Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)

Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMSMS) (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thị Hà Bình XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG OCHRATOXIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 MỞ ĐẦU Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày quan tâm liên quan trực tiếp tới sức khỏe tất người tiêu dùng Thời gian vừa qua nước liên tiếp phát vụ ngộ độc thực phẩm có vụ ngộ độc mycotoxin đặc biệt nghiêm trọng …đã gây tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm sử dụng thực phẩm cách Theo thống kê Cục An toàn thực phẩm vụ ngộ độc thực phẩm năm gần nước: - Năm 2009: Toàn quốc xảy 147 vụ ngộ độc thực phẩm, có 5026 người mắc; 3958 người nhập viện; 33 người tử vong - Năm 2010: Tình hình NĐTP năm 2010 phức tạp Toàn quốc xảy 175 vụ ngộ độc có 34 vụ ngộ độc 30 người làm 5664 người mắc 42 trường hợp tử vong, so sánh với số liệu trung bình năm giai đoạn 20062009, số vụ ngộ độc giảm 9,1%; số mắc giảm 17,6% số tử vong giảm 19,2% - Năm 2011: 148 vụ, 4700 người mắc, 27 người tử vong - Năm 2012: 168 vụ, 5541 người mắc, 34 người tử vong Theo TS Trần Quang Trung, Cục trưởng Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, tháng năm 2013, nước có 108 vụ ngộ độc thực phẩm làm 2.800 người mắc, có 18 ca tử vong Trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm thống kê quý III nguyên nhân vi sinh vật 23 vụ, độc tố tự nhiên vụ, hóa chất vụ 11 vụ chưa xác định nguyên nhân Các vụ ngộ độc xảy khắp nơi, từ gia đình riêng đến tập thể Ochratoxin loại độc tố sinh chủng nấm mốc thuộc giống Aspergilus ochraceus Penicillium verrucusum loại độc tố có tiềm gây ung thư viêm thận người động vật Độc tố phát nhiều nông sản khác bao gồm ngũ cốc sản phẩm chúng Điều đáng lo ngại ăn phải thức ăn bị nhiễm ochratoxin không gây ngộ độc cấp tính mà tích lũy dần thể - nguy tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho người Trong số 10.000 loại nấm mốc khác biết đến có khoảng 50 loại có hại gia súc gia cầm người Các loại nấm sản sinh độc tố gọi chung mycotoxin Mycotoxin chất độc sinh từ nấm mốc, hình thành nấm chuyển hóa chất dinh dưỡng có thức ăn nguyên liệu Theo tổ chức lương thực nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc giới có chứa hàm lượng mycotoxin mức độ Tùy vào địa lý, khả nhiễm mycotoxin lại khác điều kiện nhiệt đới cận nhiệt đới, nguy nhiễm mycotoxin cao Đặc thù khí hậu sản xuất nông nghiệp Việt Nam tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc phổ biến Sự hình thành nấm mốc độc tố chúng đồng, lúc thu hoạch, bảo quản trình chế biến thức ăn cho vật nuôi Như vậy, không nơi giới thoát khỏi nấm mốc độc tố từ chúng, tác hại chúng vô to lớn suất vật nuôi sức khỏe người Để kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin thực phẩm, Việt Nam giới có nhiều phương pháp phân tích nghiên cứu ứng dụng Nhưng với đặc điểm ưu việt độ xác cao nên phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ coi phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát định lượng nồng độ ochratoxin lượng vết hay siêu vết Xuất phát từ tính cấp thiết xã hội tính ưu việt phương pháp phân tích, xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định hàm lượng Ochratoxin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)” Mục tiêu thực đề tài nghiên cứu là: Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Ochratoxin thực phẩm bao gồm: - Khảo sát điều kiện máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ - Khảo sát điều kiện xử lý mẫu - Thẩm định phương pháp xây dựng Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men thị trường nước CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu chung ochratoxins[14-15] 1.1.1.