, thổ huyết, đi lỏng, lỵ, viêm họng, viêm phế quản, viêm đường tiểu tiện Bêncạnh đó, người ta thường dùng tươi, xay với nước, lọc lấy dịch ép, thêm đường đểuống Mỗi ngày dùng 30 – 40 g [13].

Rau má còn dùng đắp ngoài chữa các vết thương do ngã, tổn thương, gãy xương,bong gân và làm tan ung nhọt

Hiện nay, asiaticosid được dùng chủ yếu làm thuốc chống lành sẹo, các vết thương,vết mổ, chữa loét bỏng, eczema dưới dạng thuốc bột, mỡ hoặc tiêm dưới da [23]

1.2 TỔNG QUAN VỀ DIẾP CÁ

Còn có tên là lá giấp, ngư tinh thảo

Tên khoa học Houttuynia cordata Thunb.

Họ Lá giấp (Saururaceae) [5,6]

1.2.1 MÔ TẢ

Diếp cá là một loại cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dưới đất Phầnthân trên mặt đất cao 15 – 50 cm, màu lục hoặc tím đỏ Lá mọc so le Cuống lá dài.Phiến lá hình tim dài 4 – 6 cm, rộng 3 – 4 cm, có 5 – 7 gân gốc [6]

Hoa nở vào tháng 5 – 8 Cụm hoa hình bông dài 2,5 cm bao bởi 4 lá bắc màu trắng,trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt Trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lágiống như một cái hoa đơn độc Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn [5,6]

Hình 1.2 Lá và hoa Diếp cá

1.2.2 PHÂN BỐ

Phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc, Nêpan, Ấn Độ, các nước Đông Dương vàIndonesia Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến Thường gặp mọc hoang nơi ẩm ướt trêncác bãi ven suối, bờ sông Cũng thường được trồng làm rau ăn và làm thuốc Diếp

cá là loại rau rất quen thuộc trong các bữa ăn hàng ngày của các gia đình Việt Nam,thường dùng làm rau ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác [13]

acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid hexadecanoid, acid decanoic, acidpalmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid

và vitamin K [6,11,12]

1.2.3.2 Flavonoid

Các flavonoid đáng chú ý trong diếp cá gồm quercitrin, isoquercitrin và phloretin Các flavonoid nàyđược coi là những hợp chất có tác dụng kháng ung thư, tác dụng ngăn chặn gốc tự do và được dùng đểđiều trị những bệnh liên quan đến gốc tự do [10].

OHO

1.2.3.4 Các thành phần khác

Thành phần cây diếp cá gồm: nước 91,5%, protid 2,9%, lipid 0,5%, cellulose 1,8%,dẫn xuất không protein 2,2%, khoáng toàn phần 1,1% (trong đó có calci, kali,caroten và vitamn C) [6,8]

Người ta còn tìm thấy trong thành phần diếp cá có chứa Fe, Mg, Mn đây là nhữngkhoáng chất cần thiết cho cơ thể, và không thấy các kim loại nặng như arsen, cadmi,crom hoặc chì trong mẫu phân tích [13]

Ngoài ra còn có tác dụng thông tiểu do có chất quercitrin trong lá Liều trung bình 6– 12 g trong một ngày [6]

1.2.4.2 Bền thành mạch

Thành phần của lá diếp cá có dẫn xuất của dioxyflavon nên có tính chất của vitamin

B nghĩa là tăng sức chịu đựng của thành mao quản dùng để trị trĩ (sắc với nước vớiliều 6 – 12 g trong một ngày) [11]

1.2.4.3 Kháng khuẩn, kháng viêm

Diếp cá còn được sử dụng để trị những trường hợp đau mắt có tụ máu (giã nhỏ lá épvào hai miếng gạc đắp lên mắt khi ngủ, làm như vậy 2 – 3 lần) Ngoài ra, diếp cá

cũng còn được dùng trong những bệnh áp xe phổi khi ho có mủ, sốt nóng do viêmphổi với triệu chứng cảm lạnh và khó thở, viêm ruột cấp tính, viêm nhiễm đườngtiết niệu cấp tính, những cụm nhọt do tụ cầu khuẩn và loét, liều 15 – 25 g đun nóngthời gian ngắn, 30 – 50 g lá tươi sắc thuốc uống hoặc xay lấy nước uống Trongtrường hợp dùng ngoài nghiền hoặc giã đắp lên vết thương, hoặc đun nóng để xônghơi và rửa những sang thương [26,30,31].

