Bước đầu xây dựng quy trình chiết xuất chất màu từ hoa loài buddleja paniculata wall , họ bọ chó (budddlejacea)

Bộ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ THƯ HUÉ Bước ĐẬU XÂY DựNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHẤT MÀU TỪ HOA LOÀI BUDDLEJA PANICULATA WALL., HỌ BỌ CHÓ (BUDDLEJACEAE) KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược s ĩ Người hướng dẫn: ThS Lê Thanh Bình Noi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ N Ộ I-2011 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nỗ lực nghiên cứu hồn thành khóa luận này, nhận nhiều quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp này, với lịng biết ơn, kính trọng sâu sắc, tơi xin gửi lời biết ơn chân thành tới giáo ThS Lê Thanh Bình, người hết lịng tận tình bảo, hướng dẫn động viên tơi suốt thời gian làm khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Viết Thân, người cho ý kiến q báu Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược liệu hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cảm on Ban giám hiệu, Bộ mơn tồn thể thầy giáo trưịng Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình dạy bảo tơi suốt năm học vừa qua Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, anh em, bạn bè thời gian qua bên động viên, giúp đỡ giúp tơi vượt qua khó khăn Sinh viên NGÔ THI THƯ HUẾ MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ Ề CHƯƠNG TỔNG Q U A N 1.1 VỀ THỰC V Ậ T 1.1.1 Vị trí phân loại loài Buddleja paniculata Wall 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Buddleja L 1.1.3 Đặc điểm thực vật loài B paniculata Wall 1.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA H Ọ C 1.3 TÁC DỤNG 1.4 ĐỘC TÍNH 1.5 CÔNG DỤNG 1.5.1 Nhuộm màu .7 1.5.2 Công dụng khác 1.6 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NHUỘM MÀU .7 1.6.1 Phân loại 1.6.2 Các nhuộm màu thực phẩm thường sử dụng Việt Nam 1.7 TỔNG QUAN VỀ CHIẾT XUẤT 1.7.1 Phân loại chiết xuất 1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết xuất .10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT B Ị 11 2.2.1 Nguyên vật liệu 11 2.2.2 Thiết bị, hóa chất 11 2.2 NỘI DƯNG NGHIÊN c ứ u 11 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất 12 2.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn cho chất màu 12 2.3.3 Thăm dò khả ứng dụng chất màu thu 12 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 13 3.1 BƯỚC ĐẦU XÂY DựNG QUY TRÌNH CHIỂT XUẤT CHẤT M À U 13 3.1.1 Chiết xuất chất màu số dung môi khác 13 3.1.2 So sánh lượng cắn thu chiết xuất dung môi ethanol 30% với số lần chiết xuất khác 22 3.2 XÂY DựNG MỘT s ố TIÊU CHUẨN CHO CHẮT MÀU THƯ Đ ợ c 23 3.2.1 Cảm quan 23 3.2.2 Độ ẩm 23 3.2.3 Xác định tìro tồn phần 