Định nghĩa Độc tố ochratoxin, sản phẩm chuyển hoá thứ cấp số loài nấm mốc Ochratoxin có mặt khắp loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê sản phẩm có nguồn gốc động vật bị lây nhiễm trước Ochratoxins biết đến sản phẩm loài nấm Aspergillus Penicillium thường tìm thấy nhiều loại sản phẩm lương thực thức ăn chăn nuôi Ochratoxin A lần tìm thấy nấm mốc A ochraceus vùng Nam Phi Scott (1965) hạt lúa bị nhiễm A.ochraceus thường xuyên thịt Đức tìm thấy Ochratoxin Anh, chúng tìm thấy đậu nành, bắp bột, ca cao M.Nakajima năm 1997 ghi nhận tỷ lệ chiểm 30% hàm lượng OTA từ 0.1 – 17,4 µg/kg 47 mẫu café nhập vào Nhật Bản từ nước Nam Phi , số nước ASIAN Tại Việt Nam, nghiên cứu tiến hành 123 mẫu ngô xã Cán Tỷ Lùng Tám huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang Kết cho thấy: 123 mẫu ngô phân tích có tới 50 mẫu (40,7 %) phát có ochratoxin A, số có mẫu (1,6 %) vượt mức dư lượng theo quy định Bộ Y tế Cho tới phát loại ochratoxin khác Trong khuôn khổ luận văn quan tâm nghiên cứu đến ochratoxin A B Ochratoxin A Ochratoxin B Hình 1.1: Cấu trúc Ochratoxins 1.1.2.Tính chất hóa lý Ochratoxins Ochratoxins đốc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan dung môi hữu phân cực chloroform, methanol, …, tan nước tan đệm carbonat loãng) Ochratoxins bền vững với xử lý nhiệt hóa chất Độc tố sản sinh nhiều nhiệt độ từ 20-250C Sự sản sinh ochratoxins phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính nước hạt, chất, nhiệt độ Ochratoxins dễ bị phân hủy ánh sáng, môi trường kiềm chất tẩy rửa Ochratoxin A phát huỳnh quang hấp thụ UV cực đại 365nm Ochratoxin A có điểm nóng chảy 1690C Phổ hồng ngoại cloroform cho píc có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1 OTA có tính axit yếu pKa1 = 4,2-4,4 pKa2 = 7,07,3 Ochratoxin A phát huỳnh quang xanh dùng thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC) chiếu tia UV 366nm Ochratoxin B có trọng lượng phân tử 369,37 Ochratoxin B phát huỳnh quang màu xanh chiếu tia UV bước sóng 318 nm Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2210C Cơ chế tác động ochratoxins: ochratoxins gây ức chế vận chuyển ribonucleic axit (tARN) axitamin Ochratoxins ức chế vi khuẩn, nấm men phenylalanine - tARN gan Tác động làm ức chế tổng hợp protein tế bào thể Sự ức chế miễn dịch ochratoxin biểu làm giảm thực bào ức chế tế bào lympho Ức chế tương tự amino axit synlaza tARN tương ứng ochratoxin A gây ức chế hydroxylase phenylalanine, nửa phenylalanine ochratoxin A phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh tế bào gan thể Ochratoxin ức chế tổng hợp ARN làm ảnh hưởng đến protein vòng tuần hoàn Tác động đến tế bào màng ti thể gây hiệu ứng khác ti thể Kích thích hình thành ADN thận, gan lách Các ADN sợi đơn bị phá vỡ Các nguyên liệu dễ nhiễm độc tố cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê Dư lượng ochratoxin tìm thấy thịt heo thịt gia cầm Độc tố gây hại đến gan thận động vật Với nồng độ lớn ppm làm giảm sản lượng trứng gà đẻ, nồng độ lớn ppm gây nên tổn thương gan ruột Tương tự Aflatoxin, độc tố gây nên giảm sức đề kháng tác nhân gây ung thư người - Gây tổn thương tế bào gan: tất trường hợp xác định ngộ độc Ochratoxin có bệnh tích giống chỗ gan bị hư hại nặng Tùy theo mức độ nhiễm hay nhiều, lâu hay mau mà tình trạng bệnh gan khác Biểu chung ban đầu gan động vật (điển hình gà) biến thành màu vàng tươi, mật sưng sau gan sưng phồng bắt đầu mụn nhỏ bề mặt làm cho gồ ghề có nốt hoại tử màu trắng, sau nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở dễ vỡ - Thận sưng to làm cho việc đào thải chất độc khỏi thể trở nên khó khăn, từ làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng - Làm giảm khả đề kháng động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể, gây tử vong cho động vật Khi nhiễm độc ochratoxin thể mẫn cảm với loại bệnh thông thường - Bào mòn niêm mạc ống tiêu hóa lớp tế bào niêm mạc bị chết bong bị khô lại hình thành nên lớp màng bọc làm cản trở chuyển thức ăn ống tiêu hóa - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường gây rối loạn sinh sản thú mang thai gây chết thai Đối với gia cầm gây tỷ lệ chết phôi giai đoạn đầu cao, tỷ lệ nở thấp - Làm giảm tính ngon miệng thức ăn phát triển nấm mốc làm mùi thức ăn - Làm hư hại vitamin thức ăn lên men phân giải nấm mốc - Ngoài tác hại nấm mốc có thức ăn lên men phân giải nguồn dường chất (glucid, protein, acid amin, vitamin ) làm cho thức ăn bị giảm giá trị nghiêm trọng, làm mùi tự nhiên, chuyển sang mùi hôi mốc, vật nuôi không thích ăn Như nói độc tố nấm gây tác hại lớn hậu vô nghiêm trọng cho thể người động vật Tùy theo loại mà độc tố nấm mốc gây nhiễm độc cấp tính mãn tính Độc tố nấm mốc gây ngộ độc cấp tính, gây hại thể từ từ làm cho không hay biết Nhưng phát sinh triệu chứng quan phận chúng công hư hại nghiêm trọng khó chữa trị Tuy nhiên, độc tố nấm mốc thức ăn gây nên huỷ hoại thầm lặng hệ thống miễn dịch gia súc, làm cho chúng mẫn cảm bệnh Khác với bệnh nhiễm trùng kháng sinh không điều trị nhiễm độc tố nấm mốc Cách tốt ngăn ngừa không cho độc tố nấm mốc nhiễm vào thức ăn Trên heo: Liều gây chết : LD50 1-6 mg/kg, gà: LD50 3,6 mg/kg gà 10 ngày tuổi 1.1.3 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép (MRL) - Mức dư lượng tối đa cho phép giới hạn dư lượng loại thuốc, phép tồn mặt pháp lí xem chấp nhận nông sản, thức ăn mà không gây hại cho người sử dụng vật nuôi dùng Bảng 1.1: Mức dư lượng tối đa cho phép Ochratoxin A Việt Nam Loại µg/g Ngũ cốc chưa qua chế biến Hạt cà phê rang, cà phê bột Cà phê uống liền 10 Rượu vang, nước nho ép Thực phẩm dành cho trẻ 36 tháng tuổi 0,5 Gia vị 30 Sản phẩm chiết xuất từ cam thảo 80 Ngũ cốc bột ngũ cốc Hiện chưa có quy định cụ thể mức MRL cho ochratoxin B kể nước tiêu chuẩn Châu Âu (EN) 1.2 Các phƣơng pháp xác định 1.2.1 Phƣơng pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Nguyên tắc dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Ochratoxin chuẩn cộng hợp với enzyme, tạo thành phức hợp Ochratoxinenzyme sử dụng kháng nguyên nồng độ định, cạnh tranh với ochratoxin có mẫu Kháng thể đặc hiệu với ochratoxin gắn lên bề mặt giếng nhựa polystryren Dịch chiết mẫu methanol 70% trộn cộng hợp với ochratoxin – enzyme cho vào giếng có phủ kháng thể, ochratoxin có mẫu (nếu có) cạnh tranh với phức hợp ochratoxin- enzyme để gắn vào kháng thể cố định polystryren Sau rửa phức hợp thừa, chất phản ứng với enzyme đưa vào tạo màu Ủ thời gian sau thêm vào dung dịch ngưng phát màu để tạo điều kiện đồng thời gian cho giếng Tiến hành đo độ hấp thụ mẫu dãy chuẩn máy đo màu, từ tính nồng độ ochratoxin có mẫu Màu đậm chứng tỏ cộng hợp ochratoxin – enzyme giữ giếng nhiều, đồng nghĩa với nồng độ ochratoxin mẫu thấp Ngược lại, màu nhạt nồng độ Ochratoxin cao Sử dụng phương pháp ELISA để xác định ochratoxin kể đến số nghiên cứu sau: Nhóm tác giả Aihua Zhang, Yanna Ma, Lulu Feng, Ying Wang, Chenghua He, Xichun Wang, Haibin Zhang [14] xác định Ochratoxin đối tượng mẫu ngũ cốc nguyên liệu Nanjing, Trung Quốc Phương pháp phân tích có giới hạn phát 0,15 ng/ml Độ thu hồi phương pháp đạt từ 87-101% mức thêm chuẩn 2,5-10 ppb Nhóm tiến hành