XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLCUV

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ KHOA DƯỢC LIÊN BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLCUV GVHD ThS Nguyễn Mạnh Quân Học viên thực hiện Lê Văn Bẩy CH CK1 Kiểm nghiệm – Độc chất, Khóa 2020 2022 Cần Thơ 2022 KHOA DƯỢC LIÊN BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC GVHD Ths Nguyễn.

TRƯỜNG TRƯỜNG ĐẠI ĐẠI HỌC HỌC Y Y DƯỢC DƯỢC CẦN CẦN THƠ THƠ KHOA KHOA DƯỢC DƯỢC LIÊN LIÊN BỘ BỘ MƠN MƠN HĨA HĨA PHÂN PHÂN TÍCH TÍCH –– KIỂM KIỂM NGHIỆM NGHIỆM –– ĐỘC ĐỘC CHẤT CHẤT  XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN PHƯƠNG PHÁP HPLC NATRI BENZOAT TRONG CHẢ LỤA BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC/UV GVHD: Ths Nguyễn Mạnh Quân GVHD: ThS.hiện: Nguyễn Mạnh Quân Học viên thực Học viên thực hiện: Lê Văn Bẩy Học viên thực hiện:– Lê CH-CK1 Kiểm nghiệm ĐộcVăn chất,Bẩy Khóa 2020 - 2022 CH-CK1 Kiểm nghiệm – Độc chất, Khóa 2020 - 2022 Cần 2022 Cần Thơ Thơ –- 2022 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chả lụa .2 1.1.1 Khái quát 1.1.2 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan natri benzoate 1.2.1 Tính chất lý hóa .3 1.2.2 Nguồn gốc .3 1.2.3 Cơ chế hoạt động bảo quản natri benzoate .4 1.2.4 Công dụng .4 1.2.5 Tác động sức khỏe .4 1.2.6 Quy định giới hạn cho phép 1.3 Tình hình sử dụng natri benzoate Việt Nam 1.4 Nghiên cứu liên quan .7 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 2.1.3.1 .Hóa chất, chất chuẩn, dung mơi 2.1.3.2 Thiết bị, dụng cụ 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng natri benzoate chả lụa phương pháp UPLC/UV 2.2.1.1 Chuẩn bị mẫu 2.2.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 2.2.1.3 Khảo sát xử lý mẫu 10 2.2.2 Thẩm định quy trình định lượng natri benzoate chả lụa phương pháp UPLC/UV .11 2.2.2.1 Tính tương thích hệ thống 11 2.2.2.2 Độ đặc hiệu 12 2.2.2.3 Tính tuyến tính 12 2.2.2.4 .Độ xác ngày 13 2.2.2.5 Độ (tỷ lệ thu hồi %) 14 2.2.2.6 Xác định giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 15 2.2.3 Ứng dụng quy trình định lượng thẩm định số mẫu chả lụa 16 Chương 3: KẾT QUẢ 17 3.1 Khảo sát pha động bước sóng phân tích 17 3.1.1 Kết khảo sát pha động 17 3.1.2 Kết khảo sát bước sóng 19 3.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất natri benzoat chả lụa 20 3.2.1 Khảo sát quy trình chiết xuất natri benzoat chả lụa .20 3.2.2 Khảo sát số lần chiết kiệt natri benzoat chả lụa 22 3.3 Kết thẩm định quy trình định lượng natri benzoate chả lụa phương pháp UPLC/UV .24 Tình tương thích hệ thống .24 3.3.2 Độ đặc hiệu 27 3.3.3 Tính tuyến tính .28 3.3.4 Độ xác ngày .30 3.3.5 Độ đúng 31 3.3.6 Giới hạn phát hiện(LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .34 3.4 Kết ứng dụng quy trình định lượng thẩm định số mẫu chả lụa 35 Chương 4: BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 PHỤ LỤC 44 3.4.1 3.3.1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril ADN Acid deoxyribonucleic BuP Butyl paraben EP Ethyl paraben DLLME Dispersive Liquid Liquid Micro-extraction (Phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán) GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép phối phổ) UPLC/UV Ultra Performance Liquid Chromatography/ Ultra violet LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) LC-MS/MS Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép phối phổ song song) MP Methyl paraben IPP Isopropyl palmitae IBP Isobutyl palmitae MeOH Methanol NaCl Natri clorid PrP Propyl paraben PSA Primary