Ở Việt Nam có chế phẩm Cenditan® (của Công ty Cổ phần Dược phẩm 3 – 2) cóchứa thành phần là cao diếp cá (75 mg) và bột rau má (300 mg) dùng để trị táo bón, trĩ

1.3 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG

Cenditan ® (Công ty Cổ phần Dược phẩm 3/2)

Helaf ® (Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang).

Cao khô diếp cá 210 mg

Cao khô rau má 45 mg

Tá dược vừa đủ

Madécassol ® crème 1% (10 g) (Công ty Bayer, Pháp).

Cải thiện quá trình làm lành vết thương, lên da non và ngăn chặn hình thành sẹo

1.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU

1.4.1 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu:[1,4,7]

Nguyên liệu

Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất Bề dày củavách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất Độ dày củavách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tương càng lớn thì quá trình hòa tanchiết xuất càng chậm Đường kính các kênh bào tương càng lớn, các chất qua lạivách tế bào càng dễ dàng Quá trình chiết xuất càng xảy ra nhanh Nguyên liệu càngchia nhỏ thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn Tuynhiên, càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiếtcàng có nhiều tạp chất.

Chất tan

Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh.Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tếbào càng giảm

Dung môi

Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càng nhanhlàm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn Khả năng hòa tan các chất trong dungmôi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và dungmôi Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào, sự khuếch tán củachất tan và dung môi xảy ra dễ dàng, quá trình chiết xảy ra càng nhanh

Kỹ thuật chiết

Chênh lệch nồng độ càng lớn, tốc độ khuếch tán càng cao Việc tăng lượng dungmôi làm tăng sự chênh lệch nồng độ nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn Sự khuấytrộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bên ngoài các tiểu phândược liệu bằng phương pháp cơ học Sự chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tếbào tăng lên nên quá trình thẩm tích xảy ra nhanh hơn Tăng nhiệt độ làm tăng khảnăng hòa tan của chất tan vào dung môi và đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làmtăng chuyển động nhiệt của phân tử Giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khảnăng và tốc độ hòa tan, tăng quá trình khuếch tán làm cân bằng nồng độ Tăng ápsuất làm tăng tốc độ thấm dung môi vào nguyên liệu [1]

1.4.2 THIẾT KẾ MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM

Mục đích của việc thiết kế các mô hình thực nghiệm (experimental design) là giúpđịnh hướng cho việc tiến hành thực nghiệm, là nền tảng của việc thu thập dữ liệuđầy đủ và hệ thống Ngày nay, các mô hình thực nghiệm có thể được thiết kế nhanhchóng và dễ dàng bởi phần mềm chuyên dụng như Design – Expert [4] Vấn đề lànhà chiết xuất phải phân tích rõ ràng các mối liên quan nhân quả để lựa chọn biến

số rồi tiến hành thiết kế mô hình thực nghiệm phù hợp Có 3 nhóm mô hình thựcnghiệm: [4]

 Mô hình công thức (formulation designs) hay mô hình hỗn hợp (mixturedesigns): khảo sát các thành phần công thức gồm các loại nguyên liệu, …đây

là loại mô hình có ràng buộc

 Mô hình quy trình (process designs) hay mô hình yếu tố (factorial designs)khảo sát phương pháp và điều kiện sản xuất, đây là loại mô hình không ràngbuộc