phân tích 65 mẫu ngô, gạo, lúa mì Kết cho thấy số 22 mẫu lúa mì chứa Ochratoxin A khoảng 2- ppb (chiếm 36% tổng số mẫu), số 23 mẫu ngô (chiếm khoảng 26% tổng số mẫu) dương tính với Ochratoxin A khoảng 3-23 ppb, số 20 mẫu gạo (chiếm khoảng 15% tổng số mẫu) dương tính với Ochratoxin A khoảng 2-3 ppb Nhóm tác giả Pedro Novoa, Géraud Moulasa, Duarte Miguel Franc¸ Prazeresb, Virginia Chua, João Pedro Conde [32] xác định Ochratoxin mẫu rượu với giới hạn phát 0,85 ng/ml Ochratoxin phát dung dịch đệm PBS với việc sử dụng cấu hình kênh thẳng Kỹ thuật có ưu điểm: nhanh, đơn giản,tiết kiệm dung môi, đặc hiệu nhạy so với phương pháp HPLC hiệu dễ cho kết dương tính giả âm tính giả 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC) Phương pháp sắc ký khí số tác giả ứng dụng để xác định loại độc tố Ochratoxin Tuy nhiên phương pháp phân tích chất dễ bay hơi, chất khó bay phải tạo dẫn xuất nên tốn thời gian hóa chất Hơn nữa, để phân tích đồng thời chất cần thời gian phân tích dài Do vậy, phương pháp ứng dụng để phân tích loại độc tố Ochratoxin Tác giả Yuying Jiao cộng [31] tiến hành xác định Ochratoxin thực phẩm phương pháp sắc ký khí Ochratoxin A chuyển thành dạng dẫn xuất ester 0-methyl ochratoxin A xác định sắc ký khí khối phổ với chế độ ESI âm 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cột lực miễn dịch (IAC) Giống ELISA, cột lực miễn dịch dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Kháng thể đặc hiệu với ochratoxin gắn lên giá rắn cột sắc ký (thường dùng Sepharose 4B), tạo cho IAC đặc tính vừa tinh vừa cô đặc ochratoxin Mẫu chiết với acetonitril/H2O, sau pha loãng cho qua cột lực miễn dịch Cột rửa tạp chất không gắn lên kháng thể giải hấp methanol Tiến hành định lượng HPLC với detector huỳnh quang Bản thân Ochratoxin chất phát huỳnh quang bước 10 Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ OTB Từ đồ thị ta thấy giới hạn tuyến tính (LOL) OTA, OTB 500 ng/ml Như từ kết khoảng tuyến tính chất ng/ml-500 ng/ml 3.3.4 Xây dựng đƣờng chuẩn Lập dãy chuẩn có nồng độ từ 1ng/ml đến 500 ng/ml Hình 3.15: Đường chuẩn Ochratoxin A 50 Hình 3.16: Đường chuẩn Ochratoxin B Nhận xét: Nhận thấy hệ số hồi quy tuyến tính r đường chuẩn nằm khoảng: 0,995 ≤ r ≤ Do đường chuẩn dựng chấp nhận 3.3.5 Độ xác (accuracy) phƣơng pháp phân tích (độ độ chụm) [11] Độ chụm hay độ lặp lại mức độ gần giá trị riêng lẻ phép đo lặp lại Độ chụm khái niệm định tính biểu diễn định lượng độ lệch chuẩn S hay hệ số biến thiên CV(%).: CV(%) = S 100 x  x N S  i 1 i x  N 1 Trong đó: xi : Nồng độ tính lần thử nghiệm thứ i x : Nồng độ trung bình tính N lần thử nghiệm N : Số lần thử nghiệm 51 Độ mức độ gần giá trị phân tích với giá trị thực giá trị chấp nhận Độ khái niệm định tính biểu diễn định lượng dạng độ chệch (Bias) hiệu suất thu hồi (recovery) R(%) = C 100 Cc Trong đó: R: độ thu hồi (%) C : Nồng độ chất phân tích mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml) Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/ml) Để xác định độ chụm độ phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm sau: Tiến hành thí nghiệm lặp lại mẫu trắng ( mẫu ngô phân tích không chứa chất cần phân tích) thêm chuẩn mức nồng độ khác (mỗi mức làm lặp lại lần) Cụ thể thêm chuẩn hỗn hợp mức 2,5 ng/ml , ng/ml , 10 ng/ml Kết thu sau: 52 Bảng 3.16: Kết đánh giá độ xác phương pháp OTA Cspike Lần 2,5 10 xi OTB x SD RSD% R% xi 2,3 1,9 1,8 2,1 2,2 2,1 1,8 2,3 1,6 3,9 3,8 4,5 3,6 4,2 3,8 4,6 4,1 4,1 4,3 8,6 7,4 7,4 6,9 6,9 8,5 8,1 7,6 8,6 6,8 2,1 0,2 9,1 4,2 0,3 7,6 0,7 8,9 85 84 80 2,2 3,7 4,2 8,5 8,2 x SD RSD% R% 1,9 0,2 11 77 0,3 7,2 79 7,6 0,7 9,0 76 Nhận xét: Theo