Secondary Amine RSD Relative standard deviation (Sai số tương đối) SPE Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn) UVB Ultraviolet black (“Ánh sáng đen”, có bước sóng 315-20nm) UV-VIS Ultraviolet-visible (Quang phổ tử ngoại khả kiến) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học chả lụa Bảng 2.1 Các hệ dung môi pha động khảo sát Bảng 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận hàm lượng khác theo phụ lục F AOAC – trang [13] Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận hàm lượng khác (theo AOAC) Bảng 3.1 Các hệ dung môi pha động khảo sát Bảng 3.2 Diện tích pic tương ứng với nồng độ chuẩn Bảng 3.3 Bảng phân tích tuyến tính natri benzoate Bảng 3.4 Kết thẩm định độ đúng quy trình phân tích Bảng 3.5 Kết phân tích natri benzoate số mẫu chả lụa thu thập thị trường TP.Cần Thơ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo natri benzoate Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến Hình 3.1 Sắc ký đồ hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1%; MeOH - nước; ACN : nước (tỷ lệ 50 : 50) Hình 3.2 Sắc ký đồ hệ pha động MeOH - Acid formic 0,1% tỷ lệ 60 : 40; 70 : 30; 80 : 20 Natri benzoat Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát bước sóng mẫu chuẩn natri benzoat Hình 3.5 Sơ đồ chiết xuất natri benzoat Hình 3.6 Dịch lọc mẫu thử còn bị tủa đục sau loại tạp Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất natri benzoat đề xuất Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu thử chiết lần thứ Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu thử lần chiết Hình 3.10 Sơ đồ chiết xuất natri benzoat dùng thực nghiệm Hình 3.11 Sắc ký đồ kết sắc ký mẫu chuẩn natri benzoat sau lần tiêm liên tiếp Hình 3.12 Sắc ký đồ kết sắc ký mẫu thử sau lần tiêm liên tiếp Hình 3.13 Sắc ký đồ tính đặc hiệu quy trình phân tích Hình 3.14 Sắc ký đồ kết tính tuyến tính quy trình phân tích Hình 3.15 Đồ thị tương quan nồng độ diện tích đỉnh natri benzoate Hình 3.16 Sắc ký đồ kết sắc ký độ xác mẫu thử M1 – M6 Hình 3.17 Sắc ký đồ kết sắc ký độ đúng 80% (34ppm) Hình 3.18 Sắc ký đồ kết sắc ký độ đúng 100% (40ppm) Hình 3.19 Sắc ký đồ kết sắc ký độ đúng 120% (48ppm) Hình 3.20 Sắc ký đồ kết sắc ký mẫu thử khơng thêm chuẩn Hình 3.21 Sắc ký đồ natri benzoate nồng độ 0.125ppm 0.0625ppm Hình 3.22 Sắc ký đồ kết sắc ký mẫu đem thử Hình 4.1 sắc ký đồ mẫu mẫu chuẩn natri benzoat Hình 4.2 Sắc ký đồ mẫu thử lần chiết ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển đa dạng phong phú ngành công nghiệp thực phảm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày cao người, loại thực phẩm chế biến sẵn ngày phổ biến rộng rãi sống hàng ngày tính tiện lợi nhanh chóng chúng Tuy nhiên, nhiều sản phẩm có chứa thành phần mà người tiêu dùng chưa hiểu hết tác dụng natri benzoate số chất phụ gia Natri benzoate loại phụ gia thực phẩm Cơ quan Quản lý Dược phẩm thực phẩm Hoa Kỳ - FDA chấp thuận đưa vào sử dụng để kéo dài tuổi thọ sản phẩm Nó có tác dụng ức chế phát triển loại nấm mốc vi sinh vật gây thối rữa thực phẩm Natri benzoate sử dụng phổ biến sản phẩm như: Thực phẩm chế biến sẵn, sản phẩm chăm sóc miệng, mỹ phẩm, nước nước trái cây, loại gia vị, sirô ho số thuốc khác Các nhà nghiên cứu cho natri benzoate gây hại đến phần quan trọng DNA Bên cạnh đó, natri benzoate cho nguyên nhân quan trọng cho vấn đề hiếu động mức trẻ em Mặc dù điều suy đốn chưa có chứng minh cụ thể nghiên cứu tiến hành, lời khuyên nên cắt giảm sản phẩm thực phẩm đồ uống có chứa natri benzoate Đứng trước tình hình