BÀO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định hàm lượng ure trong nước mắm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y Chủ đề :XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URE TRONG NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Giáo viên hướng dẫn: Danh sách sinh viên thực hiện: TP HCM - Tháng năm Dược phân tích Nhóm MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ Đặt vấn đề Tình hình nhiễm urea nước nắm Việt Nam .3 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng: Urê nước mắm Phương pháp nghiên cứu 2.1 Tính chất hóa học, hóa lý Ure 2.2 Sơ lược phương pháp xác định urea nước mắm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 2.4 Điều kiện quy trình trình thực 10 III TÍNH TỐN KẾT QUẢ .14 Kết khảo sát thành phần qua động, chương trình chạy gradient để tách N-9H-xanthen-9-ylurea 14 Kết khảo sát định danh phức N-9H-xanthen-9-ylurea 15 Kết khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất 16 Kết khảo sát bước sóng kích thích bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu huỳnh quang 18 Kết khảo sát thời gian phản ứng xanthydrol với ure độ bền phức N-9H-xanthen-9ylurea .19 5.1 Khảo sát thời gian phản ứng xanthydrol với ure 19 5.2 Khảo sát độ bền phức N-9H-xanthen-9-ylurea 20 Kết khảo sát ảnh hưởng biuret biure .21 Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn .23 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 25 Kết khảo sát giới hạn phát định lượng phương pháp .25 10 Kết khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu hiệu suất thu hồi mẫu nước mắm có thêm ure sử dụng chất khử tạp 26 10.1 Kết khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu sử dụng chất khử tạp 26 10.2 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi 27 11 Cơng thức tính nồng độ ure có mẫu .28 IV KẾT LUẬN 28 Dược phân tích Nhóm V TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 I ĐẶT VẤN ĐỀ Đặt vấn đề Thực phẩm yếu tố quan trọng song hành với sinh tồn lồi người Theo q trình tiến hố phát triển lồi người, thực phẩm phát triển theo, với tiến triển khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm phát triển Nhu cầu thực phẩm đáp ứng khơng dinh dưỡng mà cịn tính an tồn khơng gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng cần thiết Nguy ảnh hưởng đến sức khỏe từ thực phẩm không an toản mối lo lớn người dân tồn xã hội Vì mà kỹ thuật đánh giá mối nguy hại thực phẩm sức khỏe đòi hỏi phải phát triển để bắt kịp với công nghệ chế biến thức ăn ngày cao đa dạng, nhằm phát loại trừ bớt nguy tác hại đến thể người tiêu dùng Nước nắm loại thực phẩm sử dụng phổ biến nước ta, loại gia vị thường xuyên diện bữa ăn người Việt Việc xác đinh hàm lượng urea có nước mắn vấn đề người tiêu dùng quan tâm Tình hình nhiễm urea nước nắm Việt Nam Theo chemical codex đề nghị mức cho phép urea nước mắm 50mg/l Theo kết nghiên cứu Viện Pasteur Nha Trang công bố, 45 mẫu nước mắm chọn ngẫu nhiên thị trường Khánh Hịa mẫu có Hàm lượng urea lớn 0,1g/l, có mẫu lên đến 2,1g/l Trong đó, urea hồn tồn khơng có danh mục chất phụ gia thực phẩm Y tế ban hành Dược phân tích Nhóm II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng: Urê nước mắm Phương pháp nghiên cứu 2.1 Tính chất hóa học, hóa lý Ure Urea Hilaire Rouelle phát vào năm 1773 Cơng thức hóa học 2.1.1 2.1.2 - Tính chất hóa học Ure Dạng tinh thể bột màu trắng Phân tử lượng: 60,1 Khối lượng riêng: 1,34g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: 132-1350C pH (dung dich 10%): 7,2 Nguồn gốc hình thành urea nước mắm Có sẵn