qui định Châu Âu 2002/657/EC [27], độ độ chụm phụ thuộc nồng độ chất sau: 53 Bảng 3.16: Qui định độ độ chụm phương pháp định lượng phụ thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC Theo bảng trên, cấp độ từ 10 – 100 µg/kg, hệ số biến thiên CV ≤ 20%; hiệu suất thu hồi cấp độ từ – 10 µg/kg phải nằm khoảng 70 – 110% Như vậy, phương pháp có độ độ chụm đạt yêu cầu Châu Âu 54 Analyte Concentration (ng/mL) 0.500 2.50 5.00 10.0 N/A III 6.52 300 5.48 100 c III c p s 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, 6.0 7.0 8.0 9.0 6.90 1200 1000 800 7.21 400 6.53 200 5.77 a 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, 9.40 6.02 6.0 7.0 Modified: Yes Proc Algorithm: Specify Parameters Noise Percentage: 50 Base Sub Window: 1.00 Peak-Split Factor: Report Largest Peak: Yes Min Peak Height: 0.00 cps Min Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 6.93 MQ III 8.0 9.0 Record Modified Modified: Yes Proc Algorithm: Specify Parameters Noise Percentage: 50 Base Sub Window: 1.00 Peak-Split Factor: Report Largest Peak: Yes Min Peak Height: 0.00 cps Min Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 6.93 Calculated Concentration (ng/mL) 0.493 2.34 5.14 9.87 No Peak Accuracy (%) 98.6 93.4 103 98.7 N/A 7.06 800 700 600 500 7.37 400 300 200 6.70 100 Sample Name: "Std 10" Sample ID: "" File: "DataSET1.wiff" Peak Name: "OTA1" Mass(es): "402.000/358.000 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: Sample Type: Standard Concentration: 10.0 ng/mL Calculated Conc: 9.87 ng/mL Acq Date: 7/11/2013 Acq Time: 2:01:20 PM 600 , MQ 1.0 8.24 I n t e n s it y , o 4.80 0.0 9.39 7.90 5.20 Use Record Sample Name: "Spike 2.5" Sample ID: "" File: "DataSET1.wiff" Peak Name: "OTA1" Mass(es): "402.000/358.000 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: Sample Type: QC Concentration: 2.50 ng/mL Calculated Conc: 2.34 ng/mL Acq Date: 7/11/2013 Acq Time: 1:40:26 PM 7.15 400 200 Sample Name: "Std 5" Sample ID: "" File: "DataSET1.wiff" Peak Name: "OTA1" Mass(es): "402.000/358.000 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: Sample Type: Standard Concentration: 5.00 ng/mL Calculated Conc: 5.14 ng/mL Acq Date: 7/11/2013 Acq Time: 1:50:58 PM Modified: Yes Proc Algorithm: Specify Parameters Noise Percentage: 50 Base Sub Window: 1.00 Peak-Split Factor: Report Largest Peak: Yes Min Peak Height: 0.00 cps Min Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 6.93 I n t e n s it y , n MQ u Modified: Yes Proc Algorithm: Specify Parameters Noise Percentage: 50 Base Sub Window: 1.00 Peak-Split Factor: Report Largest Peak: Yes Min Peak Height: 0.00 cps Min Peak Width: 0.00 sec Smoothing Width: points RT Window: 30.0 sec Expected RT: 6.93 Standard Query Status N/A N/A N/A N/A N/A c p s Analyte Peak Height (cps) 3.50e+002 7.38e+002 1.19e+003 1.81e+003 0.00e+000 c p s s 1.34e+003 2.80e+003 5.02e+003 8.77e+003 0.00e+000 t Sample Name: "Std 0.5" Sample ID: "" File: "DataSET1.wiff" Peak Name: "OTA1" Mass(es): "402.000/358.000 Da" Comment: "" Annotation: "" Sample Index: Sample Type: Standard Concentration: 0.500 ng/mL Calculated Conc: 0.493 ng/mL Acq Date: 7/11/2013 Acq Time: 1:30:06 PM Analyte Peak Area (counts) File Name 2013\T7\11\DataSE 2013\T7\11\DataSE 2013\T7\11\DataSE 2013\T7\11\DataSE 2013\T7\11\DataSE I n t e n s it y , Sample Type Standard Quality Control Standard Standard Unknown MQ III c p s Sample ID Std 0.5 Spike 2.5 Std Std 10 M1-5.98 0.0 3.43 1.0 2.0 3.0 5.37 4.0 5.0 Time, 8.06 5.65 5.85 6.0 I n t e n s it y , Sample Name 7.0 9.53 8.35 8.0 9.0 8.0 9.0 6.97 1500 1000 500 6.41 6.59 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Time, 