thực tế đó, nhóm chúng tơi thực chuyên đề “ Xây dựng quy trình địng lượng chất bảo quản Natri benzoat chả lụa bằng phương pháp HPLC” với hai mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định quy trình phân tích chất bảo quản natri benzoate thực phẩm (chả lụa) phương pháp HPLC - Ứng dụng quy trình thẩm định để phân tích natri benzoate số mẫu chả lụa thu thập thị trường 10 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chả lụa [2] 1.1.1 Khái quát Chả lụa (giò lụa) sản phẩm dạng gel truyền thống nước ta, có tên gọi khác miền Bắc (giò lụa) miềnNam (chả lụa) Chả lụa loại thực phẩm cung cấp nhiều lượng, chất dinh dưỡng thành phần có chứa nhiều protein khơng thay Có thể sử dụng chả lụa ăn trực tiếp hay ăn kèm với khác bánh tráng, bánh mì, bún, bánh ướt…tạo nên mùi vị đặc trưng hấp dẫn Đặc biệt vào ngày tết cổ truyền Việt Nam, chả lụa thực phẩm khơng thể thiếu nhà gia đình miền Bắc Theo tài liệu tham khảo chả lụa có nguồn gốc từ Tân Ước, Phúc Thụy, Thanh Oai, Hà Tây.Ở làm sản phẩm chả lụa ngon tiếng Chả lụa làm truyền thống sau: chọn thịt nạc mông hay bắp đùi heo vừa, không cần lớn hay nhỏ Thịt sử dụng phải thịt còn nóng Sau cắt ngang thớ thịt thành miếng nhỏ, bỏ gân, bỏ vào cối đá giã, giã nhanh tay, thấy thịt nhuyễn quánh cho thêm chút nước mắm ngon, chút muối rang tán nhỏ, thúc (nhồi) thịt cho mắm muối Cho vào gói chặt, buộc lại kỹ bỏ vào nồi nước lạnh mà luộc Nước phải phủ ngập chả, chả chín vớt ra, treo cho rỏ 1.1.2 Thành phần hóa học Bảng 1.1 Thành phần hóa học chả lụa Thành phần Độ ẩm Protein Lipid Tro 1.2 Tổng quan natri benzoate [3], [5] 1.2.1 Tính chất lý hóa - Danh pháp quốc tế: natri benzoate % khối lượng 72 21,5 5,5 48 natri benzoat có tính tương quan chặt chẽ, hệ số a hệ số b phương trình có ý nghĩa - Độ xác ngày Phương pháp có độ xác cao, độ lệch chuẩn tương đối RSD% thời gian lưu diện tích pic natri benzoat 0.09% 1.86% theo AOAC mức hàm lượng 10 – 100PPM, RSD có giá trị khơng vượt q 7.3% - Độ + Độ lệch chuẩn tương đối RSD% lượng natri benzoat tìm thấy (n = 9) có giá trị 0.91%, lượng chất phân tích tìm thấy từ 103.07% - 106.40% + Phương pháp có đạt độ đúng theo AOAC mức nồng độ 10 – 100ppm, độ lệch chuẩn tương đối RSD lượng chất phân tích tìm thấy (n = 9) có giá trị khơng q 7.3%, lượng chất phân tích tìm thấy nằm khoảng 80% – 110% Phương pháp có thu hồi tương đương với nghiên cứu trước - Giới hạn phát hiện(LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Từ kết thực nghiệm khảo sát đường chuẩn, xác định giới hạn phát giới hạn định lượng natri benzoat phương pháp phù hợp là: LOD =0.125ppm LOQ = 0,45ppm Các giới hạn tương đương với nghiên cứu trước  Kết ứng dụng quy trình định lượng thẩm định số mẫu chả lụa, Quy trình định lượng sau thẩm định đạt yêu cầu theo quy định áp dụng phân tích mẫu chả lụa thu thập thị trường Kết kiểm tra cho thấy 03 mẫu chả lụa lấy thị trường có chứa chất bảo quản natri benzoat hàm lượng thấp quy định Tuy nhiên, cần phân tích thêm với cỡ mẫu lớn hơn, để có nhìn tổng quan vấn đề chất bảo quản natri benzoat chả lụa thị trường TP.Cần Thơ mẫu dùng thực nghiệm sản phẩm nhà sản xuất uy tín thị trường Cần thẩm định quy trình nhiều mẫu thực phầm khác( chả cá, bò viên ) để quy trình định lượng ứng dụng rộng rãi vào thực tế, trở thành 49 quy trình thường quy phòng kiểm nghiệm nước ứng dụng quy trình định lượng natri benzoat thực phẩm chế biến sẵn có ý nghĩa thống kê để đưa số thuyết phục tình hình sử dụng chất bảo quản natri benzoat sản phẩm thực phẩm chế biến sẵn, từ có giải