Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 50, 2021 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ARSENIC VƠ CƠ VÀ ARSENIC HỮU CƠ TRONG NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT TẠO HYDRIDE ĐỖ THỊ LONG, NGUYỄN ĐÌNH CHIỂU, HỒ LƯƠNG THƯỞNG Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh dothilong@iuh.edu.vn, Tóm tắt Đã thẩm định thành cơng quy trình phân tích thành phần arsenic nước mắm phương pháp HG-AAS Hàm lượng arsenic tổng (tAs) phân tích sau phá mẫu phương pháp vơ hóa khơ ướt kết hợp bình Teflon nhiệt độ 450 oC sau khử As (V) As (III) hỗn hợp chất khử KI/acid ascorbic Với arsenic vô (iAs), mẫu thủy phân dung dịch HCl 14 giờ, tiếp tục chuyển As (V) As (III) phản ứng với hydrazine 1,5% Dùng CHCl3 để chiết chiết lại HNO3 Hàm lượng arsenic hữu (oAs) tính hiệu số hàm lượng tAs iAs Đã xác định khoảng nồng độ tuyến tính - 30 μg/L phương trình đường chuẩn y = 0,0128x + 0,0007 với R² = 0,9996 khoảng nồng độ - 20 μg/L Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp phân tích tAs iAs có giá trị 0,015 mg/L, 0,05 mg/L Đối với tAs, hiệu suất thu hồi chuẩn arsenic hữu arsenic vô khoảng 81– 109%; độ lặp lại độ tái lập phịng thí nghiệm RSDr < 10% RSDR < 12% Với iAs, hiệu suất thu hồi nằm khoảng 83,6 – 110%; RSDr < 11%, RSDR < 14% Đã đánh giá hàm lượng As mẫu nước mắm đại diện, số mẫu độ đạm cao có hàm tAs vượt mức cho phép Bộ Y Tế Việt Nam, chủ yếu oAs Từ khóa hàm lượng arsenic tổng, hàm lượng arsenic vơ cơ, nước mắm, HG-AAS, chiết VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF INORGANIC AND ORGANIC ARSENIC IN FISH SAUCE BY HYDRIDE GENERATION ATOMIC ABSORPTION SPECTROSCOPY Abstract The validation of an analytical method was carried out for the determination of arsenic components in fish sauce by HG-AAS The total arsenic content (tAs) was analyzed after digesting the sample by dry and wet combined digestion method in a Teflon flask at 450 °C and then reducing As (V) to As (III) with a mixture of reducing agents KI/ascorbic acid For inorganic arsenic content (iAs), the sample was hydrolyzed with HCl solution for 14 hours, converted As (V) to As (III), then reacted with hydrazine 1.5% Extracted in CHCl3 and re-extracted in HNO3 The organic arsenic content (oAs) was calculated by the difference tAs and iAs Determined the linear concentration range - 30 μg/L and the standard curve was y = 0.0128x + 0.0007 with R² = 0.9996 at the concentration range - 20 μg/L LODs, LOQs for total and inorganic arsenic contents were found and all they were 0.015 mg/L and 0.05 mg/L, respectively For total arsenic, the recovery efficiencies on the organic arsenic standard and inorganic arsenic standard all ranged from 81 to 109%; repeatability RSDr < 10% and reproducability RSDR < 12% For inorganic arsenic, the recovery efficiency ranged from 83.6 to 110%; RSDr < 11% and RSDR < 14% Determined As content in representative fish sauce samples, some samples of high protein had total As content exceeding the permitted level of the Ministry of Health, but mainly was organic As Keywords total arsenic content, inorganic arsenic content, fish sauce, HG-AAS, extraction MỞ ĐẦU Nước mắm gia vị thường sử dụng hầu hết ăn người Việt Nam nói riêng nước Đơng Á nói chung Nước mắm khơng giúp tăng hương vị ăn mà cịn nguồn cung cấp dinh dưỡng số loại axit amin thiết yếu hay tăng cường chất sắt để chống lại tình trạng thiếu sắt nhiều quốc gia [1-3] Nước mắm chế biến cách ủ hỗn hợp nguyên liệu gồm cá muối theo tỉ lệ định thời gian từ năm trở lên Tuy arsenic sinh vật biển chủ yếu dạng © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ARSENIC VÔ CƠ VÀ ARSENIC HỮU CƠ TRONG 185 NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT TẠO HYDRIDE hữu (oAs) không độc, trình sản xuất thực phẩm lên men cá để sản xuất nước mắm làm thay đổi dạng tồn Do đó, tổng nồng độ arsenic (tAs) không phản ánh hết mức độ nguy hiểm không cung cấp đầy đủ thông tin rủi ro liên quan đến việc tiêu thụ nước mắm Chính thế, vấn đề thành phần arsenic nước mắm, đặc biệt nước mắm truyền thống, gây tranh cãi khiến dư luận quan tâm năm gần Mối lo ngại phơi nhiễm iAs chế độ ăn uống nguy ảnh hưởng đến sức khỏe nhấn mạnh đánh giá gần Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA), Tổ chức lương thực nông nghiệp Liên hợp quốc/Tổ chức Y tế Thế giới (FAO/WHO) Ủy ban phụ gia thực phẩm (JECFA) [4-5] Việc xác định hàm lượng riêng phần oAs iAs thực phẩm giúp kiểm tra mức độ an tồn sản phẩm mà cịn tính tốn lượng tiêu thụ để đánh giá mức độ phơi nhiễm arsenic để hiểu nguy ảnh hưởng đến sức khỏe người [6] Vì lý này, việc đưa phương pháp giúp phân tích nhanh, xác hàm lượng tAs, oAs, iAs phù hợp điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, giúp nhà sản xuất quan kiểm định dễ dàng kiểm soát đánh giá chất lượng sản phẩm quan tâm Phương pháp phân tích áp dụng phổ biến để xác định thành phần arsenic dựa thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao kết nối với đầu dò HPLC-ICP-MS [7,8] hay HPLC-HG-AAS [9] Các phương pháp tách phân tích dạng arsenic với độ xác độ nhạy cao, lại đòi hỏi hệ thống máy đắt tiền, khơng sẵn có nhiều phịng thí nghiệm Phương pháp AAS bên cạnh việc dễ dàng áp dụng để phân tích hàm lượng arsenic tổng nhiều đối tượng mẫu, HG-AAS sử dụng để xác định hàm lượng arsenic vô số đối tượng mẫu nhờ tính linh hoạt chi phí thấp thiết bị [10-14] Tuy nhiên, với nước mắm, việc sử dụng phương pháp HG-AAS để phân tích riêng phần oAs, iAs chưa nghiên cứu Do đó, nhiệm vụ đề tài đặt dựa vào phương pháp phân tích thành phần arsenic HG-AAS có nay, tối ưu hóa điều kiện yếu tố ảnh hưởng để đưa phương pháp phân tích thành phần arsenic nước mắm, thẩm định phương pháp sử dụng phương pháp để đánh giá hàm lượng thành phần arsenic số mẫu nước mắm đại diện THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất thiết bị Hóa chất Các hóa chất có độ tinh khiết phân tích Merck (Darmstadt, Germany) gồm axit nitric (HNO3), 65 %; axit clohydric (HCl), 38%; axit bromic (HBr), 48%; hydrazine sulfate ((N2H5)HSO4), 99%; chloroform (CHCl3), 99%; sodium borohydride (NaBH4), 98%; natri hydroxit (NaOH), 98%; magie nitrate (Mg(NO3)2.6H2O), 98%; acid ascobic (C6H8O6), 99,7%, kali iodua (KI), 99,5%; chuẩn gốc arsenic(III), 1000 mg/L; chuẩn gốc arsenic (V), 1000 mg/L chuẩn asenobetaine (AB), 98,5% Sigma Dung dịch NaBH4 1% (w/v) pha dung dịch NaOH 0,5%, sử dụng 07 ngày, bảo quản 20 oC Các dung dịch chuẩn thứ cấp As (III) 10 mg/L As (III) 100 µg/L chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc arsenic (III) 1000 mg/L As (III) 10 mg/L dung dịch HCl 0,2 N Các dung dịch chuẩn thứ cấp As (V) 10 mg/L As(V) 100 µg/L chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc As (V) 1000 mg/L As (V) 10 mg/L HNO3 0,1N Thiết bị Nghiên cứu thực Máy quang phổ hấp thu nguyên tử AAS-ICE 3500_Thermo kết hợp Bộ phân tích hydride VP100 _Thermo Bộ gia nhiệt có kiểm sốt EC100_Thermo Ngồi ra, độ tái lập phương pháp cịn đánh giá Máy quang phổ hấp thu nguyên tử 240FS_Agilent kết hợp Bộ phân tích hydride VGA 77 AAS_Agilent 2.2 Mẫu chuẩn bị mẫu Sử dụng mẫu nước mắm đại diện Ba mẫu mua từ siêu thị, gồm mẫu nước mắm cơng nghiệp có độ đạm < 15 gN/L; hai mẫu nước mắm truyền thống có độ đạm 23 – 27 gN/L 34 – 42 gN/L Hai mẫu nước mắm nhà dân tự làm nhằm phục vụ cho nhu cầu gia đình có độ đạm > 45 gN/L Các mẫu sau mua nhận bảo quản nhiệt độ phòng tránh ánh sáng mặt trời © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 186 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ARSENIC VƠ CƠ VÀ ARSENIC HỮU CƠ TRONG NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT TẠO HYDRIDE 2.3 Thẩm định phương pháp Khoảng tuyến tính đánh giá cách phân tích trực tiếp dung dịch chuẩn As (III) khoảng nồng độ từ đến 50 µg/L Từ xây dựng đường hồi quy tuyến tính, vào hệ số tương quan (R2) độ chệch nồng độ i để công bố khoảng tuyến tính Khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn lựa chọn dựa vào khoảng tuyến tính nồng độ chất phân tích đối tượng mẫu Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) tính dựa vào kết phân tích lặp lại 11 mẫu trắng theo cơng thức (1) (2) Trong X0 SD giá trị trung bình độ lệch chuẩn từ kết phân tích hàm lượng arsenic mẫu trắng Sau thu LOD LOQ, tiếp tục đánh giá lại hiệu suất thu hồi nồng độ LOQ chuẩn arsenic hữu vô để khẳng định giá trị LOD, LOQ công bố cho phương pháp tin cậy 𝐿𝑂𝐷 = 𝑋0 + 𝑆𝐷 (1) 𝐿𝑂𝐷 = 10 𝐿𝑂𝐷 (2) Độ lặp lại phương pháp thực mẫu chọn, mẫu thực lần ngày Từ kết thu được, mẫu tính 𝑋̅, 𝑆𝑟(𝑖) , RSDr để đánh giá độ lặp lại theo công thức (3) (4): 𝑆𝑟(𝑖) = ∑(𝑋𝑖 −𝑋̅) (3) 𝑛−1 𝑆𝑟(𝑖) 𝑆𝑅𝐷𝑟 (%) = ̅ 100 𝑋 (4) Hiệu suất thu hồi phương pháp phân tích đánh giá dựa vào kết phân tích mẫu mẫu thêm chuẩn Các thí nghiệm thực mẫu khác mẫu lần để lấy giá trị trung bình Hiệu suất thu hồi tính theo cơng thức (5) Trong đó, 𝐶𝑚ẫ𝑢+𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝐶𝑚ẫ𝑢 nồng độ mẫu mẫu thêm chuẩn thu thực nghiệm 𝐶𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 nồng độ chuẩn thêm vào 𝐻(%) = 𝐶𝑚ẫ𝑢+𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 −𝐶𝑚ẫ𝑢 𝐶𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 (5) Độ tái lập phương pháp đánh giá dựa vào kết thử nghiệm sử dụng phương pháp tối ưu, mẫu, hai phòng thử nghiệm khác người thao tác khác Thực phân tích lặp lại n lần mẫu (n ≥ 7) Đối với mẫu nước mắm không phát arsenic, sử dụng mẫu thêm chuẩn nồng độ LOQ để đánh giá độ tái lập phương pháp Từ kết phân tích, tính tốn độ tái lập (RSDR) theo công thức từ (6) – (10) 𝑆𝑟 =√ Với fi = 𝑛 − ∑ fi ×S2ri p (6) ∑ fi ̅ ̿ = ∑i=1 Xi X p S2L = (7) p ̅ i -X ̿) ∑i=1 (X p-1 - S2r n (8) SR =√S2r +S2L RSDR (%)= (9) SR ×100 ̿ X (10) Trong đó, 𝑆𝑟𝑖 độ lệch chuẩn tập số liệu thu phịng thí nghiệm mẫu, tính ̅ i X ̿ giá tương tự theo (4); fi bậc tự tập số liệu; 𝑆𝑟 độ lệch chuẩn lặp lại; X trị trung bình tập số liệu hai tập số liệu; SL phương sai phịng thí nghiệm; SR độ tái lập PTN; RSDR độ tái lập PTN tương đối Độ tái lập lại đánh giá dựa vào tỉ số HorRat (R) [15,16] sau: 𝑃𝑅𝑆𝐷𝑅 = 𝐶 −0.15 (11) 𝑅𝑆𝐷 𝐻𝑜𝑟𝑅𝑎𝑡(𝑅) = 𝑃𝑅𝑆𝐷𝑅 𝑅 © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh (12) THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ARSENIC VƠ CƠ VÀ ARSENIC HỮU CƠ TRONG 187 NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT TẠO HYDRIDE Phương pháp đạt yêu cầu giá trị tỉ số HorRat = 0,5 ÷2 Trong C nồng độ tỉ lệ khối lượng Nếu HorRat (R) nhỏ giới hạn ( 2) mẫu thử khơng đồng nhất, cần tối ưu hóa đào tạo thêm kỹ thí nghiệm, phân tích giới hạn định lượng phương pháp sử dụng không đạt yêu cầu [16] Ngồi ra, phương pháp phân tích iAs, để kết có tính thuyết phục hơn, độ chọn lọc arsenic vô khảo sát cách tiến hành so sánh hàm lượng iAs mẫu thêm chuẩn AB mẫu thêm hai chuẩn AB As (V) Mẫu chứng minh trước khơng chứa As Thực phân tích n lần (n ≥ 5) theo qui trình phân tích mẫu đánh giá kết thu 2.4 Quy trình chiết arsenic tổng Quy trình chiết arsenic tổng sau khảo sát tối ưu dựa phương pháp phân tích thành phần arsenic thực phẩm thức ăn chăn nuôi [17] sau: Hút mL mẫu thử cho vào bình Teflon, thêm mL HNO3 đậm đặc mL H2O2, để yên 15 phút, đóng chặt bình teflon, đặt tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ khoảng 150 oC Lấy dung dịch sau xử lý cho vào chén nung, thêm mL Mg(NO3)2 7,5%, làm khơ hồn tồn bếp điện Sau cho vào lị nung, gia nhiệt 450 oC đến mẫu tro trắng (khoảng – h) Lấy cốc khỏi lò nung, để nguội Mẫu sau xử lý làm nguội, hòa tan 10 mL nước cất, thêm mL dung dịch HCl M, thêm tiếp mL dung dịch KI 5% mL acid ascobic 5% Làm ấm nhiệt độ 40 – 50 oC 30 phút, để nguội, định mức lên 50 mL nước cất Dung dịch cuối phân tích máy AAS kết nối với hóa hydride VP100 Hàm lượng As tổng mẫu tính theo cơng thức sau: 𝑚𝑔 ) 𝐿 𝑡𝐴𝑠 ( 𝐶 𝑉 đ𝑚 = 𝑉 đ𝑐.1000 𝑚 (13) Trong đó, tAs hàm lượng As tổng (mg/L); Cđc nồng độ arsenic tính từ đường chuẩn, µg/L; Vđm thể tích định mức (mL) Vm thể tích mẫu (mL) 2.5 Quy trình chiết arsenic vơ Quy trình chiết arsenic vơ sau khảo sát tối ưu dựa phương pháp phân tích thành phần iAs ngũ cốc, nấm thực phẩm có nguồn gốc từ biển [18] sau: Hút mL mẫu thử cho vào ống ly tâm, thêm vào mL nước cất, lắc máy lắc học phút để mẫu nước trộn Thêm 18 mL axit HCl 38%, tiếp tục lắc máy lắc học 15 phút Để yên cho trình thủy phân diễn ra, thời gian từ 12 đến 15 Thêm mL axit HBr 48%, mL Hydrazine 1,5% Lắc máy lắc học 30 giây Thêm 10 mL CHCl3, lắc phút Để yên phút, không tách pha tiến hành ly tâm phút tốc độ 2000 rpm Chiết lớp CHCl3 qua ống ly tâm khác, thực thêm lần Ly tâm pha CHCl3 phút 2000 rpm, loại bỏ pha axit cịn sót lại bề mặt pha CHCl3 Lọc dung dịch sau chiết qua màng lọc PTFE 0,45 µm Thêm mL HNO3 2% vào dung dịch sau lọc Lắc phút, để yên phút Chiết lấy lớp HNO3 (lớp trên), thực thao tác thêm lần Chuyển tất dung dịch sau xử lý cho vào chén nung, thêm mL Mg(NO3)2 7,5%, làm khơ hồn tồn bếp điện Sau cho vào lị nung, gia nhiệt 450 oC đến mẫu tro trắng Lấy cốc khỏi lò nung, để nguội Mẫu sau xử lý làm nguội, thêm 10 mL nước cất, mL dung dịch HCl M, thêm tiếp mL dung dịch KI 5% mL acid ascobic 5% Làm ấm nhiệt độ 40 – 50 oC 30 phút, định mức lên 50 mL nước cất đem phân tích máy AAS Hàm lượng As vơ mẫu tính theo công thức sau: 𝑚𝑔 ) 𝐿 𝑖𝐴𝑠 ( 𝐶 𝑉 đ𝑚 = 𝑉 đ𝑐.1000 𝑚 (14) Trong đó, iAs hàm lượng As vô mẫu; Cđc nồng độ arsenic tính từ đường chuẩn, µg/L; Vđm thể tích định mức (mL) Vm thể tích mẫu (mL) 2.6 Các thông số thiết bị yếu tố ảnh hưởng đến q trình tạo hydride Các thơng số thiết bị yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo hydride khảo sát tối ưu dựa số liệu tham khảo [17] trình bày Bảng 1: Bảng Các điều kiện thí nghiệm AAS kết hợp VP100 © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 188 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ARSENIC VƠ CƠ VÀ ARSENIC HỮU CƠ TRONG NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT TẠO HYDRIDE STT 10 11 12 13 14 Nội dung Thiết bị Bước sóng phân tích Nhiệt độ ngun tử hóa Dịng đèn cathode Chiều cao đầu đốt Khe (Slit) Hiệu chỉnh Tốc độ dòng bổ trợ Ar Tốc độ quay bơm nhu động Lưu lượng HCl Lưu lượng NaBH4 Lưu lượng mẫu Nồng độ HCl Nồng độ NaBH4 Thông số AAS iCE 3500 kết hợp VP100 EC100 - Thermo 193,7 nm 900 oC 85 % Max (10 mA) 17 mm 0,5 nm D2 200 mL/phút 30 vòng/phút 0,7 mL/phút 1,6 mL/phút 7,5 mL/phút 5M 0,75 % 0,5 % NaOH (m/v) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết thẩm định phương pháp Khoảng tuyến tính đường chuẩn Dựa kết đo lần nồng độ arsenic cho thỏa mãn yêu cầu độ lệch chuẩn tất điểm chuẩn không 2,5%, thu khoảng tuyến tính từ đến 30 μg/L với hệ số hồi quy R2 = 0,9995 Tuy nhiên, dựa vào hàm lượng arsenic thường có mẫu nước mắm để hạn chế sai số đường chuẩn gây ra, chọn khoảng nồng độ dựng đường chuẩn - 20 µg/L Phương trình đường chuẩn hệ số hồi quy thu tương ứng y = 0,0128x + 0,0007, R² = 0,9996 LOD LOQ Bằng cách phân tích 11 lần mẫu khơng chứa arsenic, xác định giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ hàm lượng arsenic tổng arsenic vô mẫu nước mắm 0,015 0,05 mg/L Tiến hành thêm chuẩn ngưỡng định lượng LOQ mẫu sử dụng thực phép phân tích lặp lại lần Hiệu suất thu hồi thí nghiệm riêng rẽ nằm khoảng 84,7 – 99,5%, 83,2 – 91,6% giá trị trung bình đạt 93,1%, 89,9% arsenic tổng arsenic vơ cơ, cho thấy phương pháp hồn tồn đáp ứng yêu cầu AOAC Appendix F (80 – 110%) [15] Ngoài giới hạn phát phương pháp thấp nhiều lần so với giới hạn tối đa cho phép nước chấm theo qui định Bộ Y tế Việt Nam [19] 1,0 mg/L, nên hoàn tồn phù hợp để phân tích hàm lượng arsenic với mục đích kiểm tra vệ sinh an tồn thực phẩm Hơn nữa, so với kết thu số tác giả sử dụng phương pháp HG-AAS mẫu gạo (LOQ iAs 15 mg/kg; tAs 23 mg/kg [20]), mẫu ngũ cốc, nấm thực phẩm có nguồn gốc từ biển (LOQ iAs 10 µg/g [18]); phương pháp SPE HGAAS mẫu gạo (LOD iAs 0,02 mg/kg [21]) phương pháp HPLC-ICP-MS mẫu thực phẩm (LOD tAs 0,3-0,4 mg/L [22]) cho thấy mức độ phù hợp phương pháp phân tích đề xuất Độ lặp lại Đối với tất mẫu nước mắm đại diện chọn, với SRDr (%)nằm ngưỡng cho phép theo AOAC Appendix F (