số loại cá, ví dụ cá Nhám có chứa urea da Do người bắt cá thêm vào để ướp cá Do người chế biến nước mắm thêm vào để tăng độ đạm sản phẩm Có thể hình thành cách tự nhiên trình chế biến nước mắm Dược phân tích 2.1.3 Nhóm Sự thải độc tính urea 2.1.3.1 Sự thải urea Trong thể urea chuyển hóa gan điều khiển N-acetylglutamat, sau chúng theo máu đến thận đào thải ngồi thơng qua nước tiểu Nồng độ urea máu 16-54 mg/ml nam 12-47mg/ml nữ 2.1.3.2 Độc tính urea Người sản xuất cho urea (chủ yếu dạng phân đạm) vào để ướp cá để tăng độ đạm có gốc độc thể người ammonium ( NH4+) nitrate (NO3) - NH4+ máu tăng cao, làm giảm pH máu, ngăn cản trình vận chuyển oxy, làm rối loạn phản ứng sinh hóa thể, da niêm mạc bị tím lại, - dẫn đến mê, chết Nitrate đến ruột chuyển hóa thành nitrite (NO 2-) gây Methaemoglobinemia, nitrite kết hợp với hemoglobin oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản vận chuyển oxy, dẫn đến có biểu nơn ói, chống váng, chóng mặt, tay chân - bủn rủn, tím tái, gây rối loạn thần kinh, đau nhức Nếu lượng urea mức gây giảm hoạt động tuyến giáp, rối loạn máu tính, rối loạn thần kinh, kéo dài làm da chuyển sang màu xám 2.2 Sơ lược phương pháp xác định urea nước mắm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 2.2.1 Nguyên lý phương pháp sắc khí lỏng hiệu cao- đầu dị huỳnh quang để xác định urea Cho urea tạo dẫn xuất với thuốc thử xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9ylurea đo đầu dò huỳnh quang (λex=213nm; λem=308nm) sau tách cột sắt khí pha đảo (C18) thiết bị HPLC Phản ứng thuốc thử Xanthydrol với urea: Sử dụng hệ phản ứng tự động phân tích Dược phân tích Nhóm carbamate để tạo dẫn xuất urea với xanthydrol (urea pha dung dịch ethanol xanthydrol pha propanol) mơi trường có thêm lượng nhỏ acid HCl 1,5M Dưới điều kiện sau phút chất tạo dẫn xuất tách thiết bị HPLC đo đầu huỳnh quang λex=213nm; λem=308nm Ở điều kiện này, urea phản ứng với xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea 2.2.2 Ưu nhược điểm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao a.Ưu điểm - Loại ảnh hưởng có độ tin cậy cao Chọn lọc có độ nhạy cao Xác định hàm lượng urea dạng vết b.Nhược điểm: giá thành cao đầu tư lớn 2.3 2.3.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Dụng cụ, thiết bị Thiết bị máy sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC) hãng Perkin Elmer – đầu dị huỳnh quang , bước sóng λex = 213 nm, λem = 308 nm Máy trang bị tiêm mẫu tự động hệ thống máy tính nối với phần mềm để thu nhận liệu  Hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao Dược phân tích Nhóm Hình: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp HPLC • Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có đường dung mơi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng bình chứa dung môi lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn tổng tỉ lệ đường 100% Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, sử dụng đường dung môi lúc mà thường sử dụng đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản giúp ổn định trình rửa giải Lưu ý: Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC Tất hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu pha hệ đệm phải hóa chất tích khiết dùng cho phân tích Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên peak tạp q trình phân tích • Bộ khử khí Degases Mục đích sử dụng khử khí nhằm lọai trừ bọt nhỏ cịn sót lại dung mơi pha động, tránh xảy số tượng có sau: - Tỷ lệ pha động đường dung môi không làm cho thời gian lưu peak thay đổi - Trong trường hợp bọt