 Mô hình kết hợp (combined designs): kết hợp cả hai mô hình công thức và

mô hình quy trình nhằm khảo sát ảnh hưởng của các thành phần nguyên liệu

và điều kiện sản xuất

Một mô hình với F yếu tố được khảo sát, mỗi yếu tố có L mức, đòi hỏi số thínghiệm là LF Mô hình yếu tố đầy đủ có ưu điểm là cho phép người nghiên cứukhảo sát ảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác của chúng Tuy nhiên môhình yếu đầy đủ cần có số thí nghiệm rất lớn khi số yếu tố tăng lên Mô hình yếu tốgiản lược cho phép giảm bớt rất nhiều số thí nghiệm mà vẫn khảo sát được một số

sự ảnh hưởng của các yếu tố Một số mô hình yếu tố đặc biệt như mô hình D –Optimal, mô hình Taguchi OA [4,7]

1.4.3 PHÂN TÍCH LIÊN QUAN NHÂN QUẢ

Mối liên quan giữa điều kiện chiết xuất với tính chất của sản phẩm được gọi là mốiliên quan giữa nhân và quả, gọi tắt là liên quan nhân quả Trong thiết kế quy trìnhchiết xuất, mối liên quan nhân quả chính là mô hình y = f(x), trong đó, nhân là điềukiện sản xuất hay biến độc lập x (thông số) và quả là tính chất sản phẩm hoặc biếnphụ thuộc y Mối liên quan giữa x và y thể hiện trước hết ở xu hướng liên quan vàmức độ liên quan (giá trị R2 luyện càng cao thì liên quan càng rõ)

Mối liên quan giữa x và y thể hiện cụ thể bởi quy luật theo xác suất Quy luật nhânquả bao gồm một mệnh đề nguyên nhân “nếu” và một mệnh đề kết quả “thì” [4].Ngoài ra, mối liên quan nhân quả giữa x và y có thể được hiển thị qua biểu đồ thống

kê 2 – 3 chiều Từ đó, nhà chiết xuất có thể xem xét các mối liên quan nhân quả mộtcách trực quan

1.4.4 TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

Ngày nay, phương pháp tối ưu hóa thông minh có ưu thế so với phương pháp truyềnthống vì: [4]

 Không giới hạn về số biến x1, x2,…xk nên đáp ứng yêu cầu thiết kế với nhiềubiến về các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất

 Có thể tối ưu đồng thời nhiều biến y1, y2,,…yk nên phù hợp với thực tế mỗisản phẩm thường có rất nhiều tính chất

 Không phụ thuộc mô hình toán học mà dựa vào khả năng luyện mạng với sựlựa chọn nhiều thông số phù hợp

 Dự đoán chính xác quả (y) từ nhân (x) biết trước dựa trên mô hình liên quannhân quả đã được thiết lập

Trong quá trình tối ưu, mỗi sản phẩm có rất nhiều tính chất, tức biến phụ thuộc y cónhiều giá trị (y1, y2…) Các giá trị y1, y2… thường hay mâu thuẫn với nhau Khi đó,

nhà chiết xuất phải tối ưu hóa nhiều biến phụ thuộc, tức là dung hòa các giá trị x1,x2… sao cho các giá trị y1, y2… đạt được tối ưu thay vì tối đa hay tối thiểu.

1.5 NỘI DUNG CỦA MỘT TIÊU CHUẨN CAO DƯỢC LIỆU

Yêu cầu cao nhất của một dược phẩm khi được sử dụng trên người là tính an toàn

và hiệu quả trị liệu Một dược phẩm tốt phải là một dược phẩm ít có những tác dụng

có hại, có hiệu quả trị liệu cao và ổn định đối với người sử dụng Để đánh giá vàthống nhất các tiêu chuẩn cho một thành phẩm để đưa ra thị trường, các phươngpháp thử và tiêu chuẩn chất lượng cần phải được xây dựng

Số lượng các cao dược liệu hiện đang lưu hành trên thị trường khá lớn Vì vậy, việcxây dựng tiêu chuẩn cho cao dược liệu là yêu cầu cấp bách và thường xuyên đượcđặt ra [1]

Dựa vào tiêu chuẩn của một số cao thuốc trong DĐVN III, tiêu chuẩn cơ sở của một

số cao thuốc của các cơ sở sản xuất, tiêu chuẩn của dược liệu, nội dung của một tiêuchuẩn cao dược liệu gồm các phần sau đây: [1]

- Đặc điểm mô tả: mô tả đặc điểm thể chất, màu sắc, mùi, vị của cao dược liệu

- Các chỉ số vật lý: độ tan, pH, riêng đối với cao lỏng thì có thêm chỉ tiêu về khốilượng riêng, tỷ trọng, hàm lượng ethanol, độ trong và độ đồng nhất

- Định tính: các phản ứng hóa học hay phương pháp sắc ký để xác định các hoạtchất chính trong cao dược liệu

- Thử tinh khiết: mô tả các yêu cầu về độ tinh khiết của một cao dược liệu (tạp chất,

độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrochlorid, tro tan trong nước, trosulfat, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, các chất độc do ô nhiễm, giới hạn kim loạinặng, giới hạn tạp chất phóng xạ)

- Xác định hàm lượng: phương pháp xác định hoạt chất hay một nhóm hợp chấttrong dược liệu, yêu cầu về hàm lượng cần đạt của dược liệu

- Một số nội dung không có tính chất ràng buộc về tiêu chuẩn chất lượng như: bảoquản, tính vị quy kinh, công năng, chủ trị, liều dùng…

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ

2.1.1 NGUYÊN LIỆU VÀ CHẤT CHUẨN

Dược liệu rau má (Herba Centellae asiatica) đã phơi khô, được mua tại Công ty Cổ

phần Dược liệu TW2 (Phytopharma), địa chỉ 24 Nguyễn Thị Nghĩa, phường BếnThành, quận 1, TPHCM

Dược liệu diếp cá (Herba Houttuyniae cordata) đã phơi khô, được mua tại cơ sở

chuyên mua bán dược liệu Hòa Thạnh – Phùng Qui Minh, địa chỉ 72 Triệu QuangPhục, phường 10, quận 5, TPHCM

Dược liệu được bảo quản lưu mẫu tại Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư viện, KhoaDược Đại học Y Dược TPHCM

Chất chuẩn acid asiatic do Ban Nghiên Cứu Khoa Học – khoa Dược cung cấp (độtinh khiết 99,28%) Chất chuẩn đối chiếu quercetin do viện kiểm nghiệm TPHCMcung cấp, số lô QT104040608, hàm lượng 94,26% C15H10O7, hiện trạng nước 0,23%

2.1.2 HÓA CHẤT, DUNG MÔI

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất, dung môiHóa chất, dung môi Độ tinh khiết Nguồn gốc

Ethanol 96% PA Cty TNHH một thành viên dược

phẩm OPC – Bình Dương

Acetonitril HPLC Merck

2.1.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

Bảng 2.2 Danh sách trang thiết bị

Máy soi UV 2 bước sóng

254 nm và 365 nm

Tên phầm mềm và phiên bản Công dụng Nguồn gốc

Design – Expert v6.06 (2002) Thiết kế mô hình thực nghiệm Stat – Ease, Inc., USAFormRules v3.3 (2007) Nghiên cứu nhân quả Intelligensys, Ltd., UKINForm v3.7 (2008) Tối ưu hóa công thức/quy trình Intelligensys, Ltd., UK

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU

Dược liệu rau má, diếp cá khô được xay và xử lý để có kích thước khoảng 6 mm,bảo quản nơi khô thoáng

2.2.2 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

 Kiểm nghiệm dược liệu rau má

Dược liệu rau má được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN III trang 445 về cácchỉ tiêu: hình thức cảm quan, soi bột, định tính, độ ẩm, tạp chất

 Kiểm nghiệm dược liệu diếp cá

Dược liệu diếp cá được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN III trang 350 về cácchỉ tiêu: hình thức cảm quan, soi bột, định tính, độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, tỷ lệvụn nát, định lượng

2.2.3 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO RAU MÁ, CAO DIẾP CÁ

Cân khoảng 150 g dược liệu rau má, diếp cá đã được kiểm nghiệm theo các chỉ tiêunhư trên, cho vào erlen 2000 ml, đun hồi lưu với cồn ở nhiệt độ khoảng 70oC Gộpcác dịch chiết lọc qua bông thu được dịch lọc, đem dịch lọc sấy phun sương thuđược cao

Khối lượng dược liệu: 150 g

Kích thước dược liệu: 6 mm

Phương pháp chiết: đun hồi lưu

Nhiệt độ chiết: 70oC

Thời gian 1 lần chiết: 2h

Dung môi chiết: cồn

Độ cồn: A, B, C

Tỉ lệ dược liệu:dung môi: 1/8, 1/9, 1/10

Số lần chiết: 2 lần, 3 lần

Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất cao Rau má, Diếp cá

2.2.4 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CẮN CHLOROFORM TỪ CAO RAU

MÁ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ACID ASIATIC.

Tiến hành khảo sát trên 2 quy trình và sơ bộ định lượng acid asiatic bằng HPLC.Quy trình xử lý 1

Cân chính xác khoảng 1 g cao, hòa tan với 5 ml nước nóng, thêm vào khoảng 20 ml

n – butanol bão hòa nước, siêu âm 5 phút, cho vào bình lắng gạn, lấy lớp n –butanol bão hòa nước Lặp lại thêm 2 lần nữa Gộp dịch n – butanol bão hòa nướccủa 3 lần lắc đem cô đến dịch đậm đặc Dịch đậm đặc được đun hồi lưu với HCl10%/cồn trong 4h để thủy phân hoàn toàn và thu được sapogenin Sau đó thêm vàodịch thủy phân 20 ml chloroform và đem siêu âm 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn,

để yên 15 phút rồi mới rút dịch chloroform Lặp lại thêm 2 lần nữa Gộp dịchchloroform của 3 lần, siêu âm với 20 ml nước Rút dịch cloroform đem cô đến cắn

Đun hồi lưu với cồnLọc

Sấy phun sương

Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý 1 để định lượng acid asiatic/cao Rau má

Quy trình xử lý 2

Làm tương tự quy trình 1 nhưng bỏ qua giai đoạn lắc n – BuOH bão hòa nước

Hòa tan với H2O nóngLắc với n–BuOH bão hòa nước (3 lần)

Cô đến dịch đậm đặcĐun hồi lưu với HCl 10%/cồn 4h

Lắc với CHCl3 (3 lần)

Lắc với H2OGạn lớp CHCl3, cô đến cắn

Sơ đồ 2.3 Quy trình xử lý 2 để định lượng acid asiatic/cao Rau má

Sau khi khảo sát 2 quy trình, ta sẽ chọn quy trình quy trình xử lý nào có hàm lượngacid asiatic cao

2.2.5 PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ACID ASIATIC TRONG

CAO RAU MÁ

2.2.5.1 Pha dung dịch thử nghiệm và dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn: cân chính xác 1 mg chuẩn acid asiatic cho vào bình định mức 5

ml, hòa tan với pha động, siêu âm và bổ sung pha động đến vạch, lắc đều, lọc quamàng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 200 µg/ml

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 3 mg cắn chloroform cho vào bình định mức

5 ml, hòa tan với pha động, siêu âm và bổ sung pha động đến vạch, lắc đều, lọc quamàng lọc 0,45 µm để có dung dịch thử có nồng độ 600 µg/ml

Hòa tan với H2O nóngĐun hồi lưu với HCl 10%/cồn 4h

Lắc với CHCl3 (3 lần)

Lắc với H2OGạn lớp CHCl3, cô đến cắn

2.2.5.2 Điều kiện HPLC định lượng acid asiatic

Sơ đồ 2.4 Quy trình xử lý mẫu để định lượng quercetin/cao Diếp cá

2.2.7 PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN TRONG CAO DIẾP CÁ

2.2.7.1 Pha dung dịch thử nghiệm và dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn: cân chính xác 1 mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định

mức 10 ml, hòa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều,lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khoảng 100 µg/ml

Hòa tan với H2O nóngLắc với CHCl3 Gạn bỏ lớp CHCl3

Đun hồi lưu với HCl 10%/cồn 3h

Lắc với CHCl3 (3 lần)

Lắc với H2OGạn lớp CHCl3, cô đến cắn

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 mg cắn chloroform cho vào bình định

mức 5 ml, hòa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều,lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch thử có nồng độ 2000 µg/ml

2.2.7.2 Điều kiện HPLC định lượng quercetin

Khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của acid asiatic trong caoRau má và của quercetin trong cao Diếp cá: pha các dung dịch mẫu chuẩn có nồng

độ khác nhau, bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao và ghi nhận các diệntích đỉnh Từ đó, thiết lập phương trình hồi quy yˆ = Bx + Bo

Tính thích hợp của phương trình yˆ = f(x) được đánh giá bằng trắc nghiệm F

Ý nghĩa của các hệ số B và Bo được kiểm tra đánh giá bằng trắc nghiệm t

Khảo sát độ đúng

Thêm lượng chất chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% hàm lượng chất cần địnhlượng (acid asiatic, quercetin) có trong mẫu thử Bơm vào hệ thống HPLC và ghinhận diện tích đỉnh ở bước sóng phù hợp Xác định tỷ lệ phục hồi trung bình

y2= hàm lượng acid asiatic (trong cao Rau má) hay hàm lượng quercetin (trong cao Diếp cá) (%)

2.2.9.2 Quy trình chiết xuất

Thông số độ cồn, tỷ lệ dược liệu: dung môi, số lần chiết thay đổi theo thiết kế,những thông số khác của quy trình được giữ cố định

Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 1.1, trang PL-9

2.2.10.2 Độ tan trong nước

Cân khoảng 1 g cao rau má cho vào becher 250 ml Thêm vào 100 ml nước cất.Khuấy thật kỹ cho tan Để yên 15 phút và quan sát

Nếu dung dịch đồng nhất: cao hơi tan trong nước

Nếu dung dịch không đồng nhất: cao khó tan hoặc không tan trong nước

2.2.10.3 Độ tan trong cồn

Cân khoảng 1 g cao rau má cho vào becher 50 ml Thêm vào 30 ml dung dịch cồn

có độ cồn xác định Khuấy thật kỹ cho tan Để yên 15 phút và quan sát

Nếu dung dịch đồng nhất: cao tan trong cồn có độ cồn xác định.

Nếu dung dịch không đồng nhất: cao khó tan hoặc không tan trong cồn có độ cồnxác định

Thử nghiệm với các dung dịch cồn có độ cồn thay đổi từ 10 – 96%

2.2.10.4 Cắn không tan trong nước

Tiến hành: cân khoảng 1 g cao, hòa trong 50 ml nước cất trong cốc có mỏ Lọc qua

giấy lọc đã cân bì trước, sấy khô ở 100oC, để nguội 1 giờ trong bình hút ẩm Cân,tính phần trăm cắn không tan trong nước so với khối lượng cao

2.2.10.5 Độ ẩm

Cao Rau má: tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 5.16, trang PL-98, phương pháp 1 Cao Diếp cá: tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 9.6, trang PL-143.

2.2.10.6 Tro toàn phần

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.6, trang PL-129, phương pháp 2

2.2.10.7 Tro không tan trong acid hydrochlorid

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.5, trang PL-128

2.2.10.8 Tro tan trong nước

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.8, trang PL-129

2.2.10.9 Giới hạn nhiễm khuẩn

Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 10.7, trang PL 182-188

2.2.10.10 pH

Cân khoảng 1 g cao, hòa trong 50 ml nước cất đun sôi để nguội Lọc, lấy dịch lọc, dùng dịch lọc để đo pH

ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống Nếu có bọt bền trong 15 phút: có saponin.

Bằng SKLM: đối chiếu với acid asiatic chuẩn.

Bản mỏng: silicagel F254

Hệ dung môi: chloroform: methanol: nước (70:30:10)

Thuốc thử phát hiện: dd H2SO4 10% trong ethanol, hơ nóng ở 105oC để phát hiệnTiến hành: chấm riêng biệt trên bản mỏng lần lượt 2 mẫu sau:

Mẫu chuẩn: hòa tan một ít acid asiatic chuẩn với methanol

Mẫu thử: chiết 1 g cao rau má với chloroform bằng siêu âm Lọc, cô cách thủy làmđậm đặc dịch chiết