6.0 7.0 e Untitled (OTA1): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 792 x + 951 (r = 0.9998) r 9000 A 5000 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Concentration, ng/mL 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Hinh3.17: Sắc đồ OTs tai mức thêm chuẩn 2,5 ng/ml Như phương pháp nghiên cứu áp dụng vào thực tế để xác định Ochratoxin A, B đối tượng mẫu thực tế 3.4 Phân tích mẫu thực tế Sau nghiên cứu điều kiện tách chiết, tiến hành phân tích mẫu thực khác Các mẫu tiến hành khảo sát bao gồm: ngũ cốc sản phẩm chế biến từ ngũ cốc loại rượu lên men Các mẫu đồng nhất, sau đem cân tiến hành phân tích qui trình tối ưu hóa Mỗi mẫu tiến hành làm lặp lại lần , lấy kết trung bình tính độ lệch chuẩn Chúng tiến hành phân tích 20 mẫu rượu nhập ngoại lên men từ hoa quả, xuất xứ Chi Lê, Pháp, Colombia mẫu ngô, lạc lấy ngẫu nhiên địa bàn tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An Kết phát số mẫu có chứa ochratoxin A, B, nhiên ngưỡng cho phép Hiệu suất thu hồi mẫu thêm chuẩn nằm khoảng 70-110% 55 10.0 Kết phân tích mẫu sau: Bảng 3.17: Kết phân tích mẫu thực tế Diện tích OTA Diện tích OTB C-OTA (ng/g ng/ml) C-OTB (ng/g ng/ml) STT Đối tƣợng m (g) /V(ml) Rượu L'estaminet - Pháp KPH KPH KPH KPH Rượu Raiz - Chi Lê KPH KPH KPH KPH Rượu MirabeauPháp KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 5,12 5,24 5,23 6,12 5,02 5,95 5,78 5,21 5,06 5,23 5,62 5,14 5,42 5,33 5,27 KPH KPH 3500 KPH KPH KPH KPH KPH 3700 KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 1560 KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 3,9 KPH KPH KPH KPH KPH 4,1 KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 2,2 KPH KPH KPH KPH KPH KPH 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Rượu Piraat - Bỉ Rượu Bordeaux -Pháp LN-BG-01 LN-BG-02 LN-BG-03 LC-BG-04 LN-BG-05 LN-BG-06 LN-TH-01 LC-TH-02 Ngo-TH-03 LN-TH-04 LN-TH-05 LN-NA-01 LC-NA-02 LN-NA-03 LN-NA-04 Ghi chú: LN: lạc nhân LC: lạc củ BG: Bắc Giang TH: Thanh Hóa 56 s c p s i t y , NA: Nghệ An XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (1602-3.27) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max 963.0 cps 7.38 s i t y I, n c t pe sn 963 800 600 400 8.47 200 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 963.0 cps 7.38 963 s i t y ,I n c t pe sn 8.88 6.78 6.44 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (1602-3.27) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 800 600 400 8.47 200 0.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample (1602-3.27) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.0 8.88 6.78 6.44 0.5 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 655.0 cps n 7.02 t e 600 6.33 I n 400 200 6.67 7.85 6.05 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Time, 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.28 8.39 8.0 8.5 9.0 9.5 Hình3.18: :Sắc đồ mẫu rƣợu Ochratoxin A, B I n t e n s i t y ,I n c t pe sn s i t y I, n c t pe sn s i t y , c p s 0.0 XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (M1-5.98) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max 6975.0 cps 7.50 6975 6000 4000 2000 8.07 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (M1-5.98) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 6975.0 cps 7.50 6975 6000 4000 2000 8.07 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample (M1-5.98) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.0 6.5 7.0 8.5 9.0 9.5 Max 813.0 cps 5.16 600 6.01 6.34 6.71 400 200 4.73 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 7.86 5.0 Time, 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.43 8.51 8.0 8.5 9.08 9.0 9.41 9.5 Hình3.19: Sắc đồ mẫu ngô Ochratoxin A, B c p s I n t e n s i t y ,I n c t pe sn s i t y I, n c t pe sn s i t y , 8.0 7.40 800 0.0 7.5 XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample 12 (743-1-10.57) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max 230.0 cps 280 250 7.46 200 150 6.20 100 0.0 7.87 6.71 5.82 50 8.03 8.64 5.44 5.70 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 9.49 4.5 5.0 5.5 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample 12 (743-1-10.57) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 230.0 cps 7.46 230 200 150 6.20 100 7.87 6.71 5.82 8.03 8.64 50 5.44 5.70 0.0 9.49 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample 12 (743-1-10.57) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 208.0 cps 7.38 200 150 100 0.0 6.62 5.96 50 5.27 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Time, 5.5 8.14 6.23 5.61 6.0 8.55 6.5 7.0 7.5 8.0 Hình 3.20: Sắc đồ mẫu lạc Ochratoxin A, B 57 8.5 8.96 9.0 9.10 9.5 s c p s i t y , XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (LN-BG-03-5.12g) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max 2.6e5 cps sn 7.30 2.5e5 s i t y I, n c t pe 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (LN-BG-03-5.12g) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 2.6e5 cps s i t y ,I n c t pe sn 7.30 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample (LN-BG-03-5.12g) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 2.1e4 cps n 8.62 2.0e4 t e 7.07 1.5e4 I n 1.0e4 5000.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Time, 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 c p s i t y , XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (ngo-TH-03-5.23) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max 2.9e4 cps 6.37 2.9e4 2.5e4 s i t y I, n c t pe sn 9.5 Hình 3.21: Sắc đồ mẫu lạc có Ochratoxin A s 0.0 0.0 2.0e4 1.5e4 1.0e4 7.18 5000.0 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample (ngo-TH-03-5.23) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 2.9e4 cps 6.37 2.9e4 2.5e4 s i t y ,I n c t pe sn 6.5 2.0e4 1.5e4 1.0e4 7.18 5000.0 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Time, XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample (ngo-TH-03-5.23) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Max 1.8e4 cps 6.61 n 1.8e4 t e 1.5e4 I n 1.0e4 5000.0 6.97 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Time, 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 Hình 3.22: Sắc đồ mẫu ngô có Ochratoxin A, B Chúng tiến hành thêm chuẩn mẫu ngô lạc có phát Ochratoxins Thêm 100µl hỗn hợp chuẩn 100ng/ml sau cân mẫu tiến hành theo quy trình tối ưu Kết phân tích sau: 58 9.5 Bảng 3.18: Kết phân tích mẫu ngo-TH-03 LN-BG-03 thêm chuẩn mức 5ppb OTA Đối tƣợng Ngô Lạc Lần xi OTB x SD RSD% R% xi 9.1 7.2 9.0 7.1 8.8 8.9 8.5 6.7 9.2 7.0 8.9 3,8 8.6 3,6 7.5 7.9 7.8 4,1 8.0 4,3 8.8 0,2 9,1 7,8 0,3 7,6 86 84 6.8 6.5 3,7 4,2 x SD RSD% R% 6.8 0,2 11 77 79 0,3 7,2 Kết luận: Kết cho thấy phương pháp có độ thu hồi tốt hai mẫu khảo sát Độ thu hồi thu khoảng 77-86% khoảng nồng độ 5-10 ppb Độ lặp lại cho giá trị RSD khoảng 7.2 – 11% ([...]... vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định đúng đắn chất cần phân tích 1.2.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ Phương pháp có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới... loại ngũ cốc bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)  Xây dựng quy trình tách chiết chất phân tích  Thẩm định phương pháp:  Độ đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp  Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ  Khoảng tuyến tính  Độ chính xác của phương pháp (độ đúng và độ chụm)  Áp dụng phương pháp để xác định Ochratoxins trong các loại mẫu thực phẩm, rượu lên men 2.2 Phƣơng pháp nghiên... có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được R Vatinnoa, D Vuckovica, C.G Zamboninb, J Pawliszyna [28] đã tiến hành xác định Ochratoxin trong 96 mẫu nước tiểu bằng phương pháp vi chiết pha rắn kết hợp với sắc ký lỏng khối phổ Mẫu được chỉnh pH về 3 bằng đệm photphatsalin 0,5 M trước khi vi chiết pha rắn Chương trình sắc ký lỏng được... trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để nghiên cứu xác định các loại độc tố ochratoxins có trong sản phẩm rượu và các loại ngũ cốc và các sản phẩm làm từ ngũ cốc 1.3 Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây: Cấu trúc của hệ thống LC-MS/MS Hình 1.2: Mô hình hệ thống LC-MS/MS 1.3.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký là quá trình tách... tích khối Ion hóa 13 Detector/ Lƣu giữ số liệu Hình 1.3: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7 µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC)  Sắc ký pha... dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp 2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 2.3.1.1 Thiết bị  Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC-MS/MS của Shimadzu bao gồm: + Máy sắc ký lỏng của Shimadzu Model 20 AD-UFLC + Máy khối phổ  Nước sản xuất: Mỹ  Model: AB sciex Triplequard 5500  Cột sắc ký: Water-... trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp Một số loại detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn, detector mảng diot (DAD), detector khối phổ (MS) 1.3.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân... Ban Nha) Phương pháp cho độ thu hồi 80-110% tại mức thêm chuẩn 0,025 và 0,1 ng/g, RSD nhỏ hơn 15% Nhóm tác giả L.C Huang đã nghiên cứu xác định một nhóm các chất aflatoxin M1, ochratoxin A, zearalanone và α-zearalenol trong sữa bằng phương pháp UHPLC-MS/MS Trong nghiên cứu này, độ nhạy và độ nhanh của phương pháp được đặc biệt nghiên cứu trong chế độ UHPLC-ESI-MS/MS Mẫu sữa được làm sạch bằng cột chiết... thụ và giải hấp thụ là 1 giờ 15 phút Phương pháp có ưu điểm tính tự động hóa cao, ít độc hại cho người phân tích Tại Viện nghiên cứu thuốc trừ sâu và nước, Đại học Jaume, Tây Ban Nha, nhóm tác giả Eduardo Beltrán [20] đã nghiên cứu xác định một số mycotoxin trong thực phẩm và sữa bằng sắc ký lỏng khối phổ Mẫu được chiết bởi acetonitril: nước (80:20), làm sạch mẫu bằng cột ái lực miễn dịch (Aflaochra... giới hạn định lượng ở trong nước tiểu tương ứng là 0,3 và 0,7 ng/ml Cột sắc ký sử 11 dụng là cột C18 – Waters, tốc độ dòng 0,5 ml/phút Pha động: 90% kênh A (nướu, acetonitril, aceticacid 90:10:0,1) trong 1 phút, tăng tỷ lệ 60% A/40%B (acetonitril và acetic acid 100:0,1) trong 6 phút, đưa về 90% B ở giây tiếp theo và giữ trong vòng 1 phút Tổng thời gian chậy sắc ký là 8 phút Detector khối phổ thực hiện ... 1.2.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, đặc biệt phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ kĩ thuật phát triển năm gần Về bản, phương pháp sắc ký lỏng sử dụng... định hàm lượng Ochratoxin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)” Mục tiêu thực đề tài nghiên cứu là: Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Ochratoxin thực phẩm bao gồm:... Khảo sát điều kiện máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ - Khảo sát điều kiện xử lý mẫu - Thẩm định phương pháp xây dựng Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên