SEMINAR xác định hàm lượng ure trong nước mắm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG UREA TRONG NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU CAO NĂNG NỘI DUNG I Đặt vấn đề II Đối tượng phương pháp Đối tượng Phương pháp 2.1 Dấu hiệu nhận biết 2.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 2.3 Điều kiện quy trình trình thực 2.4 Tiến hành phân tích máy III Tính tốn kết IV Kết luận V Tài liệu tham khảo I Đặt vấn đề • Thực phẩm yếu tố quan trọng song hành với sinh tồn lồi người • Nhu cầu thực phẩm đáp ứng dinh dưỡng mà cịn tính an tồn khơng gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng cần thiết • Nước nắm loại thực phẩm sử dụng phổ biến nước ta, loại gia vị thường xuyên diện bữa ăn người Việt • Việc xác đinh hàm lượng urea có nước mắm vấn đề người tiêu dùng quan tâm Tình hình nhiễm urea nước mắm nước ta • Theo chemical codex đề nghị mức cho phép urea nước mắm 50mg/l • Theo kết nghiên cứu Viện Pasteur Nha Trang công bố, 45 mẫu nước mắm chọn ngẫu nhiên thị trường Khánh Hịa mẫu có Hàm lượng urea lớn 0,1g/l, có mẫu lên đến 2,1g/l Trong đó, urea hồn tồn khơng có danh mục chất phụ gia thực phẩm Y tế ban hành II Đối tượng phương pháp Đối tượng: ure nước mắm Phương pháp 2.1 Dấu hiệu nhận biết 2.1.1 Tính chất lý hóa  Cơng thức phân tử tính chất vật lý  Dạng tinh thể bột màu trắng  Phân tử lượng: 60,1  Khối lượng riêng: 1,34g/cm3  Nhiệt độ nóng chảy: 132-1350C  pH (dung dịch 10%): 7,2 2.1.2 Tác hại urea đến sức khỏe  NH4+ máu tăng cao, làm giảm pH máu, ngăn cản trình vận chuyển oxy, da niêm mạc bị tím lại, dẫn đến mê, chết  Nitrate đến ruột chuyển hóa thành nitrite (NO 2-) gây Methaemoglobinemia  Nếu lượng urea mức gây giảm hoạt động tuyến giáp, rối loạn máu ác tính, rối loạn thần kinh, kéo dài làm da chuyển sang màu xám 2.2 Nguyên lý phương pháp Phương pháp: xác định urea sắc khí lỏng hiệu cao- đầu dị huỳnh quang  Cho urea tạo dẫn xuất với thuốc thử xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea đo đầu dò huỳnh quang (λex=213nm; λem=308nm) sau tách cột sắt khí pha đảo (C18) thiết bị HPLC  Phản ứng thuốc thử Xanthydrol với urea: Sử dụng hệ phản ứng tự động phân tích carbamate để tạo dẫn xuất urea với xanthydrol mơi trường có thêm lượng nhỏ acid HCl 1,5M Dưới điều kiện sau phút chất tạo dẫn xuất tách thiết bị HPLC đo đầu dò huỳnh quang λ ex=213nm; λem=308nm Ở điều kiện này, urea phản ứng với xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea 2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 2.3.1 Thiết bị Thiết bị máy sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC) hãng Perkin Elmer – đầu dò huỳnh quang , bước sóng λ ex = 213 nm, λem = 308 nm Máy trang bị tiêm mẫu tự động hệ thống máy tính nối với phần mềm để thu nhận liệu 2.3.2 Dụng cụ, hóa chất  Bình định mức: 10ml, 100ml, 1000ml  Micropipet: 10 - 100µl 100 - 1000µl - Ethanol tuyệt đối, Propanol – 1, HCl 37%, Acetronitril dùng cho HPLC, Chuẩn urea ≥ 99% – Merck - Xanhthydrol – Fluka - Dung dịch xanthydrol 0,07M - Dung dịch acid HCl 1,5M - Dung dịch ZnSO4 2N - Dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15% - Dung dịch Ethanol 75% Dung dịch chuẩn: • Chuẩn 100ppm: cân 100mg chuẩn gốc urea >99% pha thành 100ml dung dịch nước cất • Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 10ppm: lấy 10ml dung dịch chuẩn 100ppm pha thành 100ml nước cất • Pha điểm chuẩn có nồng độ là: 0.1; 0.4; 0.6; 0,8; 1.0 ppm cách hút vào 1.0; 4.0; 6.0; 8.0; 10.0ml dung dịch chuẩn trung gian định mức thành 100ml dung dịch cồn 75% 2.4 Điều kiện quy trình trình thực 2.4.1 Điều kiện quy trình  Pha động - Dung mơi A: Axetonitril - Dung môi B: Axetonitril dung dịch natri axetat (pH = 7,2) với tỷ lệ 36 : 64 (% thể tích) - Lọc dung mơi pha động qua màng lọc loại bỏ khí hịa tan cách để thiết bị siêu âm khoảng 10 trước sử dụng  Bước sóng kích hoạt: 213nm, bước sóng phát xạ 308nm  Thể tích mẫu bơm: 20 l  Chương trình gradient pha động 2.4.2 Quá trình thực a Các nội dung khảo sát b Quy trình xác định urea nước mắm V ml dung dịch mẫu vào bình định mức 100ml - Thêm 1g than hoạt tính - Thêm 20ml nước Định mức thành 100ml Lọc - Lấy V1 l dung dịch xanthyldrol - Thêm V ml dung dịch ZnSO4 2N - Thêm V ml dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15% 0,02M vào vial - Thêm V2 l dung dịch HCl 1,5M - Thêm V3 l dung dịch mẫu, lắc Để phút Định lượng HPLC đầu dò huỳnh quang 2.5 Tiến hành phân tích máy  Thiết lập phương pháp chạy máy • Các thơng số bao gồm thơng số cho hệ thống bơm, chương trình cho autosampler, chương trình gradient pha động, bước sóng kích thích bước sóng phát xạ cho đầu dị huỳnh quang • Sau tất yếu tố đạt yêu cầu, mẫu chuẩn mẫu thật tiêm vào máy dùng hệ thống tiêm mẫu tự động autosampler • Kết thu tiến hành định tính định lượng dựa vào phần mềm TCNAV hãng Perkin Elmer III Tính toán kết Kết khảo sát định danh phức N-9H-xanthen-9-ylurea Dựa thời gian lưu, tỷ lệ tương ứng theo nồng độ (0,1; 0,2; 0,3 ppm ) Sắc kí đồ thu được:  Nhận xét: ba nồng độ có tR trùng sau lần chạy, chiều cao peak tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích ứng với hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea peak có t R 12 phút Kết khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn C (mg/l) Diệnchuẩn tích có nồng độ 0,074; 0,147; 0,295; 0,591; 1,033; 1,47 •STTXây dựng dãy 0,074 825589 thu được: ppm 0,148Kết 1564745 0,295 2979736 0,591 6111304 1,034 9911857 1,470 11630994  Nhận xét: nồng độ (0,074 -1,033 ppm) hệ số tương quan tốt theo hàm bậc 1: y= ax +b với R2 = 0,998 Nồng độ (0,074 - 1,47 ppm ) hệ số tương quan không theo hàm bậc 1: y = ax + b với R2 = 0,977 Khi nồng độ ure tạo dẫn xuất lớn ppm tín hiệu thu vượt khỏi thang dị đầu dị, tín hiệu khơng cịn tuyến tính theo hàm y = ax + b 3 Kết khảo sát giới hạn phát định lượng phương pháp  Giới hạn phát hiện: LOD = Diện tích peak trung bình mẫu trắng + 3SD diện tích mẫu trắng  Giới hạn định lượng: LOQ = LOD*10/3  Giới hạn phát phương pháp là: 0,58 mg/L  Giới hạn định lượng phương pháp là: 1,92 mg/L  Nhận xét: phương pháp định lượng hàm lượng ure mẫu nồng độ thấp ( mẫu nước mắm có hàm lượng từ 1,92 ppm trở lên ) 4 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi • Thực phân tích mẫu nướcKýmắm có độ đạm lầnthu lượt Tên mẫu hiệu mẫu Hiệu suất hồilà: (%)10; 20; M1 + C1 10N) 25; 30; 35; M1 40 (vànước mẫumắm nước mắm có thêm chuẩn.87,64 Kết thu sau: M2 (nước mắm 20N) M3 ( nước mắm 25N) M4 (nước mắm 30N) M5 (nước mắm 35N) M6 (nước mắm 40N) M1 + C2 100,45 M2 + C1 91,86 M2 + C2 100,67 M3 + C1 113,41 M3 + C2 99,35 M4 + C1 79,57 M4 + C2 97,16 M5 + C1 111,21 M5 + C2 113,58 M6 + C1 86,18 M6 + C2 105,46 • Qua bảng số liệu cho thấy hiệu suất thu hồi tốt ( hiệu suất thu hồi > 80% ), phương pháp phù hợp cho việc định lượng ure nước mắm 5 Cơng thức tính nồng độ urea có mẫu  Phương pháp định tính: dựa thông số thời gian lưu t R  Phương pháp định lượng: Cc * V * k X= M Trong đó: • X: nồng độ ure có mẫu, mg/L • V: thể tích định mức mẫu, mL • M: thể tích mẫu, mL • k: hệ số pha loãng IV Kết luận  Đề xuất phương pháp phân tích đại xác định hàm lượng ure nước mắm phương pháp sắc kí lỏng hiệu nặng caođầu dị huỳnh quang cho kết xác, độ tin cậy cao  Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích : 　　　　　 - Hiệu suất thu hồi phương pháp (HPP %) xấp xỉ 100% khoảng nồng độ rộng Ure Phương pháp tin cậy xét phương diện độ chọn lọc, độ độ xác - Giới hạn phát (LODphương pháp) thấp cho ure: 　　　　　 LODure = 0,58( mg/L) - Giới hạn định lượng ( LOQ phương pháp ): LOQure = 1,92 (mg/L) V Tài liệu tham khảo Lê Thị Lợi, Dương Trọng Phi, Đào Thị Vân Khánh cộng tác viên Nguyên cứu xác định hàm lượng ure hình thành tự nhiên trình sản xuất nước mắm Viện Pasteur Nha Trang, Y học TP.Hồ Chí Minh 2.AOAC Official Method 941.04 (2006), Ure and ammonical nitrogen in animal feed urease method AOAC Official Method 983.01 (2006), Ure and methyleneureas ( water soluble ) in fertilizers liquid chromatographic method Patricia A.Wright (1998), Ure production and transport in Teleoost fishes, University of Guelph, Ontario, Canada Shona Clark, Paul S.Francis (2007), Determination of ure using high performance liquid chromatography with fluorescence detection after automated derivatisation with xanthydrol, Deakin University, Australia 6.http://123doc.org/document/2054431-tieu-luan-van-de-su-dung-uretrong-bao-quan-thuy-san.htm ... tích đại xác định hàm lượng ure nước mắm phương pháp sắc kí lỏng hiệu nặng cao? ?ầu dò huỳnh quang cho kết xác, độ tin cậy cao  Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích : 　　　　　 - Hiệu suất thu hồi phương. .. hạn định lượng: LOQ = LOD*10/3  Giới hạn phát phương pháp là: 0,58 mg/L  Giới hạn định lượng phương pháp là: 1,92 mg/L  Nhận xét: phương pháp định lượng hàm lượng ure mẫu nồng độ thấp ( mẫu nước. .. C1 10N) 25; 30; 35; M1 40 (v? ?nước mẫumắm nước mắm có thêm chuẩn.87,64 Kết thu sau: M2 (nước mắm 20N) M3 ( nước mắm 25N) M4 (nước mắm 30N) M5 (nước mắm 35N) M6 (nước mắm 40N) M1 + C2 100,45 M2 +