pháp để tránh tình trạng lạm dụng chất bảo quản natri benzoat thực phẩm 50 KẾT LUẬN Sau thời gian thực nghiên cứu hoàn thành mục tiêu đề với kết thu sau: - Xây dựng điều kiện sắc ký tối ưu để định lượng natri benzoat chả lụa: + Hệ thống máy HPLC THERMO-DIONEX + Pha tĩnh: Cột Phenomemenex Gemini RP-C18 (250mm x 4,6mm x 5µm) + Pha động: MeOH - Acid formic 0,1% (70 : 30) + Tốc độ dòng: 1mL/phút + Thể tích tiêm mẫu: 20µL + Bước sóng phát hiện: 235nm + Thời gian phân tích : 15 phút - Xây dựng dược cơng thức tính hàm lượng natri benzoat mẫu thử : Trong đó: St diện tích đỉnh mẫu thử Sc diện tích đỉnh mẫu chuẩn mc lượng cân chất chuẩn C% hàm lượng chất chuẩn Dt độ pha loãng mẫu thử Dc độ pha loãng mẫu chuẩn mt lượng cân mẫu thử - Phương pháp xây dựng thẩm định tiêu: Tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác, độ đúng, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) đạt yêu cầu Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng natri benzoat mẫu chả lụa thị trường không phát 03 mẫu chả lụa lấy thị trường có chứa chất bảo quản natri benzoat hàm lượng thấp quy định 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Duy Trường, Đặng Văn Chính (2014), “Tỷ lệ sử dụng natri benzoate kali sorbat bảo quản số thực phẩm chợ tỉnh Tây Ninh”, Tạp chí Y học TP.HCM, 18 (6), 68-73 Chả lụa, từ URL: https://baotriem91tp.wordpress.com/2011/12/04/ch%E1%BA%A3-l %E1%BB%A5a/ Science Vietnam, Natri Benzoat: Tính chất, chế hoạt động, cơng dụng, từ URL: https://sciencevietnam.com/tinh-chat-co-che-hoat-dong-cong-dung-cuanatri-benzoat-la-gi Sở Khoa học công nghệ tỉnh Bạc Liêu, Nghiệm thu kết thực đè tài “Đánh giá tình hình sử dụng phụ gia thực phẩm (Natribenzoat, Hàn the) sản xuất chả lụa, pa tê địa bàn tỉnh Bạc Liêu”, từ URL: http://skhcn.baclieu.gov.vn/DETAIDUANKHCN/default.aspx? Source=/DETAIDUANKHCN&Category=&ItemID=162&Mode=1 Viện Y học ứng dụng Việt Nam (2016), Phụ gia thực phẩm natri benzoate có hại cho sức khỏe hay không?, từ URL: http://vienyhocungdung.vn/phu-giathuc-pham-natri-benzoate-co-hai-cho-suc-khoe-hay-khong20160505110424632.htm Tiếng Anh Yen T.H Hoang and An T.L Vu (2016), “Sodium Benzoate and Potassium Sorbate in Processed Meat Products Collected in Ho Chi Minh City, Vietnam”, International Journal on Advamced Science Engineering Information Technology, (4), 477-482 52 PHỤ LỤC PHỤ LUC 1: Sắc ký đồ khảo sát dung môi pha động 53 PHỤ LUC 2: Sắc ký đồ khảo sát bước sóng 54 PHỤ LUC 3: Sắc ký đồ khảo sát mẫu thử PHỤ LUC 4: Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết 55 PHỤ LUC 5: Sắc ký đồ thẩm định tính tương thích hệ thống 56 57 PHỤ LUC 6: Sắc ký thẩm định độ đặc hiệu 58 PHỤ LUC 7: Sắc ký đồ thẩm định tính tuyến tính 59 PHỤ LUC 8: Sắc ký đồ thẩm định độ xác 60 PHỤ LUC 9: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng 61 62 PHỤ LUC10: Sắc ký đồ Giới hạn phát giới hạn định lượng PHỤ LUC11: Sắc ký đồ mẫu ứng dụng ... tiêu sau: - Xây dựng thẩm định quy trình phân tích chất bảo quản natri benzoate thực phẩm (chả lụa) phương pháp HPLC - Ứng dụng quy trình thẩm định để phân tích natri benzoate số mẫu chả lụa thu... phát quy trình phân tích nhằm xác định lượng nhỏ chất phân tích mẫu thử mà quy trình phát Xác định giới định lượng quy trình phân tích nhằm xác định lượng nhỏ cuả chất phân tích mẫu thử mà quy trình. .. hóa quy trình chiết xuất natri benzoat chả lụa 20 3.2.1 Khảo sát quy trình chiết xuất natri benzoat chả lụa .20 3.2.2 Khảo sát số lần chiết kiệt natri benzoat chả lụa 22 3.3 Kết thẩm định quy