24 3.2.4 pH 25 3.2.5 Cắn không tan nước .25 3.2.6 Định túứi nhóm chất ừong mẫu cắn phản ứng hóa học 25 3.2.7 Định tính chất màu thu SKLM: 26 3.3 THĂM DÒ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHẤT MÀU THU Đ ợ c 30 3.3.1 Đánh giá độ ổn định cắn với nhiệt độ 30 3.3.2 Độ ổn định theo thòi gian 32 3.3.2 Thăm dò khả nhuộm màu chất màu 34 3.4 BÀN LUẬN 35 3.4.1 v ề chiết xuất: 35 3.4.2 v ề xây dựng tiêu chuẩn cho chất màu ứiu được: 36 3.4.3 v ề thăm dò khả ứng dụng chất màu thu được: .36 KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT 38 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B Buddleja NXB: Nhà xuất Pư: Phản ứng SKLM: Sắc kí lớp mỏng TT: Thuốc thử Tr; Trang UV: Ultra violete DANH MỤC BẢNG BIỂU S11 Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các nhuộm màu thực phâm thưòng sử dụng Việt Nam Bảng 3.1 Lượng chât chiêt (tính theo % so với dược liệu khơ) 15 mẫu Bảng 3.2 Kết định tính nhóm chất hữu có mẫu 21 cắn chiết từ hoa B paniculata Wall Bảng 3.3 So sánh lượng chiêt với dung môi ethanol 30% 23 thay đổi số lần chiết xuất Bảng 3.4 Kêt hàm lượng tro toàn phân 24 Bảng 3.5 Bảng kết định tính nhóm chất hữu mẫu CM2 26 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỊ THỊ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Anh chụp B paniculata Wall, thực địa Hình 1.2 Anh cành mang hoa 3 Hình 1.3 Câu trúc hóa học acacetin Hình 1.4 Câu trúc hóa học linarin Hình 3.1 Sơ chiêt xt chât màu từ hoa Buddleja 14 paniculata Wall, dung mơi khác Hình 3.2 Hình ảnh săc kí mâu ánh sáng thường, 16 ánh sánh tử ngoại có bước sóng 366nm, 254nm Hình 3.3 Hình ảnh săc kí đơ, thị pic vêt săc kí 27 đồ bảng kết phân tích vết sắc kí đồ CM2/MeOH quan sát ánh sáng thưòng Hình 3.4 Hình ảnh săc kí đơ, thị pic vêt săc kí 28 đồ bảng kết phân tích vết sắc kí đồ CM2/MeOH quan sát ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254nm Hình 3.5 Hình ảnh săc kí đơ, thị pic vêt săc kí đồ bảng kết phân tích vết sắc kí đồ 29 GM2/MeOH quan sát ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366nm Hình 3.6 Hình ảnh dung dịch chât màu với thời gian đun khác 10 11 30 Hình 3.7 Hình ảnh săc kí thê ảnh hưởng nhiệt 31 độ đến chất màu CM2 12 Hình 3.8 Hình ảnh săc kí mâu M l, M2, M4 quan sát ánh sáng tử ngoại với bước sóng 254nm 32 13 Hình 3.9 Hình ảnh săc kí mâu M l, M2, M4 quan sát 33 ánh sáng tử ngoại với bước sóng 254nm 14 Hình 3.10 Hình ảnh săc kí mâu M l, M2, M4 quan 33 sát ánh sáng thưịng 15 Hình 3.11 Hình ảnh xơi nhuộm mâu CM2 34 16 Hình 3.12 Hình ảnh rượu sau nhuộm mẫu cao CM2 34 ĐẶT VẤN ĐÈ Ngày nay, xã hội phát triển, nhu cầu ăn uống lên cao Thức ăn không yêu cầu ngon mà cịn phải đẹp Có nhiều cách làm cho thức ăn trở nên hấp dẫn, sử dụng chất nhuộm màu ỉà phương pháp phổ biến Chất nhuộm màu sử dụng từ lâu đời với mục đích tạo làm tăng màu sắc cho sản phẩm để làm tăng tính hấp dẫn sản phẩm Các chất nhuộm màu tổng hợp đa dạng màu sắc, chủng loại, giá thành rẻ, sử dụng dễ dàng nên sử dụng ngày nhiều Tuy nhiên việc lạm dụng chất màu tổng hợp gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe như: ngộ độc cấp tính tích lũy lâu dài gây ung thư Chính vậy, thời gian gần đây, xu hướng sử dụng chất màu có nguồn gốc tự nhiên ngày quan tâm phát triển Trong nghiên cứu gần cho thấy Buddleja paniculata Wall, có khả nhuộm màu tốt, dễ sử dụng, khơng có độc tính cấp [3] Vì đề tài “Bước đầu xây dựng qui trình chiết xuất chất màu từ hoa loài Buddleja paniculata Wall., họ Bọ chó (Buddlejaceae) ” tiến hành với mục tiêu sau: Bước đầu nghiên cứu chiết xuất chất màu đạt hiệu cao từ hoa B panỉculata Wall Xây dựng số tiêu chuẩn cho chất màu thu Thăm dò khả ứng dụng chất màu thu CHƯOÍNG TỎNG QUAN 1.1 VÈ THựC VẬT 1.1.1 Vị trí phân loại lồi Buddleja paniculata Wall Theo số tài liệu phân loại thực vật, lồi Buddleja panỉculata Wall, có vị trí phân loại sau [1], [2], [9]: Giới Thực vật (Plantae) Phân giới Thực vật bậc cao (Kormobionta) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Bạc hà (Lamiidae) Bộ Hoa mõm chó (Scrophulariales) Họ Bọ chó (Buddlejaceae) Chi Loài Buddleja Buddlejapaniculata 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Buddleja L Cây nhỡ bụi, thân trịn có cạnh Lá mọc đổi, mọc so le, mép nguyên khía cưa, có kèm kèm tiêu giảm đường nhỏ cuống Cụm hoa chùm chùy mọc cành kẽ lá, mang nhiều hoa Hoa mẫu 4, đơn tính lưỡng tính, tràng hình ống, hình chng, hình chén hình phễu, ống hình trụ, thẳng cong, ống dài thùy, thùy thưỊTig xếp lợp Nhị đính vào ống tràng, bao phấn hưóng Bầu ơ, nhiều nỗn Quả nang, nhiều hạt Hạt nhỏ,thường có cánh, nhiều nội nhũ, phơi thẳng [22], Trên giới, chi Buddleja L có khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới ôn đới châu Mỹ, châu Phi châu Á [20] Việt Nam, chi Buddleja L có lồi: B panỉculata Wall., B asíatica Lour., B davidii Franch., B macrostachya Benth., B officinalis Maxim [20], [11], 28 (XIOO) Pedk s M tt M đx z Rf 0.052 0.340 14 74 0.382 494.0 H E ih ì Rf H 0.0 0.075 0.346 Rf 452.7 5.12 1536.6 0.402 1146 0.085 17.3 0,456 0.556 0.9 0.622 62.8 0.666 123.6 0.780 754.3 0.784 0.865 154.9 0.890 504.2 494.0 12.85 710 42.02 0.548 16.2 0.589 337.6 3.82 0.595 245,3 6.97 358.3 15.29 17955.9 2585.9 9.26 0.689 21369.0 70.8 0.504 0.647 615.6 N tìin e í^ l 3.05 363.8 4265.0 0.382 800.79.06 AH Subst 0.434 12 156.4 a ie a 3774.4 0.666 123.6 9.71 0.720 0.813 5.70 7979.3 136.6 167.8 0.898 2.70 5.71 115 7.0 8292,2 437.3776.1 8.30 5.93 4.13 Hĩnh 3.4 Sắc kí đồ(l), đồ thị pic vết sẳc kí đồ(2) bảng phân tích vết sắc kỉ đồ(3) CM2/ MeOH quan sát ánh sáng tử ngoại 254nm 29 (x100) 25 - 20 - 15 10 ~ T— Peak 0,1 I— r— 02 0.248 0.442 0.517 0,607 0.707 0.931 0.0 807.1 7.3 553.7 487,5 778 ,0 I— I— 05 I— I— 06 I— I— 07 I— Rf H 816.4 7.64 0.289 552,3 ,1 0.391193.8 0.550 831.1 829,1 893,9 0,611639,7 0.666 0.9 aie a 0.283 0,448 [— End H M 0,440 I— 08 0.369 0.648 103,9 I— 04 Rf 0.360 281.8 0.403 \ — I— M ax 62.7 I— 0,3 H I— S t a it Rf I— 636,1 ,7 0.442 7,7 8,37 5,99 5,95 Au 674.0 807.1 0.491 0.554 809.1 0.633 0.672 0,739 3344,0 31,30 0.788 98.8 0.969 2140,9 20,04 0.971 110.5 Suhst Nam e 9329.7 5.97 6271.6 4,01 9203.4 33.8 10431.1 5,88 6,67 9669.7 6.18 37.6 4501.4 2,88 582.8 5504.2 3,52 69545.0 31951.4 44,46 20,43 Hinh 3.5 Sac hi do(l), thi pic cdc vet tren sac ki do(2) va bdngphdn tick cdc vet tren sac ki do(3) cua CM2/ MeOH quart sat a dnh sang tit ngoai 366nm 30 3.3 THĂM DÒ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHẤT MÀU THU Được Để đưa chất màu vào ứng dụng thực tế cần đánh giá độ ổn định chất màu với số yếu tố như: nhiệt độ, thời gian bảo quản 3.3.1 Đánh giá độ ổn định cắn với nhiệt độ Cho vào cốc có mỏ chứa 200ml nước cốc 0,5g cắn mẫu sau đem đun trực tiếp bếp với nhiệt độ lớn lOO^C Cốc 1; không đun Cốc 2; đun Ih Cốc 3: đun 2h Cốc 4: đun 3h 3.3.1.1 Đảnh giả cảm quan Quan sát cảm quan dịch cốc thấy sau thời gian đun màu dung dịch sẫm hon, không sáng, đẹp ban đầu Kết thể hình 3.6 /k > ỊỈ Ẳ Dịch chiết sau đun Dịch chiết sau đun I Dịch chiết chưa đun Hình 3.6 Hình ảnh dung dịch chất màu với thời gian đun khác 31 3.3.1.2 Đánh giá SKLM Dịch chiết cốc thu đem sấy tủ sấy 60°c đến cắn Hòa tan mẫu cắn MeOH đem chạy sắc kí với hệ dung mơi CHCI3 : MeOH : H2O (65:35:10) Kết thu thể hình 3.7 Mầu cắn ban đầu, cắn sau đun giờ, cắn sau đun giờ, cắn sau đun chấm mỏng kí hiệu bđ, 1, 2, Ị • • Ánh sáng thường uv 366nm uv 254nm Hình 3.7 Hình ảnh sắc ki đồ thể ảnh hưởng nhiệt độ đến chất màu CM2 Nhận xét: Theo cảm quan, màu sắc dung dịch đun lâu màu sẫm Theo kết định tính SKLM: Sau đun trực tiếp bếp nhiệt độ >100®c số vết màu vàng giảm màu sắc vết vàng cam đậm lên Quan sát đèn tử ngoại bước sóng 254nm 366nm số vết tương đối giống Kết luận: Nhiệt độ có ảnh hưởng đến số vết màu vàng chất màu ảnh hưởng tới công dụng nhuộm màu chất màu Do chất màu thu có 32 thể ứng dụng thực tế để nhuộm màu điều kiện nhiệt độ tương đối cao ví dụ như: bao viên 3.3.2 Độ ổn định theo thời gian Chất màu sau nghiền nhỏ thành bột bảo quản lọ có nút mài Chất màu ban đầu kí hiệu M l, chất màu bao quản sau tháng kí hiệu M2, chất màu bảo quản sau 04 tháng kí hiệu M4 3.3.2.1 Đánh giá cảm quan Sau thời gian 02 tháng, 04 tíiáng bột có màu nâu vàng, tơi, mịn, mùi ửiom nhẹ 33.2.2 Đảnh giá SKLM So sánh mẫu M l, M2, M4 SKLM với hệ dung môi CHCI3: MeOH; H2O (65:35:10) Kết sắc kí thể hình 3.8, 3.9, 3.10 Mau ban đầu Mau sau tháng Mầu sau tháng Hình 3.8 Hình ảnh sắc kí đồ mẫu Mỉ, M2, M4 quan sát ánh sáng tử ngoại với bước sóng 366nm 33 Mau ban đầu Mau sau tháng Mau sau tháng Hình 3.9 Hình ảnh sắc ìd đồ mẫu MI, M2, M4 quan sát ánh sảng tử ngoại với bước sóng 254nm Mầu ban đầu Mầu sau tháng Mầu sau tháng Hình 3.10 Sắc kỉ đồ mẫu Mỉ, M2, M4 quan sát ánh sáng thường 34 Nhận xét: Qua hình ảnh sắc kí cho thấy số vết màu vàng quan sát ánh sáng thường không đổi số vết quan sát đèn tử ngoại bước sóng 254nm, 366nm thay đổi khơng nhiều Kết luận: Thời gian ảnh hưởng tới chất hỗn hợp chất màu 3.3.2 Thăm dò khả nhuộm màu chất màu 3.3.2.1 Nhuộm xôi: Lấy cắn mẫu CM2 thu đem hòa tan vào nước Ngâm gạo nếp vào dung dịch tiếng sau đồ xơi Kết thu thể hình 3.11 s.3.2.2 Nhuộm màu cho rượu Lấy cắn thu hịa tan vào rượu, lọc qua bơng Sau thời gian tháng, kết thấy rượu sau nhuộm màu có mùi, vị khơng thay đổi, màu vàng Kết thu thể hình 3.12 Hĩnh 3.11 Hình ảnh xơi sau nhuộm mâu cao CM2 Hình 3.12 Hình ảnh rượu sau nhuộm mẫu cao CM2 35 Nhận xét: Chất màu đem nhuộm xôi rượu tạo sản phẩm có màu vàng, hấp dẫn Việc sử dụng chất màu để nhuộm màu thực cách dễ dàng, đơn giản 3.4 BÀN LUẬN 3.4.1 chiết xuất: Quá trình thực nghiệm tiến hành chiết xuất với 50g dược liệu, dung mơi gồm có nước ethanol với nồng độ khác Nước dung môi sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian Ethanol dung môi rẻ tiền, thông dụng, độc, thường sử dụng công nghiệp Kết chiết xuất cho thấy lượng cắn CM5 (chiết xuất với dung mơi ethanol 90%) thu khả hòa tan chất ethanol cao độ hcm, lưọng cắn CM l, CM2, CM3, CM4 thu chênh lệch khơng lớn lượng cắn CM2 (chiết xuất với dung môi ethanol 30%) lớn Trong trình chiết xuất, dung dịch chiết nước dễ bị hỏng Ngược lại, với dung mơi ethanol nồng độ > % có khả bảo quản, ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc phát triển nên bảo quản lâu Kết SKLM định tính phản ứng hóa học so sánh mẫu cắn thu chiết xuất dung môi khác cho thấy mẫu cắn có số nhóm chất hữu tương đối giống Từ kết trên, dung môi ethanol 30% chọn dung môi chiết chất màu từ hoa B paniculata Wall, tốt Khi thay đổi số lần chiết thấy lượng cắn chiết lần chênh lệch so với lượng cắn chiết lần, lượng cắn thu chiết lần nhiều so với chiết lần (các điều kiện khác nhau) Mặt khác số lần chiết tăng lượng tạp chất nhiều Do lựa chọn số lần chiết thích họp lần 36 3.4.2 xây dựng tiêu chuẩn cho chất màu thu được: Theo tiêu chuẩn Dược điển VN IV cao thuốc chia làm loại: + Cao lỏng chất lỏng sánh, có mùi vị đặc trưng dược liệu sử dụng nước cồn đóng vai trị dung mơi Quy ước Iml cao lỏng tương ứng với Ig dược liệu dùng để điều chế cao thuốc + Cao đặc: La khối đặc qnh Hàm lượng dung mơi cịn lại cao không % + Cao khô: Là khối bột khô, đồng dễ hút ẩm Độ ẩm không lớn 5% Dựa vào tiêu chuẩn phân loại cao Dược điển VN IV, mẫu cao CM2 xếp vào cao đặc xây dựng tiêu chuẩn dựa vào tiêu chuẩn cao đặc Chất màu thu dễ hút ẩm, tiêu chuẩn cảm quan, độ ẩm, bảo quản đưa hợp lí nhằm bảo quản chất màu, tránh cho chất màu không hút ẩm, để không làm ảnh hưởng đến chất lưọng chất màu Tiêu chuẩn pH, cắn khơng tan nước đưa ra, định tính đánh giá độ tan chất màu nước nhóm chất chất màu Đây tiêu chuẩn chất lượng ứng dụng nhuộm màu chất màu chủ yếu sử dụng vào ỉĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, sử dụng dung mơi hịa tan chủ yếu nước, pH hợp lý sử dụng khơng q kiềm hay q acid Định tính SKLM giúp xây dựng hình ảnh dấu vân tay cho hỗn hợp chất màu chiết xuất từ hoa loài B paniculata Wall, dung môi ethanol 30% Đây tiêu chuẩn góp phần kiểm nghiệm chất màu đưa vào ứng dụng thực tế sau 3.4.3 thăm dò khả ứng dụng chất màu thu đuọc: Để đưa chất màu thu ứng dụng vào thực tế, cần phải thử độ ổn định chất màu theo số yếu tố thời gian, nhiệt độ Kết đánh giá độ ổn định chất màu với nhiệt độ SKLM cho thấy sắc kí đồ quan sát ánh sáng thường số lượng vết màu vàng giảm màu sắc vết có màu vàng đậm 37 lên, điều giải thích số hợp chất flavonoid bị thủy phân., ảnh hưởng đến khả nhuộm màu hỗn họp chất màu Kết đánh giá độ ổn định chất màu với thời gian SKLM cho thấy hình ảnh sắc kí đồ, số vết màu vàng thay đổi khơng nhiều Do bảo quản chất màu thời gian dài đưa chất màu thu sử dụng vào số lĩnh vực yêu cầu nhiệt độ cao bao viên Khi thử nhuộm màu xôi (theo kinh nghiệm dân gian), nhuộm rưọTi chất màu thu cho thấy sản phẩm thu không làm thay đổi mùi, vị, màu sắc đẹp mắt, tăng tính hấp dẫn Do đưa chất màu thu ứng dụng vào nhuộm màu số sản phẩm khác như: bánh, mứt, kẹo, nước giải khát, sản phẩm chế biến từ thịt cá 38 KÉT LUẬN, ĐẺ XUẤT VÈ CHIÉT XUẤT - Đã tiến hành chiết xuất 50g dược liệu với dung môi thông dụng dùng cơng nghiệp, giá thành rẻ, độc, dễ kiếm gồm nước, ethanol Kết cho thấy chiết xuất với ethanol 30%, chiết lần, lần lít dung mơi cho lượng cắn tính theo % so với dược liệu khô cao - Kết định tính sắc kí lớp mỏng phản ứng hóa hoc cho thấy nhóm chất hữu mẫu cắn khác không nhiều Từ kết lựa chọn quy trình chiết với dung mơi ethanol 30%, chiết lần, lần chiết vói lít dung mơi làm quy trình chiết hiệu VÈ XÂY DựNG SÓ TIÊU CHUẨN CHO HỎN HỢP CHẤT MÀU THU ĐƯỢC Đã xây dựng số tiêu chuẩn cho chất màu thu gồm; - Cảm quan: Chất màu thu dạng bột mịn, tơi, màu nâu vàng, mùi thơm nhẹ, vị đắng - Độ ẩm: