Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)

Mục tiêu của thực hiện đề tài nghiên cứu là: (1) Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ, khảo sát các điều kiện xử lý mẫu, thẩm định phương pháp đã xây dựng; (2) áp dụng phương pháp xác định ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men trên thị trường trong nước.

th ng kê c a C c An toàn th c ph m v  các v  ng  đ c th c ph m trong nh ngố ủ ụ ự ẩ ề ụ ộ ộ ự ẩ ữ  năm g n đây trên c  nầ ả ước:

­ Năm 2009: Toàn qu c x y ra 147 v  ng  đ c th c ph m, có 5026 ngố ả ụ ộ ộ ự ẩ ườ  i

m c; 3958 ngắ ười nh p vi n; 33 ngậ ệ ườ ửi t  vong

­ Năm 2010: Tình hình NĐTP trong năm 2010 ph c t p. Toàn qu c đã x y raứ ạ ố ả  

175 v  ng  đ c trong đó có 34 v  ng  đ c trên 30 ngụ ộ ộ ụ ộ ộ ười làm 5664 người m c 42ắ  

trường h p t  vong, so sánh v i s  li u trung bình trên năm c a giai đo n 2006­ợ ử ớ ố ệ ủ ạ

2009, s  v  ng  đ c gi m 9,1%; s  m c gi m 17,6% và s  t  vong gi m 19,2%. ố ụ ộ ộ ả ố ắ ả ố ử ả

­ Năm 2011: 148 v , 4700 ngụ ười m c, 27 ngắ ườ ửi t  vong

­ Năm 2012: 168 v , 5541 ngụ ười m c, 34 ngắ ườ ửi t  vong

Theo TS Tr n Quang Trung, C c trầ ụ ưởng C c An toàn th c ph m ­ B  Yụ ự ẩ ộ  

t , trong 9 tháng c a năm 2013, c  nế ủ ả ước đã có 108 v  ng  đ c th c ph m làmụ ộ ộ ự ẩ  

h n 2.800 ngơ ười m c, trong đó có 18 ca t  vong. Trong 40 v  ng  đ c th cắ ử ụ ộ ộ ự  

ph m đẩ ược th ng kê trong quý III này thì nguyên nhân do vi sinh v t là 23 v , doố ậ ụ  

đ c t  t  nhiên 4 v , do hóa ch t 2 v  và 11 v  ch a xác đ nh độ ố ự ụ ấ ụ ụ ư ị ược nguyên nhân. Các v  ng  đ c x y ra kh p n i, t  gia đình riêng đ n t p th ụ ộ ộ ả ắ ơ ừ ế ậ ể

Ochratoxin là m t lo i đ c t  độ ạ ộ ố ược sinh ra b i các ch ng n m m c thu cở ủ ấ ố ộ  các gi ng Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum và là lo i đ c t  cóố ạ ộ ố  

ti m năng gây ung th  và viêm th n   ngề ư ậ ở ười và đ ng v t. Đ c t  này đã độ ậ ộ ố ượ  cphát hi n trên nhi u nông s n khác nhau bao g m ngũ c c và các s n ph m c aệ ề ả ồ ố ả ẩ ủ  

không gây ng  đ c c p tính mà tích lũy d n trong c  th  ­ ộ ộ ấ ầ ơ ể là nguy c  ti m  n đeơ ề ẩ  

d a s c kh e cho con ngọ ứ ỏ ười

Trong s  10.000 lo i n m m c khác nhau đố ạ ấ ố ược bi t đ n thì có kho ng 50ế ế ả  

lo i là có h i đ i v i gia súc gia c m và con ngạ ạ ố ớ ầ ười. Các lo i n m này s n sinh raạ ấ ả  các đ c t  độ ố ược g i chung là mycotoxin  ọ Mycotoxin la ch t đ c sinh ra t  n m̀ ấ ộ ừ ấ  

m c, đố ược hình thành khi n m chuy n hóa các ch t dinh dấ ể ấ ưỡng có trong th c ănứ  

và nguyên li u. Theo t  ch c lệ ổ ứ ương th c và nông nghi p Liên Hi p Qu c (FAO),ự ệ ệ ố  kho ng 25% s  ngũ c c th  gi i có ch a m t hàm lả ố ố ế ớ ứ ộ ượng mycotoxin   m t m cở ộ ứ  

đ  nào đó. Tùy vào đ a lý, kh  năng nhi m mycotoxin l i khác nhau. ộ ị ả ễ ạ Ở   đi uề   

ki n nhi t đ i và c n nhi t đ i, nguy cệ ệ ớ ậ ệ ớ ơ  nhi mễ   mycotoxin càng  cao. Đăc thụ̀  khi hâu va nên san xuât nông nghiêp   Viêt Nam tinh trang nhiêm đôc tô nâm môć ̣ ̀ ̀ ̉ ́ ̣ ở ̣ ̀ ̣ ̃ ̣ ́ ́ ́ 

la kha phô biên. S  hình thành n m m c và đ c t  c a chúng có th  b t đ u t̀ ́ ̉ ́ ự ấ ố ộ ố ủ ể ắ ầ ừ khi cây còn   trên đ ng, lúc thu ho ch, trong khi b o qu n ho c ngay c  trongở ồ ạ ả ả ặ ả  quá trình ch  bi n th c ăn cho v t nuôi. Nh  v y, không n i nào trên th  gi i cóế ế ứ ậ ư ậ ơ ế ớ  

th  thoát kh i n m m c và đ c t  t  chúng, và tác h i c a chúng là vô cùng toể ỏ ấ ố ộ ố ừ ạ ủ  

l n đ i v i năng su t v t nuôi và s c kh e con ngớ ố ớ ấ ậ ứ ỏ ười

Đ  ki m soát m c đ  nhi m ochratoxin trong th c ph m,   Vi t Namể ể ứ ộ ễ ự ẩ ở ệ  cũng nh  trên th  gi i đã có nhi u phư ế ớ ề ương pháp phân tích được nghiên c u vàứ  

ng d ng. Nh ng v i nh ng đ c đi m  u vi t và đ  chính xác cao nên các

phương pháp phân tích s c ký l ng  kh i ph  đắ ỏ ố ổ ược coi là phương pháp phân tích 

có giá tr  pháp lý đ  phát hi n và đ nh lị ể ệ ị ượng n ng đ  ochratoxin   lồ ộ ở ượng v t hayế  siêu v t. ế

Xu t phát t  tính c p thi t c a xã h i và tínhấ ừ ấ ế ủ ộ   u vi t c a phư ệ ủ ương pháp phân tích, chúng tôi xây d ng phự ương pháp nghiên c uứ :

"Xác đ nh hàm l ị ượ ng  Ochratoxin trong th c ph m b ng ph ự ẩ ằ ươ ng pháp s c ký ắ  

l ng hai l n kh i ph  (LC­MS/MS)” ỏ ầ ố ổ

M c tiêu c a th c hi n đ  tài nghiên c u là:ụ ủ ự ệ ề ứ

1   Xây d ng phự ương pháp xác đ nh hàm lị ượng c a  ủ Ochratoxin  trong  th cự  

CHƯƠNG 1:  T NG QUANỔ

1.1.Gi i thi u chung ớ ệ  v  ochratoxinsề [14­15]

1.1.1.Đ nh nghĩaị

Đ c t  ochratoxin, là m t s n ph m chuy n hoá th  c p c a m t s  loàiộ ố ộ ả ẩ ể ứ ấ ủ ộ ố  

n m m c. Ochratoxin có m t trong kh p các lo i nông s n th c ph m: ngũ c c,ấ ố ặ ắ ạ ả ự ẩ ố  

th o dả ược, bia, cà phê  trong các s n ph m có ngu n g c đ ng v t do b  lâyả ẩ ồ ố ộ ậ ị  nhi m   trễ ước   Ochratoxins   được   bi t   đ n   là   s n   ph m   c a   các   loài   n mế ế ả ẩ ủ ấ  Aspergillus và Penicillium và thường được tìm th y trong nhi u lo i s n ph mấ ề ạ ả ẩ  

lương th c và th c ăn chăn nuôi.ự ứ

Ochratoxin A l n đ u tiên đầ ầ ược tìm th y   n m m c A. ochraceus vùngấ ở ấ ố  Nam Phi b i Scott (1965) trên h t lúa b  nhi m A.ochraceus.   Đ c tìm th yở ạ ị ễ Ở ứ ấ  Ochratoxin thường xuyên trong th t.   Anh, chúng đị Ở ược tìm th y trong đ u nành,ấ ậ  

b p b t, ca cao. M.Nakajima năm 1997 đã ghi nh n t  l  chi m 30%   hàmắ ộ ậ ỷ ệ ể ở  

lượng OTA t  0.1 – 17,4 µg/kg   47 m u café đừ ở ẫ ược nh p vào Nh t B n t  cácậ ậ ả ừ  

nước Nam Phi , và m t s  nộ ố ước ASIAN. T i Vi t Nam, nghiên c u ti n hànhạ ệ ứ ế  trên 123 m u ngô c a 2 xã Cán T  và Lùng Tám huy n Qu n B  t nh Hà Giang.ẫ ủ ỷ ệ ả ạ ỉ  

K t qu  cho th y: trong 123 m u ngô đế ả ấ ẫ ược phân tích có t i 50 m u (40,7 %) phátớ ẫ  

hi n cóệ  ochratoxin A, trong s  đó có 2 m u (1,6 %) vố ẫ ượt m c d  lứ ư ượng theo quy 

đ nh c a B  Y t  ị ủ ộ ế

Cho t i nay đã phát hi n đớ ệ ược 3 lo i ochratoxin khác nhau. Trong khuônạ  

kh  lu n văn chúng tôi quan tâm nghiên c u đ n ochratoxin A và B ổ ậ ứ ế

đ m carbonat loãng). Ochratoxins r t b n v ng v i các x  lý nhi t và hóa ch t.ệ ấ ề ữ ớ ử ệ ấ  

Đ c t  độ ố ượ ảc s n sinh nhi u nh t   nhi t đ  t  20­25ề ấ ở ệ ộ ừ 0C. S  s n sinh ochratoxinsự ả  

ph  thu c ch ng n m m c, ho t tính c a nụ ộ ủ ấ ố ạ ủ ước trong h t, c  ch t, nhi t đ ạ ơ ấ ệ ộ  Ochratoxins d  b  phân h y b i ánh sáng, trong môi trễ ị ủ ở ường ki m ho c ch t t yề ặ ấ ẩ  

r a.ử

      Ochratoxin   A   phát   hu nh   quang   và   h p   th   UV   c c   đ i   t i   365nm.ỳ ấ ụ ự ạ ạ  Ochratoxin A có đi m nóng ch y   169ể ả ở 0C. Ph  h ng ngo i trong cloroform choổ ồ ạ  các píc có đ  dài 3380, 1723,1678, 1655 cmộ ­1 OTA có tính axit y u pKế a1 = 4,2­4,4 

và pKa2 = 7,0­7,3. Ochratoxin A phát hu nh quang xanh khi dùng thi t b  s c kýỳ ế ị ắ  

l p m ng (TLC) chi u tia UV   366nm.ớ ỏ ế ở

       Ochratoxin B có tr ng lọ ượng phân t  369,37. Ochratoxin B có th  phátử ể  

hu nh quang màu xanh khi chi u tia UV bỳ ế ước sóng 318 nm. Nhi t đ  nóng ch yệ ộ ả  kho ng 221ả 0C

     C  ch  tác đ ng c a ochratoxins: ochratoxins gây  c ch  s  v n chuy nơ ế ộ ủ ứ ế ự ậ ể  

c a ribonucleic axit (tARN) và các axitamin. Ochratoxins còn  c ch  vi khu n,ủ ứ ế ẩ  

n m men và phenylalanine ­ tARN   gan. Tác đ ng làm  c ch  s  t ng h pấ ở ộ ứ ế ự ổ ợ  

protein trong t  bào và c  th  S   c ch  mi n d ch c a ochratoxin đế ơ ể ự ứ ế ễ ị ủ ược bi uể  

hi n làm gi m th c bào và  c ch  t  bào lympho.  c ch  tệ ả ự ứ ế ế Ứ ế ương t  nh  trên cácự ư  amino   axit   synlaza   tARN   tương   ng   ochratoxin   A   gây   c   ch   hydroxylaseứ ứ ế  phenylalanine, m t n a phenylalanine c a ochratoxin A là m t ph n hydroxyl hóaộ ử ủ ộ ầ  

đ  tyrosin gây b nh các t  bào gan trong c  th  Ochratoxin  c ch  s  t ng h pể ệ ế ơ ể ứ ế ự ổ ợ  ARN làm  nh hả ưởng đ n các protein trong vòng tu n hoàn. Tác đ ng đ n các tế ầ ộ ế ế bào màng ti th  và gây ra các hi u  ng khác nhau trên ti th  Kích thích s  hìnhể ệ ứ ể ự  thành ADN trong th n, gan và lá lách. Các ADN này là các s i đ n b  phá v ậ ợ ơ ị ỡ

Các nguyên li u d  nhi m đ c t  này nh  cám g o, lúa mì, b t mì, b p,ệ ễ ễ ộ ố ư ạ ộ ắ  

đ u nành, cà phê. D  lậ ư ượng ochratoxin cũng được tìm th y trong th t heo và th tấ ị ị  gia c m. Đ c t  này gây h i đ n ầ ộ ố ạ ế gan và th nậ  đ ng v t. V i n ng đ  l n h n 1ộ ậ ớ ồ ộ ớ ơ  ppm có th  làm gi m s n lể ả ả ượng tr ng   gà đ , n ng đ  l n h n 5 ppm có thứ ở ẻ ồ ộ ớ ơ ể gây nên nh ng t n thữ ổ ương   gan và ru t. Tở ộ ương t  nh  Aflatoxin, đ c t  nàyự ư ộ ố  cũng gây nên s  gi m s c đ  kháng và là tác nhân ự ả ứ ề gây ung th    ngư ở ười

­ Gây t n thổ ương t  bào gan: t t c  các trế ấ ả ường h p xác đ nh s  ng  đ cợ ị ự ộ ộ  Ochratoxin đ u có b nh tích gi ng nhau   ch  gan b  h  h i n ng. Tùy theo m cề ệ ố ở ỗ ị ư ạ ặ ứ  

đ  nhi m ít hay nhi u, lâu hay mau mà tình tr ng b nh trên gan khác nhau. Bi uộ ễ ề ạ ệ ể  

hi n chung là ban đ u gan đ ng v t (đi n hình là gà) bi n thành màu vàng tệ ầ ộ ậ ể ế ươ  i,

m t s ng sau đó gan s ng ph ng và b t đ u n i các m n nh  trên b  m t làmậ ư ư ồ ắ ầ ổ ụ ỏ ề ặ  cho nó g  gh  đôi khi có nh ng n t ho i t  màu tr ng, sau cùng do nhi m khu nồ ề ữ ố ạ ử ắ ễ ẩ  

mà gan tr  nên b  và d  vở ở ễ ỡ

­ Th n s ng to làm cho vi c đào th i ch t đ c ra kh i c  th  tr  nên h tậ ư ệ ả ấ ộ ỏ ơ ể ở ế  

s c khó khăn, t  đó làm cho tri u ch ng ng  đ c tr  nên tr m tr ngứ ừ ệ ứ ộ ộ ở ầ ọ

­ Làm gi m kh  năng đ  kháng c a đ ng v t,  c ch  h  th ng sinh khángả ả ề ủ ộ ậ ứ ế ệ ố  

th , có th  gây t  vong cho đ ng v t. Khi nhi m đ c ochratoxin c  th  r t m nể ể ử ộ ậ ễ ộ ơ ể ấ ẫ  

c m v i các lo i b nh thông thả ớ ạ ệ ường

­ Bào mòn  niêm m c c a  ng tiêu hóa do l p t  bào niêm m c b  ch tạ ủ ố ớ ế ạ ị ế  bong ra và b  khô l i hình thành nên m t l p màng b c làm c n tr  s  chuy nị ạ ộ ớ ọ ả ở ự ể  

th c ăn đi trong  ng tiêu hóaứ ố

­ Làm thay đ i ho t đ ng sinh lý bình thổ ạ ộ ường gây r i lo n sinh s n.   thúố ạ ả Ở  mang thai có th  gây ch t thai. Đ i v i gia c m có th  gây t  l  ch t phôi   giaiể ế ố ớ ầ ể ỷ ệ ế ở  

đo n đ u r t cao, t  l  n  th p   ạ ầ ấ ỷ ệ ở ấ

­ Làm gi m tính ngon mi ng đ i v i th c ăn do s  phát tri n c a n mả ệ ố ớ ứ ự ể ủ ấ  

 Nh  v y có th  nói r ng đ c t  n m gây ra nh ng tác h i r t l n và h uư ậ ể ằ ộ ố ấ ữ ạ ấ ớ ậ  

qu  vô cùng nghiêm tr ng cho c  th  c a ngả ọ ơ ể ủ ười và đ ng v t. ộ ậ

Tuy theo t ng loai ma đôc tô nâm môc có th  gây nhi m đ c c p tính và̀ ừ ̣ ̀ ̣ ́ ́ ́ ể ễ ộ ấ  mãn tính. Đ c t  n m m c ít khi gây ra ng  đ c c p tính, nó gây h i c  th  t  tộ ố ấ ố ộ ộ ấ ạ ơ ể ừ ừ 

do đó làm cho chúng ta không h  hay bi t. Nh ng khi phát sinh tri u ch ng thìề ế ư ệ ứ  

nh ng c  quan b  ph n chúng t n công đã h  h i nghiêm tr ng khó ch a tr  Tuyữ ơ ộ ậ ấ ư ạ ọ ữ ị  nhiên, các đ c t  n m m c trong th c ăn s  gây nên nh ng hu  ho i th m l ngộ ố ấ ố ứ ẽ ữ ỷ ạ ầ ặ  

đ i v i h  th ng mi n d ch c a gia súc, làm cho chúng m n c m h n đ i v iố ớ ệ ố ễ ị ủ ẫ ả ơ ố ớ  

b nh.ệ

Khác v i b nh nhi m trùng là kháng sinh không đi u tr  đớ ệ ễ ề ị ược nhi m đ cễ ộ  

t  n m m c. Cách t t nh t là ngăn ng a không cho đ c t  n m m c nhi m vàoố ấ ố ố ấ ừ ộ ố ấ ố ễ  trong th c ăn. ứ

Trên heo: Li u gây ch t : LD50 1­6 mg/kg,   gà: LD50 3,6 mg/kg đ i v iề ế Ở ố ớ  

gà con 10 ngày tu i ổ

1.1.3. Gi i h n t n d  t i đa cho phép (MRL)ớ ạ ồ ư ố

­ M c d  lứ ư ượng t i đa cho phép là gi i h n d  lố ớ ạ ư ượng c a m t lo i thu c,ủ ộ ạ ố  

được phép t n t i v  m t pháp lí ho c xem nh  có th  ch p nh n đồ ạ ề ặ ặ ư ể ấ ậ ượ ởc   trong nông s n, th c ăn mà không gây h i cho ngả ứ ạ ườ ử ụi s  d ng và v t nuôi khi dùng.ậ

      B ng 1.1: M c d  lả ứ ư ượng t i đa cho phép c a Ochratoxin A   Vi t Namố ủ ở ệ

Th c ph m dành cho tr  dự ẩ ẻ ưới 36 tháng tu iổ 0,5

v i ochratoxin có trong m u. Kháng th  đ c hi u v i ochratoxin đớ ẫ ể ặ ệ ớ ược g n lên bắ ề 

m t gi ng nh a polystryren. D ch chi t m u trong methanol 70% đặ ế ự ị ế ẫ ược tr n c ngộ ộ  

h p v i ochratoxin – enzyme và đợ ớ ược cho vào gi ng có ph    kháng th , cácế ủ ể  ochratoxin có trong m u (n u có) s  c nh tranh v i ph c h p ochratoxin­ enzymeẫ ế ẽ ạ ớ ứ ợ  

đ  g n vào kháng th  c  đ nh trên polystryren. Sau đó r a s ch các ph c h pể ắ ể ố ị ử ạ ứ ợ  

th a, c  ch t ph n  ng v i enzyme đừ ơ ấ ả ứ ớ ược đ a vào t o màu.   m t th i gian sauư ạ Ủ ộ ờ  

đó thêm vào dung  d ch ng ng phát màu đ  t o đi u ki n đ ng đ u v  th i gianị ư ể ạ ề ệ ồ ề ề ờ  cho m i gi ng. Ti n hành đo đ  h p th  c a m u và dãy chu n b ng máy đoọ ế ế ộ ấ ụ ủ ẫ ẩ ằ  

t  c ng h p ochratoxin – enzyme đỏ ộ ợ ược gi  trong gi ng càng nhi u, đ ng nghĩaữ ế ề ồ  

v i n ng đ  ochratoxin trong m u càng th p. Ngớ ồ ộ ẫ ấ ượ ạc l i, màu càng nh t thì n ngạ ồ  

đ  Ochratoxin càng cao.ộ

S  d ng phử ụ ương pháp ELISA đ  xác đ nh ochratoxin có th  k  đ n m tể ị ể ể ế ộ  

s  nghiên c u sau:ố ứ

Nhóm tác gi  Aihua Zhang, Yanna Ma, Lulu Feng, Ying Wang, Chenghuaả  

He, Xichun Wang, Haibin Zhang [14] xác đ nh Ochratoxin trên đ i tị ố ượng m u ngũẫ  

c c nguyên li u t i Nanjing, Trung Qu c. Phố ệ ạ ố ương pháp phân tích có gi i h nớ ạ  phát hi n 0,15 ng/ml. Đ  thu h i c a phệ ộ ồ ủ ương pháp đ t t  87­101% t i m c thêmạ ừ ạ ứ  chu n 2,5­10 ppb. Nhóm ti n hành phân tích trên 65 m u ngô, g o, lúa mì. K tẩ ế ẫ ạ ế  

qu  cho th y 8 trong s  22 m u lúa mì ch a Ochratoxin A trong kho ng 2­ 9 ppbả ấ ố ẫ ứ ả  (chi m 36% t ng s  m u), 6 trong s  23 m u ngô (chi m kho ng 26% t ng sế ổ ố ẫ ố ẫ ế ả ổ ố 

m u) dẫ ương tính v i Ochratoxin A trong kho ng 3­23 ppb, 3 trong s  20 m uớ ả ố ẫ  

g o   (chi m   kho ng   15%   t ng   s   m u)   dạ ế ả ổ ố ẫ ương   tính   v i   Ochratoxin   A   trongớ  kho ng 2­3 ppb.ả

Nhóm   tác   gi   Pedro   Novoa,   Géraud   Moulasa,   Duarte   Miguel   Franc¸ả  Prazeresb, Virginia Chua, João Pedro Conde [32] đã xác đ nh Ochratoxin trongị  

m u rẫ ượu v i gi i h n phát hi n là 0,85 ng/ml. Ochratoxin đớ ớ ạ ệ ược phát hi n trongệ  dung d ch đ m PBS v i vi c s  d ng c u hình m t kênh th ng. ị ệ ớ ệ ử ụ ấ ộ ẳ

K  thu t có  u đi m: nhanh, đ n gi n,ti t ki m dung môi, đ c hi u vàỹ ậ ư ể ơ ả ế ệ ặ ệ  khá nh y nh ng so v i phạ ư ớ ương pháp HPLC thì kém hi u qu  h n do d  cho k tệ ả ơ ễ ế  

qu  dả ương tính gi  ho c âm tính giả ặ ả

1.2.2 Phương pháp s c ký khí (Gas chromatography­GC) ắ

Phương pháp s c ký khí đã đắ ược m t s  tác gi   ng d ng đ  xác đ nh cácộ ố ả ứ ụ ể ị  

lo i đ c t  Ochratoxin. Tuy nhiên phạ ộ ố ương pháp ch  phân tích đỉ ược nh ng ch tữ ấ  

d  bay h i, còn các ch t khó bay h i thì ph i t o d n xu t nên t n th i gian vàễ ơ ấ ơ ả ạ ẫ ấ ố ờ  hóa ch t. H n n a, đ  phân tích đấ ơ ữ ể ược đ ng th i các ch t thì c n th i gian phânồ ờ ấ ầ ờ  

Ochratoxin này  Tác gi  Yuying Jiao và các c ng s  [31] đã ti n hành xácả ộ ự ế  

đ nh Ochratoxin trong th c ph m b ng phị ự ẩ ằ ương pháp s c ký khí.   đó Ochratoxinắ Ở  

A được chuy n thành d ng d n xu t ester 0­methyl ochratoxin A và để ạ ẫ ấ ược xác 

đ nh b ng s c ký khí kh i ph  v i ch  đ  ESI âm.ị ằ ắ ố ổ ớ ế ộ

1.2.3. Phương pháp s c ký l ng hi u năng cao (HPLC) và c t ái l c mi nắ ỏ ệ ộ ự ễ  

d ch (IAC)ị

Gi ng nh  ELISA, c t ái l c mi n d ch cũng d a trên s  k t h p đ c hi uố ư ộ ự ễ ị ự ự ế ợ ặ ệ  

gi a kháng nguyên và kháng th  Kháng th  đ c hi u v i ochratoxin đữ ể ể ặ ệ ớ ược g nắ  lên giá r n c a c t s c ký (thắ ủ ộ ắ ường dùng Sepharose 4B), t o cho IAC đ c tính v aạ ặ ừ  tinh s ch v a cô đ c ochratoxin. M u đạ ừ ặ ẫ ược chi t v i acetonitril/Hế ớ 2O, sau đó 

được pha loãng và cho qua c t ái l c mi n d ch. C t độ ự ễ ị ộ ượ ửc r a s ch nh ng t pạ ữ ạ  

ch t không g n lên kháng th  và đấ ắ ể ược gi i h p b ng methanol. Ti n hành đ nhả ấ ằ ế ị  

lượng b ng HPLC v i detector hu nh quang . B n thân Ochratoxin là ch t phátằ ớ ỳ ả ấ  

hu nh quang t i bỳ ạ ước sóng h p th  333 nm, bậ ụ ước sóng phát x  460 nm nên đã cóạ  

r t nhi u nghiên c u s  d ng phấ ề ứ ử ụ ương pháp s c ký l ng hi u năng cao v iắ ỏ ệ ớ  detector hu nh quang đ  xác đ nh. ỳ ể ị

Tác gi  ả Catherine Tessini và c ng s  [18] đã ti n hành th c hi n phân tíchộ ự ế ự ệ  

154 m u rẫ ượu xu t x  Chi Lê, kh o sát trên c t ái l c mi n d ch v i các h  dungấ ứ ả ộ ự ễ ị ớ ệ  môi khác nhau, gi i h n phát hi n c a phớ ạ ệ ủ ương pháp t  1­9 ppb, hi u su t thu h iừ ệ ấ ồ  

n m trong kho ng 60­90%.ằ ả

Tác gi  R. Ghali và c ng s  [27] đã ti n hành th c hi n trên 180 m u th cả ố ự ế ự ệ ẫ ự  

ph m xu t x  Tunisia. M u đẩ ấ ứ ẫ ược chi t b ng ACN/H2O (80/20) và làm s chế ằ ạ  

b ng c t ái l c mi n d ch. Đ  thu h i   m c n ng đ  0,5 và 2 ng/g trong kho ngằ ộ ự ễ ị ộ ồ ở ứ ồ ộ ả  

84 đ n 94 %. Phế ương pháp có gi i h n phát hi n 0,1 ng/g. Lo i m u thớ ạ ệ ạ ẫ ường bị nhiêm là lúa m ch, lúa mì.Tuy nhiên, khi s  d ng detector hu nh quang phạ ử ụ ỳ ươ  ngpháp có đ  nh y tộ ạ ương đ i t t, nh ng ch  có th  nh n bi t ch t phân tích thôngố ố ư ỉ ể ậ ế ấ  qua th i gian l u. Đ i v i nh ng n n m u ph c t p, các ch t phân tích r t d  bờ ư ố ớ ữ ề ẫ ứ ạ ấ ấ ễ ị 

nh h ng b i n n m u, n u ch  d a vào th i gian l u s  r t khó đ  có th

V  c  b n, nó là phề ơ ả ương pháp s c ký l ng s  d ng b  ph n phát hi n là detectorắ ỏ ử ụ ộ ậ ệ  

kh i ph  Phố ổ ương pháp có nhi u  u đi m nh  đ  ch n l c cao, gi i h n phátề ư ể ư ộ ọ ọ ớ ạ  

hi n th p, th i gian phân tích nhanh, có th  đ nh lệ ấ ờ ể ị ượng đ ng th i các ch t có th iồ ờ ấ ờ  gian l u gi ng nhau mà phư ố ương pháp s c kí l ng thắ ỏ ường không làm được

R. Vatinnoa, D. Vuckovica, C.G. Zamboninb, J. Pawliszyna [28]  đã ti nế  hành xác đ nh Ochratoxin trong 96 m u nị ẫ ước ti u b ng phể ằ ương pháp vi chi t phaế  

r n k t h p v i s c ký l ng kh i ph  M u đắ ế ợ ớ ắ ỏ ố ổ ẫ ược ch nh pH v  3 b ng đ mỉ ề ằ ệ  photphatsalin 0,5 M trước khi vi chi t pha r n. Chế ắ ương trình s c ký l ng đắ ỏ ượ  cgradient   kho ng 8 phút đã có th  cho ra ch t phân tích v i tín hi u t t. Đ  thuở ả ể ấ ớ ệ ố ộ  

h i, đ  ch m đồ ộ ụ ược ti n hành đo   3 m c n ng đ  1, 10, 50 ng/ml. Gi i h n phátế ở ứ ồ ộ ớ ạ  

hi n và gi i h n đ nh lệ ớ ạ ị ượng   trong nở ước ti u tể ương  ng là 0,3 và 0,7 ng/ml. C tứ ộ  

s c ký s  d ng là c t C18 – Waters, t c đ  dòng 0,5 ml/phút. Pha đ ng: 90%ắ ử ụ ộ ố ộ ộ  kênh A (nướu,  acetonitril,  aceticacid 90:10:0,1) trong  1 phút,  tăng t  l  60%ỷ ệ  A/40%B  (acetonitril và acetic acid 100:0,1) trong 6 phút, đ a v  90% B   giâyư ề ở  

ti p theo và gi  trong vòng 1 phút. T ng th i gian ch y s c ký là 8 phút. Detectorế ữ ổ ờ ậ ắ  

kh i   ph   th c   hi n     ch   đ   ion   âm,   IS=­4V,   nhi t   đ   ngu n   400ố ổ ự ệ ở ế ộ ệ ộ ố 0C,   v iớ  ochratoxin A có các thông s  tố ương  ng: DP=­20V, FP=­74V, EP=­8,6, CE=­25V,ứ  CXP=­9,5V, v i ochratoxin B có các thông s  tớ ố ương  ng: DP=­20V, FP=­86,ứ  EP=­8,6, CE=­44,41V, CXP=­15,11V. Ion  đ nh d ng: OTA: m/z 402.1­>357.9,ị ạ  OTB: m/z 368.0­>133.1.   trong nghiên c u này tác gi  coi ochratoxin B nh  làở ứ ả ư  

m t n i chu n, độ ộ ẩ ược thêm vào t  đ u đ  ki m soát hi u su t thu h i. Đ u viừ ầ ể ể ệ ấ ồ ầ  chi t pha r n đế ắ ược nhúng vào 1 ml m u   t c đ  khu y 850 rpm, th i gian h pẫ ở ố ộ ấ ờ ấ  

th  và gi i h p th  là 1 gi  15 phút. Phụ ả ấ ụ ờ ương pháp có  u đi m tính t  đ ng hóaư ể ự ộ  cao, ít đ c h i cho ngộ ạ ười phân tích.

T i Vi n nghiên c u thu c tr  sâu và nạ ệ ứ ố ừ ước, Đ i h c Jaume, Tây Banạ ọ  Nha,   nhóm   tác   gi   Eduardo   Beltrán   [20]   đã   nghiên   c u   xác   đ nh   m t   sả ứ ị ộ ố mycotoxin trong th c ph m và s a b ng s c ký l ng kh i ph  M u đự ẩ ữ ằ ắ ỏ ố ổ ẫ ược chi tế  

b i   acetonitril:   nở ước   (80:20),   làm   s ch   m u   b ng   c t   ái   l c   mi n   d chạ ẫ ằ ộ ự ễ ị  (Aflaochra HPLCTM) được cung c p b i Vicam (Tecasa, Madrid, Tây Ban Nha).ấ ở  

Phương pháp cho đ  thu h i 80­110% t i m c thêm chu n 0,025 và 0,1 ng/g,ộ ồ ạ ứ ẩ  RSD nh  h n 15%.ỏ ơ

Nhóm tác gi  L.C. Huang đã nghiên c u xác đ nh m t nhóm các ch tả ứ ị ộ ấ  aflatoxin M1, ochratoxin A, zearalanone và  ­zearalenol trong s a b ng phα ữ ằ ươ  ngpháp UHPLC­MS/MS. Trong nghiên c u này, đ  nh y và đ  nhanh c a phứ ộ ạ ộ ủ ươ  ngpháp được đ c bi t nghiên c u trong ch  đ  UHPLC­ESI­MS/MS. M u s aặ ệ ứ ế ộ ẫ ữ  

được làm s ch b ng c t chi t pha r n Oasis HLB. Gi i h n đ nh lạ ằ ộ ế ắ ớ ạ ị ượng c a cácủ  mycotoxins n m trong kho ng 0,003­0,015 µg/kg. H  s  tằ ả ệ ố ương quan cao (R2 ≥ 0,996) thu được trong kho ng n ng đ  mycotoxin 0,01­1,00 µg/kg v i đ  thuả ồ ộ ớ ộ  

h i cao (87,0­109%), đ  l p l i (3,4­9,9%) và đ  tái l p phòng thí nghi m t tồ ộ ặ ạ ộ ậ ệ ố  (4,0­9,9%)   m c n ng đ  0,025; 0,1; 0,5 µg/kg. T  l  phát hi n m u dở ứ ồ ộ ỷ ệ ệ ẫ ươ  ngtính là 16,7% đ n 96,7% trong s a nguyên li u, s a l ng và s a b t thu th p tế ữ ệ ữ ỏ ữ ộ ậ ừ các trang tr i và các siêu th    Beijing. ạ ị ở

V i nh ng  u đi m trên, chúng tôi đã ch n phớ ữ ư ể ọ ương pháp s c ký l ngắ ỏ  

kh i ph  đ  nghiên c u xác đ nh các lo i đ c t  ochratoxins có trong  s n ph mố ổ ể ứ ị ạ ộ ố ả ẩ  

rượu và các lo i ngũ c c và các s n ph m làm t  ngũ c c. ạ ố ả ẩ ừ ố

1.3 Gi i thi u v  h  th ng LC­MS/MSớ ệ ề ệ ố

C  s  lí thuy t c a phơ ở ế ủ ương pháp được tóm t t dắ ưới đây:  C u trúc c a hấ ủ ệ 

th ng LC­MS/MSố

Hình 1.2: Mô hình h  th ng LC­MS/MSệ ố1.3.1. H  th ng s c ký l ng hi u năng caoệ ố ắ ỏ ệ

S c ký là quá trình tách x y ra trên c t tách v i pha tĩnh là ch t r n và phaắ ả ộ ớ ấ ắ  

đ ng là ch t l ng. M u phân tích độ ấ ỏ ẫ ược chuy n lên c t tách dể ộ ướ ại d ng dung d ch.ị  Khi ti n hành ch y s c ký, các ch t phân tích đế ạ ắ ấ ược phân b  liên t c gi a phaố ụ ữ  

đ ng và pha tĩnh. Trong h n h p các ch t phân tích, do c u trúc phân t  và tínhộ ỗ ợ ấ ấ ử  

ch t lí hoá c a các ch t khác nhau, nên kh  năng tấ ủ ấ ả ương tác c a chúng v i phaủ ớ  tĩnh và pha đ ng khác nhau. Do v y, chúng di chuy n v i t c đ  khác nhau vàộ ậ ể ớ ố ộ  

Hình 1.3: S  đ  đ n gi n c a h  th ng s c ký l ng.ơ ồ ơ ả ủ ệ ố ắ ỏTrong HPLC, pha tĩnh chính là ch t nh i c t làm nhi m v  tách h n h pấ ồ ộ ệ ụ ỗ ợ  

Tu  theo b n ch t c a pha tĩnh, trong phỳ ả ấ ủ ương pháp s c ký l ng thắ ỏ ường chia làm 

2 lo i: s c ký pha thạ ắ ường (NP­HPLC) và s c ký pha ngắ ược (RP­HPLC)

 S c ký pha thắ ường: pha tĩnh có b  m t là các ch t phân c c (đó làề ặ ấ ự  các silica tr n ho c các silica đầ ặ ược g n các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhómắ  

ch c phân c c: ­NHứ ự 2, ­CN ), pha đ ng là các dung môi h u c  không phân c cộ ữ ơ ự  

nh : n­hexan, toluene H  này có th  tách đa d ng các ch t không phân c c hayư ệ ể ạ ấ ự  

ít phân c c.ự

 S c ký pha ngắ ược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân   c c,   lo i   thông   d ng   nh t   là   –Cự ạ ụ ấ 18H37,   còn   pha   đ ng   phân   c c:   nộ ự ướ  c,methanol, axetonitril Trong r t nhi u trấ ề ường h p thì thành ph n chính c a phaợ ầ ủ  

đ ng l i là nộ ạ ước nên r t kinh t  H  này đấ ế ệ ượ ử ục s  d ng đ  tách các ch t có để ấ ộ phân c c r t đa d ng: t  r t phân c c, ít phân c c t i không phân c c .ự ấ ạ ừ ấ ự ự ớ ự

Pha đ ng trong HPLC đóng góp m t ph n r t quan tr ng trong vi c tách cácộ ộ ầ ấ ọ ệ  

ch t phân tích trong quá trình s c ký nh t đ nh. M i lo i s c ký đ u có phaấ ắ ấ ị ỗ ạ ắ ề  

đ ng r a gi i riêng cho nó đ  có độ ử ả ể ược hi u qu  tách t t ệ ả ố

Có th  chia pha đ ng làm hai lo i: ể ộ ạ

 Pha đ ng có đ  phân c c cao: có thành ph n ch  y u là nộ ộ ự ầ ủ ế ước, tuy nhiên để phân tích các ch t h u c , c n thêm các dung môi khác đ  gi m đ  phân c cấ ữ ơ ầ ể ả ộ ự  

nh  MeOH, ACN. Pha đ ng lo i này đư ộ ạ ược dùng trong s c ký pha liên k tắ ế  

ngược

 Pha đ ng  có đ  phân c c th p: bao g m  các dung môi  ít  phân c c nhộ ộ ự ấ ồ ự ư cyclopentan,   n­pentan,   n­heptan,   n­hexan,   2­chloropropan,   cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene

Tuy nhiên pha đ ng m t thành ph n đôi khi không đáp  ng độ ộ ầ ứ ược kh  năngả  

r a gi i, ngử ả ười ta thường ph i h p 2 hay 3 dung môi đ  có đố ợ ể ược dung môi có độ phân c c t  th p đ n cao phù h p v i phép phân tích. S  thay đ i thành ph n phaự ừ ấ ế ợ ớ ự ổ ầ  

đ ng theo th i gian g i là r a gi i gradient n ng đ ộ ờ ọ ử ả ồ ộ

Detector là b  ph n quan tr ng quy t đ nh đ  nh y c a phộ ậ ọ ế ị ộ ạ ủ ương pháp. Tuỳ thu c b n ch t lí hoá c a ch t phân tích mà l a ch n detector cho phù h p. M tộ ả ấ ủ ấ ự ọ ợ ộ  

s  lo i detector dùng trong HPLC nh : Detector quang ph  h p th  phân t  (UV­ố ạ ư ổ ấ ụ ửVIS), detector hu nh quang (RF), detector đ  d n, detector m ng diot (DAD),ỳ ộ ẫ ả  detector kh i ph  (MS).ố ổ

1.3.2  Kh i ph  (Mass Spectrometry)ố ổ

Kh i ph  là thi t b  phân tích d a trên c  s  xác đ nh kh i lố ổ ế ị ự ơ ở ị ố ượng phân tử 

c a các h p ch t hóa h c b ng vi c phân tách các ion phân t  theo t  s  gi aủ ợ ấ ọ ằ ệ ử ỉ ố ữ  

kh i lố ượng và đi n tích (m/z) c a chúng. Các ion có th  t o ra b ng cách thêmệ ủ ể ạ ằ  hay b t đi n tích c a chúng nh  lo i b  electron, proton hóa,  Các ion t o thànhớ ệ ủ ư ạ ỏ ạ  này được tách theo t  s  m/z và phát hi n, t  đó có th  cho thông tin v  kh iỉ ố ệ ừ ể ề ố  

lượng ho c c u trúc phân t  c a h p ch t.ặ ấ ử ủ ợ ấ

Hình 1.4: S  đ  c u trúc c a máy kh i ph  MS.ơ ồ ấ ủ ố ổ

C u t o c a m t thi t b  kh i ph  bao g m 3 ph n chính: ngu n ion, thi tấ ạ ủ ộ ế ị ố ổ ồ ầ ồ ế  

b  phân tích và b  ph n phát hi n. Trị ộ ậ ệ ước h t, các m u đế ẫ ược ion hóa trong ngu nồ  ion, sau đó đ a vào b  ph n phân tích kh i đ  tách các ion theo t  s  m/z. Sau đóư ộ ậ ố ể ỉ ố  các ion đi vào b  ph n phát hi n (detector), s  độ ậ ệ ẽ ược khu ch đ i và chuy n thànhế ạ ể  tín hi u. Các tín hi u thu đệ ệ ượ ẽc s  chuy n vào máy tính đ  x  lí và l u tr ể ể ử ư ữ

a) Ch  đ   ion hóa đ u phun đi n t  (ESI)ế ộ ầ ệ ử

Kĩ thu t ion hóa phun đi n t  bao g m ba quá trình c  b n sau:ậ ệ ử ồ ơ ả

+ T o thành các gi t mang đi n tích.ạ ọ ệ

+ Làm gi m kích thả ướ ủc c a các h t, và phân nh  các h t.ạ ỏ ạ

+ Quá trình hình thành pha h i các ion.ơ

Hình 1.5: B  ngu n ion hóa.ộ ồKhi dung d ch m u ra kh i c t s c ký, đị ẫ ỏ ộ ắ ược đ a vào  ng mao qu n b ngư ố ả ằ  kim lo i. Đ u mao qu n này đạ ầ ả ược áp đi n th  cao (4­6 kV). Khi đi n tích d  trênệ ế ệ ư  

đ u mao qu n vầ ả ượt qua  s c căng b  m t c a d ch m u thì s  t o thành các gi tứ ề ặ ủ ị ẫ ẽ ạ ọ  mang đi n tích. Ti p đó các gi t mang đi n này đệ ế ọ ệ ược làm gi m kích thả ước nhờ hai quá trình liên t c x y ra, đó là s  hóa h i dung môi nh  dòng khí Nụ ả ự ơ ờ 2 được liên 

t c th i vào và s  b n phá c a các gi t tích đi n cùng d u. Cu i cùng d n đ nụ ổ ự ắ ủ ọ ệ ấ ố ẫ ế  

s  hình thành pha h i c a các ion. Nh  l c hút tĩnh đi n mà các ion này đự ơ ủ ờ ự ệ ược d nẫ  

vào b  phân tích kh i ph  qua m t c a s  r t nh  Dung môi và khí tr  Nộ ố ổ ộ ử ổ ấ ỏ ơ 2 đượ  chút ra ngoài do m t dòng khí (Curtain Gas).ộ

 Có 2 ch  đ  b n phá: b n phá v i ch  đ  ion dế ộ ắ ắ ớ ế ộ ương và ion âm

b) Ch  đ  ion hoá hoá h c   áp su t khí quy n (APCI).ế ộ ọ ở ấ ể

Ch t phân tích và dung môi   d ng l ng đấ ở ạ ỏ ược chuy n thành các gi t nh  r iể ọ ỏ ồ  hóa h i   nhi t đ  cao kho ng 500ơ ở ệ ộ ả C. M t đi n th  cao t  3 – 5kV t o ra cácộ ệ ế ừ ạ  electrron và ion hóa ch t phân tích.ấ

Đây cũng là m t kĩ thu t ion hóa m m. APCI độ ậ ề ượ ử ục s  d ng đ  phân tíchể  các ch t có kh i lấ ố ượng phân t  trung bình. Kĩ thu t này có th  b n phá   2 chử ậ ể ắ ở ế 

Máy t  c c d a trên nguyên t c các ion có kh i lứ ự ự ắ ố ượng khác nhau s  daoẽ  

đ ng khác nhau theo đi n áp t ng h p m t chi u và xoay chi u đ t vào môiộ ệ ổ ợ ộ ề ề ặ  

trường di chuy n c a nó.ể ủ

Máy g m 4 thanh c c ghép song song n i v i nhau t ng đôi m t đ i di nồ ự ố ớ ừ ộ ố ệ  nhau, t o thành hai  c p, sau đó chúng n i v i đi n áp m t chi u t o thành 2 c pạ ặ ố ớ ệ ộ ề ạ ặ  

dương và âm. Ngoài đi n áp m t chi u, hai c p đi n c c còn đệ ộ ề ặ ệ ự ược n i v i đi nố ớ ệ  

áp xoay chi u. T  h p đi n áp này đ c bi t là đi n áp xoay chi u s  thay đ iề ổ ợ ệ ặ ệ ệ ề ẽ ổ  theo chu k  đ  quét kh i lỳ ể ố ượng các ion:         

 + Ion c ng hộ ưởng

      + Ion không c ng hộ ưởng

      

Hình 1.6: B  phân tích t  c cộ ứ ự

M t s  ion có t  s  m/z xác đ nh c ng hộ ố ỷ ố ị ộ ưởng v i th  xoay chi u xác đ nhớ ế ề ị  

có th  đi th ng qua kho ng không đ n detector. Trong khi đó các ion khác khôngể ẳ ả ế  

s  có qu  đ o không  n đ nh va ch m v i các c c và b  gi  l i   đó. Tuy nhiênẽ ỹ ạ ổ ị ạ ớ ự ị ữ ạ ở  

đ  thu để ượ ấ ảc t t c  các ion ta quét đi n áp theo chu k  t  zero đ n m t đi n ápệ ỳ ừ ế ộ ệ  

nh t đ nh tăng d n sau đó l i tr  l i zero, l n lấ ị ầ ạ ở ạ ầ ượt các ion s  vẽ ượt qua đượ ứ c t

c c cũng có kh i lự ố ượng t  nh  đ n l n đ  đ n detectorừ ỏ ế ớ ể ế

 B  phân tích t  c c b y ion  (ộ ứ ự ẫ Quadrupole Ion­Trap Mass Analyser)

B y t  c c ho t đ ng theo nguyên lý b  phân tích kh i t  c c, ch  có m tẫ ứ ự ạ ộ ộ ố ứ ự ỉ ộ  

th  xoay chi u áp vào các c c các ion có t  s  m/z khác nhau có th  vế ề ự ỷ ố ể ượt qua kho ng không đ  đ n detector. Các ion này cũng có th  b  b n phá trong bãy đả ể ế ể ị ắ ể thu được các ion con. V  nguyên t c lo i phân tích kh i ph  bãy ion có th  làmề ắ ạ ố ổ ể  

đ n MS nhi u l n.ế ề ầ

Lo i thi t b  này bao g m m t đi n c c vòng (ạ ế ị ồ ộ ệ ự ring electrode) v i nhi uớ ề  

đi n c c bao xung quanh, đi n c c đ u c t (ệ ự ệ ự ầ ộ end­cap electrode)   trên và   dở ở ướ  i.Trái v i l i thi t b  t  c c   trên, các ion sau khi đi vào b y ion theo m t đớ ạ ế ị ứ ự ở ẫ ộ ườ  ngcong  n đ nh đổ ị ược b y l i cho đ n khi m t đi n áp RF đẫ ạ ế ộ ệ ược đ t trên đi n c cặ ệ ự  vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó tr  nên không  n đ nh và s  có hở ổ ị ẽ ướng đi về phía detector. Do đi n áp RF khác nhau trong h  th ng này mà thu đệ ệ ố ược m t phộ ổ 

kh i lố ượng đ y đ ầ ủ

Q1: B  t  c c th  nh t, có nhi m v  tách các ion. L a ch n ion m  v i m/zộ ứ ự ứ ấ ệ ụ ự ọ ẹ ớ  

nh t đ nh t  ngu n ion chuy n đ n đ  chuy n đ n Q2.ấ ị ừ ồ ể ế ể ể ế

Q2: B  t  c c th  hai,   đi u ki n áp su t cao, các ion m  b  phân li do vaộ ứ ự ứ ở ề ệ ấ ẹ ị  

ch m v i khí tr  có m t nh  khí Nạ ớ ơ ặ ư 2, Ar, He. B  Q2 t o ra phân ly do các ion mộ ạ ẹ 

b  phân m nh ti p theo t o ra các ion nh  h n, ion con (daughter ions). Q2 khôngị ả ế ạ ỏ ơ  đóng vai trò là b  l c ion mà nó ch p nh n t t c  các ion do Q1 chuy n đ n. Sauộ ọ ấ ậ ấ ả ể ế  

đó t t c  các ion con đấ ả ược chuy n qua b  tách Q3.ể ộ

Q0

Q3: B  t  c c th  ba làm nhi m v  tách các ion độ ứ ự ứ ệ ụ ược chuy n t  Q2 đ  đi t iể ừ ể ớ  

b  ph n phát hi n.ộ ậ ệ

Thi t b  kh i ph  ba t  c c thế ị ố ổ ứ ự ường được g i là máy kh i ph  hai l n (LC­ọ ố ổ ầMS/MS)

 B  ph n phát hi n.ộ ậ ệ

Sau khi đi ra kh i thi t b  phân tích kh i lỏ ế ị ố ượng, các ion được đ a t i ph nư ớ ầ  

cu i c a thi t b  kh i ph  là b  ph n phát hi n ion. B  ph n phát hi n cho phépố ủ ế ị ố ổ ộ ậ ệ ộ ậ ệ  

kh i ph  t o ra m t tín hi u c a các ion tố ổ ạ ộ ệ ủ ương  ng t  các electron th  c p đãứ ừ ứ ấ  

được khu ch đ i ho c t o ra m t dòng do đi n tích di chuy n. Có hai lo i bế ạ ặ ạ ộ ệ ể ạ ộ 

ph n phát hi n ph  bi n: b  ph n phát hi n nhân electron (electron multipler) vàậ ệ ổ ế ộ ậ ệ  

b  ph n phát hi n nhân quang (photo multipler).ộ ậ ệ

B  ph n phát hi n nhân electron là m t trong nh ng detector ph  bi nộ ậ ệ ộ ữ ổ ế  

nh t, có đ  nh y cao. M t ion đ p vào b  m t diot làm b t ra các electron. Cácấ ộ ạ ộ ậ ề ặ ậ  electron th  c p sau đó đứ ấ ược d n t i các diot ti p theo và s  t o ra electron thẫ ớ ế ẽ ạ ứ 

c p nhi u h n n a, t o thành dòng các electron (1­10ấ ề ơ ữ ạ 6)

B  ph n phát hi n nhân quang cũng gi ng nh  thi t b  nhân electron, cácộ ậ ệ ố ư ế ị  ion ban đ u đ p vào m t diot t o ra dòng các electron. Khác v i detector nhânầ ậ ộ ạ ớ  electron, các electron sau đó s  va đ p vào m t màn ch n photpho và gi i phóngẽ ậ ộ ắ ả  

ra các photon. Các photon này được phát hi n b i m t b  nhân quang ho t đ ngệ ở ộ ộ ạ ộ  

nh  thi t b  nhân electron. S  lư ế ị ố ượng các photon t  l  v i cỷ ệ ớ ường đ  tín hi u uộ ệ Ư  

đi m c a phể ủ ương pháp này là các  ng nhân quang đố ược đ t trong chân không nênặ  

lo i b  đạ ỏ ược các kh  năng nhi m b n.ả ễ ẩ

CHƯƠNG 2:  Đ I TỐ ƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

2.1. Đ i tố ượng và n i dung nghiên c uộ ứ

2.1.1. Đ i tố ượng nghiên c uứ

­ Ochratoxin là đ c t  gây tác h i vào các c  quan quan tr ng c a c  thộ ố ạ ơ ọ ủ ơ ể 

nh : th n kinh, gan, th n và h  mi n d ch  ư ầ ậ ệ ễ ị Ochratoxin A  gây h u qu  nghiêmậ ả  

tr ng đ i v i ngọ ố ớ ười và đ ng v t nuôi   n ng đ  c c th p (ppb). ộ ậ ở ồ ộ ự ấ Ochratoxin B có tính đ c ít h n ộ ơ ochratoxin A , tuy nhiên chúng đ u là ch t đ c thu c nhóm IIBề ấ ộ ộ  theo T  ch c nghiên c u ung th  Qu c t  IARC.ổ ứ ứ ư ố ế

­ N n m u phân tích: ngũ c c và các s n ph m t  ngũ c c, các lo i rề ẫ ố ả ẩ ừ ố ạ ượu lên men

2.1.2. N i dung nghiên c uộ ứ

N i dung nghiên c u bao g m:ộ ứ ồ

T i  u hóa đi u ki n ch y máy xác đ nh đ c t  Ochratoxin có trong s nố ư ề ệ ạ ị ộ ố ả  

ph m rẩ ượu lên men, ngũ c c và s n ph m t  các lo i ngũ c c b ng phố ả ẩ ừ ạ ố ằ ương pháp 

s c ký l ng kh i ph  (LC­MS/MS).ắ ỏ ố ổ

Xây d ng quy trình tách chi t ch t phân tích.ự ế ấ

Th m đ nh phẩ ị ương pháp:

 Đ  đ c hi u/ch n l c c a phộ ặ ệ ọ ọ ủ ương pháp

 Gi i h n phát hi n LOD, gi i h n đ nh lớ ạ ệ ớ ạ ị ượng LOQ

Ch n dung môi d  hoà tan ch t phân tích đ  chi t ch t phân tích ra kh iọ ễ ấ ể ế ấ ổ  

n n m u. Dung môi đó có th  là: chloroform, methanol, dung d ch cacbonateề ẫ ể ị  loãng,…Vì lo i dung môi này thạ ường kéo theo r t nhi u ch t t p khác có tínhấ ề ấ ạ  

ch t tấ ương t  ch t phân tích b  chi t vào nên r t c n lo i b t các ch t t p này.ự ấ ị ế ấ ầ ạ ớ ấ ạ  Chi t pha r n là m t phế ắ ộ ương pháp chu n b  m u đ  là giàu và làm s ch m uẩ ị ẫ ể ạ ẫ  phân tích t  dung d ch b ng cách h p ph  lên c t chi t pha r n. Sau đó ch t phânừ ị ằ ấ ụ ộ ế ắ ấ  tích đượ ửc r a gi i b ng m t lả ằ ộ ượng nh  dung môi thích h p. ỏ ợ

2.3. Phương ti n nghiên c uệ ứ

 C t s c ký: Water­ c t Cộ ắ ộ 18  (250mm × 2,1mm × 5μm) và ti n c t Cề ộ 18 (4mm × 2,1mm × 3μm) 

Các lo i hoá ch t s  d ng đ u thu c lo i tinh khi t phân tíchạ ấ ử ụ ề ộ ạ ế

o Ch t chu n c a Supelco, đ  tinh khi t 99,8 %.ấ ẩ ủ ộ ế

* Chu n b  dung d ch chu n.ẩ ị ị ẩ

­ Dung d ch chu n trung gian 500 µg/l: L y chính xác kho ng 10µl ch t chu nị ẩ ấ ả ấ ẩ  

l n lầ ượ ủ ừt c a t ng chu n g c có n ng đ  50000 µg/l vào m t vial màu nâu n pẩ ố ồ ộ ộ ắ  

kín, th i khô, hoà tan c n trong  1 ml MeOH. Chu n g c đổ ặ ẩ ố ược b o qu n   nhi tả ả ở ệ  

­ Đ i tố ượng m u: các lo i ngũ c c: ngô, lac, đ , g o,…, các lo i rẫ ạ ố ỗ ạ ạ ượu

­ Phương pháp l y m u: ng u nhiênấ ẫ ẫ

­ Đ a đi m: m t s  ch  trên đ a bàn n i thành Hà N i, B c Giang, Thanhị ể ộ ố ợ ị ộ ộ ắ  Hoá, Ngh  An.ệ

­ Kh i lố ượng m u l y: 100 – 500 g/m uẫ ấ ẫ

­ B o qu n: nhi t đ  thả ả ệ ộ ường

­ M u đ m b o đ  đ ng nh t theo yêu c uẫ ả ả ộ ồ ấ ầ

+V i m u rớ ẫ ượu: l c đ u trắ ề ước khi x  lý, rung lo i b t v i rử ạ ọ ớ ượu vang nổ+ V i m u ngũ c c: Dùng máy đ ng nh t m u đ  đ ng nh t kho ng 500gớ ẫ ố ồ ấ ẫ ể ồ ấ ả  

m u t i c  h t kho ng 1­2 mm.ẫ ớ ỡ ạ ả

CHƯƠNG 3: K T QU  VÀ TH O LU NẾ Ả Ả Ậ

3.1 T i  u các đi u  ki n ch y máy LC­MS/MSố ư ề ệ ạ

3.1.1 T i  u các đi u ki n ch y c a máy kh i ph  MS/MSố ư ề ệ ạ ủ ố ổ

3.1.1.1 Kh o sát ion m  và ion conả ẹ

Vì ochratoxin A, B là nh ng ch t có kh i lữ ấ ố ượng phân t  không l n và đử ớ ộ phân c c trung bình. ự Qua tham kh o tài li u ả ệ chúng tôi ti n hành kh o sát xác đ nhế ả ị  

các ochratoxin b ng kĩ thu t ion hóa phun đi n t  ESI v i ch  đ  b n phá ionằ ậ ệ ử ớ ế ộ ắ  

âm. Đ  t i  u hóa đi u ki n kh i ph , dùng xilanh b m h n h p 2 ch t chu nể ố ư ề ệ ố ổ ơ ỗ ợ ấ ẩ  

50 ng/ml tiêm tr c ti p vào detector kh i ph  đ  kh o sát. Ch n ch  đ  kh o sátự ế ố ổ ể ả ọ ế ộ ả  

t  đ ng đ i v i t ng ch t đ  ch n đự ộ ố ớ ừ ấ ể ọ ược ion m , ion con dùng đ  đ nh lẹ ể ị ượng và 

B ng 3.2 Các thông s  t i  u cho ESI­MS/MS ả ố ố ư

  + DP (Declustering Potential): Th  đ u vào, th  áp vào màn ch n c a bế ầ ế ắ ủ ộ 

ph n phân tích kh i. Nó có tác d ng b  g y c m ion [M+Hậ ố ụ ẻ ẫ ụ 3O+]+ và kh  nhi uử ễ  hóa h c t o thành, làm tăng đ  nh y c a phép phân tích. Tuy nhiên, th  này cũngọ ạ ộ ạ ủ ế  không được quá cao, vì nó có th  b  g y luôn c  c u trúc c a phân t  ion m ể ẻ ẫ ả ấ ủ ử ẹ + CXP (Collision Cell Exit Potential): Th  áp gi a b  t  c c Q2 và Q3.ế ữ ộ ứ ự

 + CE (Collision Energy): Là năng lượng va ch m đạ ượ ạc t o ra do th  áp vàoế  

b  t  c c Q2, t o ra năng lộ ứ ự ạ ượng đ  phân m nh ion m ể ả ẹ

M nh ion con m/z có cả ường đ  l n nh t dùng đ  đ nh lộ ớ ấ ể ị ượng, m nh conả  

3.1.1.2 T i  u các đi u ki n MSố ư ề ệ

Đ  t i  u hóa đi u ki n MS cho t ng ch t, chúng tôi s  d ng k  thu tể ố ư ề ệ ừ ấ ử ụ ỹ ậ  FIA, nghĩa là h n h p chu n đỗ ợ ẩ ược b m tr c ti p váo máy MS mà không qua bơ ự ế ộ HPLC v i đi u ki n nh  sau: Pha đ ng là amoni acetate 10 mM : methanol (95/5),ớ ề ệ ư ộ  

h n h p chu n có n ng đ  50 ppb, th  tích b m 10 µl, th i gian 1 phút. Ch n chỗ ợ ẩ ồ ộ ể ơ ờ ọ ế 

đ  kh o sát t  đ ng đ i v i t ng ion con đ nh lộ ả ự ộ ố ớ ừ ị ượng và đ nh tính c a t ng ch t.ị ủ ừ ấ

Các thông s  cho b  ph n t o ngu n ion.ố ộ ậ ạ ồ   + IS (IonSpray Voltage): Th  ion hóa, th  này đế ế ược áp lên đ u phun và mànầ  

ch n c a b  ph n phân tích ion. Th  này s  quy t đ nh lo i ion chuy n đ n bắ ủ ộ ậ ế ẽ ế ị ạ ể ế ộ 

ph n phân tích kh i. Đ i v i lo i ion dậ ố ố ớ ạ ương 4000 – 5500V, ion âm (­)3000 – (­)4000V

    + GS1 (Ion Source Gas 1): T o áp su t khí hai bên đ u phun, có tác d ngạ ấ ầ ụ  làm cho s  hình thành nên các gi t đự ọ ược d  dàng h n. T c đ  khí c a Gas 1ễ ơ ố ộ ủ  

thường cao h n so v i Gas 2.ơ ớ

    + TEM ( Temperature): Nhi t đ  c a ngu n khí nóng th i vào (Gas2). Nóệ ộ ủ ồ ổ  thúc đ y quá trình hóa h i các gi t ch t phân tích khi đi ra kh i đ u phun.ẩ ơ ọ ấ ỏ ầ

   + GS2 (Ion Source Gas 2): T o áp su t c a lu ng khí nóng, h  tr  quá trìnhạ ấ ủ ồ ỗ ợ  làm bay h i dung môi, tăng hi u qu  c a quá trình ion hóa.ơ ệ ả ủ

   + CUR (Curtain Gas): Lu ng khí Nồ 2 tinh khi t đế ược th i vào khe gi a 2 mànổ ữ  

ch n c a b  ph n ion hóa và b  ph n phân tích ph  Nó có tác d ng đ y các gi tắ ủ ộ ậ ộ ậ ổ ụ ẩ ọ  dung môi và các phân t  trung hòa, đ  gi  cho Qử ể ữ 0 (ngu n ion m  ) s ch h n.ồ ẹ ạ ơ

Các thông s  c a b  ph n phân phân tích kh i:ố ủ ộ ậ ố   + DP, CE, CXP nh  đã gi i thích   trên.  ư ả ở

   + EP (Entrance Potential): Th  áp vào ngu n ion m  Q0.ế ồ ẹ

   + CAD (Collision Gas Pressure): Ki m soát áp su t khí Nể ấ 2 trong b  t  c cộ ứ ự  Q2, thúc đ y quá trình phân m nh th  c p, ngoài ra còn có tác d ng làm mát cácẩ ả ứ ấ ụ  ion con và hướng chúng đ n b  t  c c Q3.ế ộ ứ ự

T  đ ng kh o sát các thông s  cho t ng ch t trên v i các giá tr  nh  sau:ự ộ ả ố ừ ấ ớ ị ư

 IS (V): ­4000,0; 4500,0; ­3500,0; ­3000,0;

 TEM (oC) : 250,0; 300,0; 350,0; 400,0;450,0

Qua kh o sát ta thu đả ược giá tr  t i  u c a t ng thông s  trên cho c  cácị ố ư ủ ừ ố ả  

ch t nghiên c u. Giá tr  đấ ứ ị ược li t kê trong b ng 3.3ệ ả

B ng 3.3: Các thông s  t i  u MS/MS.ả ố ố ư

K t lu n: Chúng tôi đã ti n hành kh o sát các đi u ki n MS và đ a raế ậ ế ả ề ệ ư  

được các đi u ki n t i  u nh  trong b ng trên.ề ệ ố ư ư ả

3.1.2 T i  u các đi u ki n ch y s c ký l ng hi u năng cao (HPLC)ố ư ề ệ ạ ắ ỏ ệ

3.1.2.1 Pha tĩnh

C t tách là b  ph n quan tr ng c a h  th ng s c ký, nó đóng góp m tộ ộ ậ ọ ủ ệ ố ắ ộ  

ph n quan tr ng trong vi c quy t đ nh quá trình tách. Ochratoxin là ch t kémầ ọ ệ ế ị ấ  

đ o s  d ng h  dung môi phân c c có tính kinh t  cao, phù h p v i đi u ki nả ử ụ ệ ự ế ợ ớ ề ệ  

c a phòng thí nghi m. Trong nghiên c u này, chúng tôi ch n c t pha đ o Củ ệ ứ ọ ộ ả 18 để tách các ch t. Đ  b o v  c t, chúng tôi s  d ng thêm ti n c t. Thông s  c t táchấ ể ả ệ ộ ử ụ ề ộ ố ộ  

và ti n c t: ề ộ

 C t: Waters­ c t Cộ ộ 18 (250 mm × 4,6 mm × 5 μm)

 Ti n c t: Cề ộ 18 (4 mm × 2,1 mm × 5 μm)

3.1.2.2 Kh o sát thành ph n pha đ ngả ầ ộ

Trong phương pháp s c ký l ng kh i ph , pha đ ng không ch   nh hắ ỏ ố ổ ộ ỉ ả ưở  ng

t i quá trình tách các ch t mà nó còn  nh hớ ấ ả ưởng t i quá trình ion hóa và tín hi uớ ệ  

c a ch t phân tích. V i kĩ thu t ion hóa phun đi n t  b n phá   ch  đ  ion âm,ủ ấ ớ ậ ệ ử ắ ở ế ộ  quá trình ion hóa tăng khi có thêm các ch t nh  acid acetic, acid formic, amoniấ ư  acetate  Trong phương pháp nghiên c u, pha tĩnh s  d ng là c t Cứ ử ụ ộ 18, ít phân c cự  nên pha đ ng ph i là h  dung môi phân c c. Ch t tan ít phân c c s  b  l u giộ ả ệ ự ấ ự ẽ ị ư ữ trong c t lâu h n  ch t tan phân c c. Do tính  ch t phân c c trung bình c aộ ơ ấ ự ấ ự ủ  Ochratoxin  nên chúng tôi ch n pha đ ng trên 2 kênh:ọ ộ

Kênh A: Dung d ch amoniacetate 10 mM.ị

Kênh B: Methanol

 Chúng tôi ti n hành dùng dung d ch chu n h n h p 50 ng/ml đ  kh o sátế ị ẩ ỗ ợ ể ả  dung môi pha đ ng. H n n a đ  có th  v a tách độ ơ ữ ể ể ừ ược các ch t, v a ti t ki mấ ừ ế ệ  

được th i gian phân tích và dung môi, chúng tôi ti n hành ch y pha đ ng v i chờ ế ạ ộ ớ ế 

đ  gradient. Các đi u ki n ch y máy độ ề ệ ạ ượ ố ịc c  đ nh nh  sau: ư

 C t: Waters­ c t Cộ ộ 18 (250 mm × 4,6 mm × 5 μm)

 Ti n c t: Cề ộ 18 (4 mm × 2,1 mm × 5 μm)

 Detector: kh i ph  v i các thông s  nh  b ng 2.2; 2.3.ố ổ ớ ố ư ả

 Pha đ ng: kênh B c  đ nh là Methanol, kênh A l n lộ ố ị ầ ượt là CH3COOH 0,1%, 

CH3COONH4 10 mM, CH3COONH4 20 mM, CH3COONH4 5 mM

B ng 3.5: K t qu  kh o sát thành ph n pha đ ngả ế ả ả ầ ộ

Nh n xét: Khi n ng đ  amoniacetate cao, s  lậ ồ ộ ố ượng ion đi vào bu ng ionồ  

c a detector MS tăng, gây c nh tranh v i các ion c a ch t phân tích, làm gi m tínủ ạ ớ ủ ấ ả  

hi u. Đ ng th i n ng đ  mu i cao s  gây h i đ n hi u l c và tu i th  c a c t.ệ ồ ờ ồ ộ ố ẽ ạ ế ệ ự ổ ọ ủ ộ  

T i n ng đ  amoniacetate 10 mM các ch t đ u cho tín hi u cao nh t, hình d ngạ ồ ộ ấ ề ệ ấ ạ  

pic đ p, không b  ch  pic, doãng chân pic. Ngoài ra amoniacetate còn không đ cẹ ị ẻ ộ  

h i, d  s  d ng Chúng tôi quy t đ nh ch n n ng đ  amoniacetate 10 mM. N ngạ ễ ử ụ ế ị ọ ồ ộ ồ  

­ M u phân tích: h n h p chu n Ochratoxin A, B n ng đ : 10 ng/mlẫ ỗ ợ ẩ ồ ộ

­ T c đ  pha đ ng kh o sát l n lố ộ ộ ả ầ ượt là: 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút

X I C o f - M R M ( 4 p i r s ) : 3 0 / 3 0 D a D : O T B 1 r o m S a m p l e 2 ( t e s t ) o f D a t a S T 1 w i f ( T u r b S p r a y ) M a x 7 7 0 c p s

0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5

T i m e , m i n 0

Nh n xét ậ : Khi tăng t c đ  dòng c a pha đ ng, các pic s c ký có xu hố ộ ủ ộ ắ ướ  ng

nh n và rõ nét. T i t c đ  dòng 1,2 ọ ạ ố ộ ml/phút các pic r t s c và nh n. Tuy nhiên,ấ ắ ọ  

t i t c đ  này, áp su t c a h  cao,  nh hạ ố ộ ấ ủ ệ ả ưởng r t l n đ n áp su t đ u vào c aấ ớ ế ấ ầ ủ  

c t và làm gi m tu i th  c a c t. Do đó, chúng tôi quy t đ nh l a ch n t c độ ả ổ ọ ủ ộ ế ị ự ọ ố ộ dòng 1,0 ml/phút. T i t c đ  này, các ch t b t đ u đạ ố ộ ấ ắ ầ ượ ửc r a gi i trong kho ngả ả  

t  6­8 phút, các píc tách t t, hình d ng píc s c nh n.ừ ố ạ ắ ọ

3.1.2.4 Ch n chọ ương trình ch y gradientạ

Th c hi n tách và xác đ nh đ ng th i 10 h p ch t trong cùng m t nhóm,ự ệ ị ồ ờ ợ ấ ộ  

có c u trúc g n gi ng nhau, s  d ng ch  đ  r a gi i đ ng dòng (isocractic) làấ ầ ố ử ụ ế ộ ử ả ẳ  không phù h p. Đ  có th  v a tách đợ ể ể ừ ược các ch t, v a ti t ki m đấ ừ ế ệ ược th i gianờ  phân tích và dung môi, chúng tôi ti n hành ch y pha đ ng v i ch  đ  gradient.ế ạ ộ ớ ế ộ  

Ti n hành kh o sát các chế ả ương trình ch y gradient khác nhauạ

B ng 3.6: Kh o sát các chả ả ương trình gradient

Chương trình 

gradient

Th i gianờ  (phút)

T c đố ộ dòng (ml/phút)

Kênh A: 

CH3COONH4 10 mM

Kênh B:MeOH

Hình 3.6: S c đ  khi ch y s c ký b ng chắ ồ ạ ắ ằ ương trình gradient 1.

Nh n xét: Khi gi  t  l  MeOH 100% quá ít ho c quá lâu đ u làm píc bậ ữ ỷ ệ ặ ề ị 

ch  và tù, làm gi m đ  nh y c a phẻ ả ộ ậ ủ ương pháp

Qua quá trình kh o sát chúng tôi ch n đả ọ ược chương trình ch y gradient 1ạ  cho tín hi u pic đ p nh t, các ch t đệ ẹ ấ ấ ược tách ra kh i nhau, pic thu đỏ ược không bị 

tù, không b  ch  píc, và di n tích pic cũng cao nh t đ i v i t t c  các ch t nghiênị ẻ ệ ấ ố ớ ấ ả ấ  

 Cân chính xác kho ng 5g m u ngô đã đ ng nh t vào  ng ly tâm 50 ml.ả ẫ ồ ấ ố  Thêm 100 µl chu n h n h p 100 ng/ml, thêm 30 ml CHClẩ ỗ ợ 3, l c ắ xoáy. L y  l p h uấ ớ ữ  

c  sang  ng ly tâm khác, thêm 10ml NaHCOơ ố 3 1%, l c ắ xoáy, ly tâm 6000v/p trong 3 phút. L y l p nấ ớ ước đem qua c t chi t pha r n C18. C t chi t pha r n độ ế ắ ộ ế ắ ược ho tạ  hóa b i 5ml MeOH, 5 ml Hở 2O. Sau đó, c t chi t độ ế ượ ử ạc r a t p b ng 2 ml Hằ 2O, 2 

ml MeOH:H2O (6:4). Ch t phân tích đấ ượ ửc r a gi i b ng 2 ml MeOH:CHả ằ 3COOH (99,5:0,5, v/v). D ch r a gi i đị ử ả ược chuy n vào vial đ ng m u r i b m vào hể ự ẫ ồ ơ ệ 

th ng LC­MS/MS (d ch có th  đố ị ể ượ ọc l c trước khi đem đo trên máy b ng màngằ  

l c m u c  0,2 µm, n u d ch b  đ c).ọ ẫ ỡ ế ị ị ụ

Quy trình 2 [3]

Cân 10 g m u ngô đã đ ng nh t vào bình tam giác 250 ml. Thêm 100 µlẫ ồ ấ  chu n h n h p 100 ng/ml, thêm 200ml NaHCOẩ ỗ ợ 3 1%, l c 30 phút. L c l y 10 mlắ ọ ấ  

d ch chi t, thêm 10 ml đ m phosphat saline (PBS) pH=7­8. H n h p d ch chi tị ế ệ ỗ ợ ị ế  

được qua c t chi t pha r n C18. C t độ ế ắ ộ ược ho t hóa b ng 10 ml PBS. Sau đó, c tạ ằ ộ  chi t đế ượ ử ạc r a t p b ng 5 ml nằ ước c t. Ch t phân tích đấ ấ ượ ửc r a gi i b ng 3 mlả ằ  MeOH. D ch r a gi i đị ử ả ược đem th i khô r i hòa c n l i b ng 1 ml MeOH, đemổ ồ ặ ạ ằ  

đi đo máy

Quy trình 3 [21]

Cân chính xác kho ng 5 g m u ngô đã đ ng nh t vào  ng ly tâm 50 ml.ả ẫ ồ ấ ố  Thêm 100 µl chu n h n h p 100 ng/ml, thêm 10 ml ethyl acetate, đem l c ẩ ỗ ợ ắ xoáy. 

L y 5 ml d ch chi t đem bay h i đ n khô dấ ị ế ơ ế ưới dòng khí N2   40  ở oC. Hòa c nặ  

b ng 5 ml acetonitril:Hằ 2O (84:16), sau đó cho qua c t chi t pha r n C18. Cácộ ế ắ  

bước ti p theo gi ng quy trình 1.ế ố

Nh m m c đích tìm đằ ụ ược ra quy trình x  lý m u t i  u nh t, chúng tôi đãử ẫ ố ư ấ  

ti n hành kh o trên 3 quy trình x  lý m u đã nêu   trên. M i quy trình ti n hànhế ả ử ẫ ở ỗ ế  làm l p l i 2 l n và l y k t qu  trung bình. K t qu  thu đặ ạ ầ ấ ế ả ế ả ược ch  ra trong b ngỉ ả  sau:

B ng 3.8: Kh o sát quy trình x  lý m uả ả ử ẫ

Nh n xét:ậ  T  k t qu  thu đừ ế ả ược ta nh n th y quy trình 1 cho hi u su t thuậ ấ ệ ấ  

h i là t t nh t trong 3 quy trình kh o sát. N u ch  chi t m u b ng NaHCOồ ố ấ ả ế ỉ ế ẫ ằ 3 thì 

d ch chi t thu đị ế ượ ấ ục r t đ c làm  nh hả ưởng đ n quá trình qua c t, d  gây t c c t.ế ộ ễ ắ ộ  

Đi u này v a làm m t nhi u th i gian chi t v a làm gi m hi u su t chi t c aề ừ ấ ề ờ ế ừ ả ệ ấ ế ủ  

c t chi t. Trong khi đó, đ  phân c c c a chloroform là 4,1, c a ethylacetate là 4,4ộ ế ộ ự ủ ủ  trong khi ochratoxins là các ch t có đ  phân c c y u.  Do đó dùng ethylacetat đấ ộ ự ế ể chi t m u cũng không cho hi u su t cao .ế ẫ ệ ấ

Do đó, chúng tôi s  t p trung kh o sát các đi u ki n c a quy trình 1 đẽ ậ ả ề ệ ủ ể 

đ a ra đư ược m t quy trình x  lý m u t i  u nh t .ộ ử ẫ ố ư ấ

Quy 

trình

Cthêm chu nẩ(ppb)

K t quế ả Ochratoxin A OchratoxinB

Quy trình x  lý m u d  ki n đử ẫ ự ế ược mô t  theo s  đ  sau:ả ơ ồ

Hình 3.7:Quy trình x  lý m u d  ki n.ử ẫ ự ế3.2.2 Kh o sát th  tích (s  l n chi t) dung môi chi t ả ể ố ầ ế ế

Th  tích dung môi chi t  nh hể ế ả ưởng đ n hi u su t chi t ch t c n phânế ệ ấ ế ấ ầ  tích. N u dung môi chi t quá ít s  không hoà tan tri t đ  ch t c n phân tích,ế ế ẽ ệ ể ấ ầ  

nh ng n u quá nhi u s  gây lãng phí và  nh hư ế ề ẽ ả ưởng đ n môi trế ường. 

Chúng tôi s  d ng n n m u ngô không phát hi n ochratoxins đ  ti n hànhử ụ ề ẫ ệ ể ế  

kh o sát ti p. Cân chính xác kho ng 5 g b t ngô , thêm 100µl chu n h n h p cóả ế ả ộ ẩ ỗ ợ  

n ng đ  100 ng/ml. Ti n hành chi t l p 1, 2, 3 l n các m u b ng dung môiồ ộ ế ế ặ ầ ẫ ằ  CHCl3 v i th  tích m i l n chi t l n lớ ể ỗ ầ ế ầ ượt là 5, 10, 15 ml. Các bước được ti nế  hành theo quy trình 1. Ta thu được k t qu  nh  sau:ế ả ư

B ng 3.9: K t qu  s  ph  thu c c a th  tích dung môi chi t và hieuj su t chi tả ế ả ự ụ ộ ủ ể ế ấ ế

Nh n xét: Qua quá trình kh o sát, chúng tôi nh n th y chi t cloroform m tậ ả ậ ấ ế ộ  

l n 15 ml thì ch t phân tích v n ch a chi t đầ ấ ẫ ư ế ược hoàn toàn. K t qu  chi t  2 l nế ả ế ầ  

và 3 l n không khác nhau đáng k  Hi u su t chi t l p ba l n m i l n 10 ml choầ ể ệ ấ ế ặ ầ ỗ ầ  

k t qu  tế ả ương t  khi chi t l p 2 l n m i l n 15 ml. Do đó đ  ti t ki m dungự ế ặ ầ ỗ ầ ể ế ệ  môi, chúng tôi ch n chi t l p 2 l n m i l n 15 ml CHClọ ế ặ ầ ỗ ầ 3

3.2.3 Ch n c t chi t pha r nọ ộ ế ắ

Vì Ochratoxin có tính axit y u nên chúng tôi ch n 2 lo i c t đ  kh o sát làế ọ ạ ộ ể ả  

c t   C18   và   c t   Polydivinylbezen­N­vinylpyrolidon   HLB   Oasis   (   hydrophileộ ộ  lyophile balance). 

S  d ng n n m u ngô không phát hi n OTs. Quá trình chi t m u đử ụ ề ẫ ệ ế ẫ ượ  c

th c hi n theo quy trình 1. K t qu  thu đự ệ ế ả ược nh  sau:ư