nhiều, khử khí khơng thể lọai trừ hết bơm cao áp khơng hút dung mơi, ảnh hưởng đến áp suất hoạt động hệ thống HPLC Dược phân tích Nhóm Trong trường hợp dẫn đến sai kết phân tích • Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt áp suất cao khỏang 250-600bar tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút • Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đồi Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (autosample) • Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 525cm đường kính 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,… Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột kiểu sắc ký • Đầu dị Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dị phù hợp Tín hiệu đầu dị thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên sở đó, người ta sản xuất lọai đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát chất hấp thụ quang Đây lọai đầu dị thơng dụng - Đầu dị hùynh quang (RF) để phát chất hữu chứa huỳnh quang tự nhiên dẫn suất có huỳnh quang - Đầu dị DAD (Detector Diod Array) có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thụ cực đại chất - Đầu dị khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng loại đường - Đầu dị điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… Dược phân tích Nhóm • Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dị phát Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý thơng số liên quan đến kết phân tich • In liệu Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn - Ethanol tuyệt đối – Merck - Propanol – 1- Merck - HCl 37% - Merck - Sodium acetate – Merck - Acetronitril dùng cho HPLC – Merck - Xanhthydrol – Fluka - Chuẩn urea ≥ 99% - Merck - Dung dịch xanthydrol 0,07M: hòa tan 140 mg xanthydrol dung dịch propanol – thành 10 ml Tránh ánh sáng trực tiếp - Dung dịch acid HCl 1,5M: lấy 174 ml dung dịch HCl đậm đặc 37% vào bình định mức L định mức nước cất đến vạch trao đổi ion - Dung dịch đệm sodium acetate 20 mM (pH = 7,2): hòa tan 1,64g sodium acetate thành L nước cất trao đổi ion Chỉnh dung dịch pH = 7,2 dung dịch acid acetic loãng máy pH Lọc qua giấy lọc 0,45µm - Dung dịch ZnSO4 2N: hòa tan 30g ZnSO4 thành 100ml nước cất trao đổi ion - Dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15%: hòa tan 15g K4Fe(CN)6.3H2O thành 100 ml nước cất trao đổi ion - Dung dịch Ethanol 75%: pha loãng 750 ml ethanol tuyệt đối thành 1L dung dịch nước cất - Dung dịch chuẩn: • Chuẩn 100ppm: cân 100mg chuẩn gốc urea >99% pha thành 100ml dung dịch nước cất • Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 10ppm: lấy 10ml dung dịch Dược phân tích Nhóm chuẩn 100ppm pha thành 100ml nước cất • Pha điểm chuẩn có nồng độ là: 0.1 ; 0.4 ; 0.6; 0,8 ;1.0 ppm cách hút vào 1.0 ; 4.0 ; 6.0 ; 8.0 ; 10.0ml dung dịch chuẩn trung gian định mức thành 100ml dung dịch cồn 2.4 75% Bình định mức: 10ml, 100ml, 1000ml Micropipet: 10 - 100µl 100 - 1000µl Điều kiện quy trình q trình thực 2.4.1 Điều kiện quy trình a Pha động - Dung môi A: Axetonitril - Dung môi B: Axetonitril dung dịch natri axetat (pH = 7,2) với tỷ lệ 36 : 64 (% thể tích); - Lọc dung mơi pha động qua màng lọc loại bỏ khí hòa tan cách để thiết bị siêu âm khoảng 10 trước sử dụng b Bước sóng kích hoạt 213 nm, bước sóng phát xạ 308 nm c Thể tích mẫu bơm: 20 µl d Chương trình gradient pha động Thời gian Tốc độ dịng Dung mơi A Dung môi B ml/min % % 1,3 100 8,00 1,3 100 8,01 1,3 100 12,00 1,3 100 12,01 1,3 100 30,00 1,3 100 Chú thích: Các thơng số tỉ lệ pha động, chương trình gradient pha động, thể tích mẫu bơm điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế thiết bị HPLC sử dụng 10 Dược phân tích Nhóm Biểu đồ II-2: Sắc kí đồ để định danh N-9H-xanthen-9-ylurea dựa theo thời gian lưu cột C18 Nhận xét: Qua sắc kí đồ thu ta thấy sắc kí đồ thu ba nồng độ có thời gian lưu trùng sau ba lần chạy chiều cao peak tỷ lệ với nồng đọ chất cần phân tích Điều cho ta xác nhận peak có thời gian lưu 12 phút ứng với hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea Kết khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất Giai đoạn quan trọng q trình chuẩn bị mẫu ảnh hưởng nhiều đến kết xác định urea Phản ứng urea xanthydrol để tạo thành hợp chất N-9Hxanthen-9-ylurea phản ứng thuận nghịch nên việc khảo sát nồng độ xanthydrol HCl quan trọng Để tối ưu hóa nồng độ cần dùng chúng tơi sử dụng phần mềm thống kê Umetrics để khảo sát với 11 thí nghiệm khác theo bảng sau: 16 Dược phân tích Nhóm Hình II-2: Các thơng số khảo sát xanthydrol (mol/L*/10) thể tích HCl 1,5 M (µL) theo độ hấp thu Nhận xét: Từ hình ảnh thu phân tích từ phần mềm Umetric cho ta thấy hàm lượng xanthydrol lớn 0,06 mol/L nồng độ HCl từ 10-45 µL HCl 1,5 M tín hiệu thu cao Đó vùng tối ưu phản ứng Ở hàm lượng xanthydrol nhỏ tín hiệu thu Hàm lượng chất tạo dẫn xuất N-9H-xanthen-9-ylurea phụ thuộc vào hàm lượng xanthydrol dùng tham gia phản ứng môi trường HCl, phản ứng ure xanthydrol để tạo thành N-9H-xanthen-9-ylurea phản ứng thuạn nghịch acid HCl đóng vai trị mơi trường phản ứng 17 Dược phân tích Nhóm Kết khảo sát bước sóng kích thích bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu huỳnh quang Cố định bước sóng phát xạ, thay đổi bước sóng kích thích dung dịch chuẩn tạo dẫn xuất có nồng độ 0,3 ppm Kết thu sau: Biểu đồ II-7: Mối quan hệ bước sóng kích thích diện tích peak Thực khảo sát tương tự, tiến hành cố định bước sóng kích thích thay đổi bước sóng phát xạ dung dịch chuẩn tạo dẫn xuất có nồng độ 0,3 ppm Kết thu sau: 18 Dược phân tích Nhóm Biểu đồ II-8: Mối quan hệ bước sóng kích thích diện tích peak Nhận xét: Qua số liệu thấy bước sóng kích thích 213 nm bước sóng phát xạ 308 nm tins hiệu thu cực đại Kết khảo sát thời gian phản ứng xanthydrol với ure độ bền phức N-9H-xanthen-9-ylurea 5.1 Khảo sát thời gian phản ứng xanthydrol với ure Tiến hành khảo sát thời gian phản ứng xanthydrol với ure theo thhowif gian độ bền phức hợp N-9H-xanthen-9-ylurea, kết thu theo hình sau: 19 Dược phân tích Nhóm Biểu đồ II-9: Biểu đồ khảo sát thời gian tạo phản ứng với ure xanthydrol 5.2 Khảo sát độ bền phức N-9H-xanthen-9-ylurea Biểu đồ II-10: Biểu đồ thể độ bền chất dẫn xuất theo thời gian Nhận xét: Biểu đồ cho thấy chất nhận xét bền đạt tín hiệu cực đại sau thời gian dẫn xuất phút bền theo thời gian Việc dẫn xuất bền thuận lợi cho việc chuẩn bị mẫu phân tích hạn chế gây sai lệch phân tích mẫu liên tục 24 Điều kiện 20 Dược phân tích Nhóm tốt giúp chuẩn bị mẫu tạo dẫn xuất hàng loạt thiết bị có hệ thống tiêm mẫu tự động Kết khảo sát ảnh hưởng biuret biure Sau tiến hành khảo sát nồng độ ure 0,64 ppm có thêm nồng độ biuret 0,64 ppm; 6,4 ppm 6,4 ppm + 2,2 ppm biurea, sắc kí đồ thu sau: Biểu đồ II-11: Khảo sát ảnh hưởng biuret Biểu đồ II-12: Khảo sát ảnh hưởng biuret 21 Dược phân tích Nhóm Biểu đồ II-13: Khảo sát ảnh hưởng biuret biurea Biểu đồ II-14: Khảo sát ảnh hưởng biuret Kết khảo sát sau: 22 Dược phân tích Nồng độ Nhóm ppm 0,64 ppm 6,4 ppm 64 ppm biuret Diện tích 6,4 + 2,2 ppm biurea 5133877 5096394 5141317 5152212 5163231 peak Bảng II-2: Bảng khảo sát ảnh hưởng nồng độ biuret đến diện tích peak urea Nhận xét: Qua sắc kí đồ thu ta thấy biuret biurea ảnh hưởng không đáng kể đến trình phân tích ure Việc sử dụng thuốc thử xanthydrol nồng độ đủ để phản ứng với ure hơng bị ảnh hưởng mẫu có hợp chất biuret biure Các peak biurea, ure biuret tách hồn tồn sắc kí đồ Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn Từ giới hạn định lượng mẫu 1,92 ppm hàm lượng nhỏ suy đường chuẩn 0,09 ppm Từ giá trị tiến hành khảo sát xây dựng dãy chuẩn có nồng độ 0,074; 0,147; 0,295; 0,591; 1,033 1,47 ppm Kết thu sau: STT C (mg/l) Diện tích 0,074 825589 0,148 1564745 0,295 2979736 0,591 6111304 1,034 9911857 1,470 11630994 Bảng II-3: Bảng khảo sát mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak 23 Dược phân tích Nhóm Biểu đồ II-15: Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích peak Nhận xét: Qua khảo sát mối quan hệ tuyến tính chúng tơi nhận thấy nồng độ từ 0,074 đến 1,033 ppm hệ số tương quan tốt theo hàm bậc : y= ax +b với hệ số tương quan R2 = 0,998 Từ nồng độ từ 0,074 đến 1,47 ppm hệ số tương quan không theo hàm bậc 1: y = ax + b với hệ số tương quan R2 = 0,977 Từ kết cho thấy nồng độ ure tạo dẫn xuất lớn ppm tín hiệu thu vượt khỏi thang dò đầu dò ( tín hiệu đầu dị đo diện tích tối đa (10 7) tín hiệu khơng cịn tuyến tính theo hàm y = ax + b Như hàm lượng ure có mẫu có giá trị từ 1,92 ppm đến 20 ppm kết phân tích ure thu sau định mức pha loãng nằm khoảng đường chuẩn Trong trường hợp mẫu phân tích có hàm lượng ure lớn khoảng ta phải pha lỗng mẫu để kết phân tích nằm đường chuẩn Nếu mẫu có nồng độ nhỏ 1,92 ppm ta phải lấy lượng mẫu lớn dùng thể tích tiêm mẫu thiết bị lớn 24 Dược phân tích Nhóm Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp Sau tiến hành thực chạy lần lặp lại chuẩn 0,3 ppm điều kiện giống Kết thu sau: STT Diện tích peak Thời gian lưu Lần 2764682 11,787 Lần 2782794 11,780 Lần 2748659 11,793 Lần 2713425 11,787 Lần 2765655 11,793 Lần 2663676 11,773 SD 44057 0,008 RSD(%) 1.61 0,066 Bảng II-4: Độ lặp lại thời gian lưu diện tích peak Nhận xét: Qua kết khảo sát lần sắc kí dung dịch cho thấy thời gian lưu tR cấu tử không sai lệc 0,07% Sự ổn định mặt thời gian lưu dựa kết khảo sát nêu cho thấy sử dụng thời gian lưu làm yếu tố định danh Độ lặp lại tín hiệu: Sự ổn định độ lặp lại tương đối trng bình lần chạy cấu tử không 1,61% Sự lặp lại tốt cho phép ta định lượng cách xác sai lệch tín hiệu ổn định Kết khảo sát giới hạn phát định lượng phương pháp Các thực tính giới hạn phát giới hạn định lượng sau: từ giá trị thực chạy 10 mẫu trắng Tính độ lệch chuẩn diện tích peak thu mẫu trắng Giới hạn phát hiện: LOD = Diện tích peak trung bình mẫu trắng + 3SD diện tích mẫu trắng 25 Dược phân tích Nhóm Giới hạn định lượng: LOQ = LOD*10/3 - Giới hạn phát phương pháp là: 0,58 mg/L - Giới hạn định lượng phương pháp là: 1,92 mg/L Nhận xét: Với giới hạn phát phương pháp định lượng hàm lượng ure mẫu nồng độ thấp ( mẫu nước mắm có hàm lượng từ 1,92 ppm trở lên ) Với giới hạn phát định lượng phương pháp định lượng hàm lượng ure mẫu nước mắm nội sịnh hay nước mắm có bổ sung thêm urea 10 Kết khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu hiệu suất thu hồi mẫu nước mắm có thêm ure sử dụng chất khử tạp 10.1 Kết khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu sử dụng chất khử tạp Sau tiến hành khảo sát sử dụng khử tạp dung dịch mẫu dung dịch chuẩn, kết q uả thu theo hình sau: 26 Dược phân tích Nhóm Biểu đồ II-16: Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khử tạp lên trình chiết mẫu Nhận xét: Qua bảng số liệu ta nhận thấy dùng khử tạp (ZnSO4 2N + K4Fe(CN)6.3H2O) 15% tích dùng tương ứng ( 2; 4; 6; 8; 10 mL ) hiệu suất thu hồi cao > 90% Điều cho thấy sử dụng khử tạp khoảng ta thu hồi hiệu suất thu hồi tốt Việc dùng khử tạp đẻ loại bỏ số tạp chất mẫu tốt phù hợp cho qui trình xử lý mẫu 10.2 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi Sau tiến hành thực phân tích mẫu nước mắm có độ đạm là: 10 độ đạm; 20 độ đạm; 25 độ đạm; 30 độ đạm; 35 độ đạm; 40 độ đạm ( nước mắm 10N; 20N; 25N; 30N; 35N; 40N ) mẫu nước mắm có thêm chuẩn Kết thu sau: Tên mẫu Ký hiệu mẫu Hiệu suất thu hồi (%) M1 ( nước mắm 10N) M1+C1 87,64 M1+C2 100,45 M2+C1 91,86 M2+C2 100,67 M3+C1 113,41 M3+C2 99,35 M4+C1 79,57 M4+C2 97,16 M5+C1 111,21 M2 (nước mắm 20N) M3 ( nước mắm 25N) M4 (nước mắm 30N) M5 (nước mắm 35N) 27 Dược phân tích M6 (nước mắm 40N) Nhóm M5+C2 113,58 M6+C1 86,18 M6+C2 105,46 Bảng III-2: Bảng khảo sát hiệu suất thu hồi ure mẫu thực Qua bảng số liệu cho thấy hiệu suất thu hồi tốt ( hiệu suất thu hồi > 80% ) Tuy nhiên, có số kết có hiệu suất thu hồi lớn 100%, kết giải thích hiệu suất thu hồi cao sai số phép đo Hiệu suất thu hồi cho thấy phương pháp hoàn toàn phù hợp cho việc định lượng ure nước mắm 11 Cơng thức tính nồng độ ure có mẫu Cơng thức tính tốn sau: Cc * V * k X= M Trong đó: X: nồng độ ure có mẫu, mg/L V: thể tích định mức mẫu, mL M: thể tích mẫu, mL k: hệ số pha loãng IV KẾT LUẬN Các kết đề xuất phương pháp phân tích xác định hàm lượng ure nước mắm phương pháp sắc kí lỏng hiệu nặng cao-đầu dị huỳnh quang cho kết xác, độ tin cậy cao Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo yêu cầu châu Âu, với giá trị đạt sau: 28 Dược phân tích Nhóm - Hiệu suất thu hồi phương pháp (HPP %) xấp xỉ 100% khoảng nồng độ rộng Ure hàm lượng Ure mẫu đối chứng phù hợp tốt với phương pháp Urease chứng tỏ phương pháp tin cậy xét phương diện độ chọn lọc, độ độ xác - Giới hạn phát (LODphương pháp) thấp cho ure: LODure = 0,58( mg/L) - Giới hạn định lượng ( LOQ phương pháp ): LOQure = 1,92 (mg/L) V TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thị Lợi, Dương Trọng Phi, Đào Thị Vân Khánh cộng tác viên Nguyên cứu xác định hàm lượng ure hình thành tự nhiên trình sản xuất nước mắm Viện Pasteur Nha Trang, Y học TP.Hồ Chí Minh AOAC Official Method 941.04 (2006), Ure and ammonical nitrogen in animal feed urease method AOAC Official Method 983.01 (2006), Ure and methyleneureas ( water - soluble ) in fertilizers liquid chromatographic method Patricia A.Wright (1998), Ure production and transport in Teleoost fishes, University of Guelph, Ontario, Canada Shona Clark, Paul S.Francis (2007), Determination of ure using high - performance liquid chromatography with fluorescence detection after automated derivatisation with xanthydrol, Deakin University, Australia 6.http://123doc.org/document/2054431-tieu-luan-van-de-su-dung-ure-trong-bao-quanthuy-san.htm 29 Dược phân tích Nhóm Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8025:2009 30 ... lượng hàm lượng ure mẫu nồng độ thấp ( mẫu nước mắm có hàm lượng từ 1,92 ppm trở lên ) Với giới hạn phát định lượng phương pháp định lượng hàm lượng ure mẫu nước mắm nội sịnh hay nước mắm có... Các kết đề xuất phương pháp phân tích xác định hàm lượng ure nước mắm phương pháp sắc kí lỏng hiệu nặng cao- đầu dị huỳnh quang cho kết xác, độ tin cậy cao Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo... tượng: Urê nước mắm Phương pháp nghiên cứu 2.1 Tính chất hóa học, hóa lý Ure 2.2 Sơ lược phương pháp xác định urea nước mắm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao