Thông tin tài liệu
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL TRONG THỊT GÀ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ GVHD: Sinh viên thực hiện: Nội dung I II III IV V Đặt vấn đề Đối tượng phương pháp thực Đối tượng Phương pháp thực 2.1 Dấu hiệu nhận biết Chloramphenicol 2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất 2.3 Điều kiện qui trình q trình thực 2.3.1 Điều kiện qui trình 2.3.2 Quá trình thực 2.4 Q trình phân tích máy Tính tốn kết Lập đường chuẩn Độ xác Hiệu xuất thu hồi phương pháp Kết luận Tài liệu tham khảo I II Đặt vấn đề Sự phát triển nhanh chóng ổn định ngành chăn nuôi nước ta chịu ảnh hưởng lớn kháng sinh Kháng sinh dùng khơng để phịng bệnh, trị bệnh mà cịn nhằm mục đích kích thích sinh trưởng dùng liều thấp (nghiên cứu McEvoy, 2002; Phạm Kim Đăng cs, 2012) Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp (đối với chất cấm dùng chăn nuôi) sai nguyên tắc sử dụng hợp chất kháng sinh chăn nuôi gà công nghiệp gây tượng tồn dư kháng sinh Tồn dư kháng sinh tác động trực tiếp đến lồi vật ni (giảm đề kháng, lờn thuốc ), gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, người trực tiếp sử dụng sản phẩm kháng sinh Do có phổ kháng khuẩn rộng khả phân bố tốt vào mô thể nên Chloramphenicol (CAP) dùng phổ biến thú y trước Tuy nhiên, từ phát độc tính CAP lên quan tạo máu (thi ếu máu cấp, suy tủy, tử vong), vào năm 2009 Bộ Nông Nghiệp Phát tri ển nông thôn thông tư cấm sử dụng Chloramphenicol chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy hải sản Nhưng số nghiên cứu (đề tài khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi dư lượng kháng sinh thịt quầy thịt gà Tp Hồ Chí Minh PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY, trường ĐH Nông Lâm) rằng: Chloramphenicol dùng trái phép chăn nuôi gà công nghiệp Phương Pháp sắc kí lỏng khối phổ nghiên cứu áp dụng với kháng sinh chloramphenicol, với nhiệm vụ phát hi ện lượng kháng sinh Chloramphenicol (hoặc chất cấm dùng chăn nuôi nông nghiệp khác) mẫu sinh học mức độ vết siêu vết Phương pháp phương pháp thẩm định cuối chất khó phát với độ xác độ tin cậy cao Đối tượng phương pháp thực Đối tượng Các mẫu thịt gà bán quầy thịt địa bàn Quận Thủ Đức Các đối tượng phân tích thành phần để lựa chọn mẫu đại diện để chạy sắc ký Phương pháp thực 2.1 Dấu hiệu nhận biết Chloramphenicol a Lý hóa tính CAP CAP có dạng tinh thể khơng màu, lấp lánh, vị đắng, pH = 2-9, tan nhiều lipid dung môi hưu alcohol, tan nước CAP bền, khơng bị phá hủy nhiệt độ nước sôi miễn pH < b Ảnh hưởng CAP người CAP ảnh hưởng trực tiếp lên tủy xương với triệu chứng đặc trưng suy tủy không hồi phục (thiếu máu bất sản) Tỉ lệ tử vong người 1/25 000 – 1/60 000 trường hợp Do CAP không tồn dư thực phẩm (MRL = 0) 2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất Nguyên vật liệu hóa chất ' Kháng sinh chuẩn CAP pha methanol nồng độ 1µg/ml bảo quản tủ lạnh - 4°C ' Hóa chất: Etylacetat; aminoacetat; n- hexan; acid acetid, aceton acetonitril ' Nước cất Thiết bị ' Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS ' loại cột chiết pha rắn dùng cho khảo sát gồm C18 Floresil ' Máy lắc vortex, máy quay bình quay ' Các loại ống đong, ống nghiệm, pipet micropipet 2.3 Điều kiện qui trình trình thực 2.3.1 Điều kiện qui trình Bảng Điều kiện chạy nguồn hóa ESI Thế phun điện tử 4,0 kV Nhiệt độ đầu phun (IS) 130°C Khí (CUR) 30 Khí va chạm (CAD) Nguồn khí ion (GS1) 20 Nguồn khí ion (GS2) 10 Thế phân nhóm (DP) -100 Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) – 10 Thông số khảo sát Khoảng khảo sát Bước quét (step) Số mảnh quét với chất Thế phân nhóm (DP) Năng lượng va chạm (CE) Năng lượng CXP mảnh cho tín hiệu cao Từ -150 đến -1 (V) Từ 130 đến -5 (V) Từ -55 đến (V) (V) (V) (V) Bảng Điều kiện bắn phá phân mảnh ion Chất phân tích CAP (323,13) Mảnh khẳng định 257,192 Mảnh định lượng 152,221 Bảng Các thông số tối ưu cho chạy khối phổ Chloramphenicol Chú thích: DP: Thế phân nhóm (Declustering Potential), CE: Năng l ượng va ch ạm (Collision Energy) CXP: Năng lượng CXP (Collision Cell Exit Potential) 2.3.2 Q trình thực a Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu Đầu tiên đối tượng nghiên cứu phân tích thành phần để lựa chọn mẫu cho phương pháp khảo sát Sau chọn mẫu thích hợp tiến hành tách chiết, làm giàu tinh mẫu Sau lựa chọn dung môi khảo sát mẫu đồng nhất, tiến hành cân 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml, thêm chất chuẩn, sau thêm 20ml dung môi, lắc vortex khoảng phút Tiếp theo đem ly tâm 000 v/phút phút, gạn thu dịch chiết sang ống ly tâm khác Chiết lặp lại lần với 10ml dung môi Gộp dịch chiết lần cho vào bình quay 100ml Cơ quay tới cạn 40oC Sau hịa tan lại dung dịch CH3COONH4 4% Do dịch chiết từ nên mẫu sinh học thường chứa nhiều tạp chất lipid, acid béo, amin, rượu… nên thường nghiên cứu thường chọn chiết pha rắn để loại bỏ tạp chất để làm tinh dịch chiết Tuy nhiên, đối tượng mẫu khảo sát thường có hàm lượng lipid sau bước làm giàu sơ cao nên trước nạp mẫu qua cột chiết pha rắn, 10ml n- hexan dùng để loại bỏ chất béo chiết, lặp lại việc lần vớidung dịch thu Sơ đồ trình xử lý mẫu b Tối ưu hóa điều kiện phân tích CAP máy LC – MS/MS Kháng sinh nhóm phenicol có khối lượng phân tử độ phân cực trung bình Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng pipet 500µl bơm chuẩn CAP 10ng/ml vào detector để khảo sát Tối ưu hóa ion mẹ chỉnh tối ưu điều kiện chạy ESI bảng 2.4 Phổ khối CAP hệ LC/MS nghiên cứu c Tối ưu hóa điều kiện sắc ký Lựa chọn cột phân tách CAP có độ phân cực trung bình, nên lựa chọn an tồn cho hệ pha động máy khối phổ dung môi phân cực vừa methanol, acetonitril, nước, acid formic (< 1%), amoniacetat (< 1%) Lựa chọn dung môi thường tuân theo tính kinh tế tính phù hợp với phịng thí nghiệm Hệ pha động phương pháp gradient Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động chương trình khơng ảnh hưởng tới q trình tách chất mà cịn ảnh hưởng tới q trình ion hóa tín hiệu chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá chế độ ion âm, trình ion hóa tốt có thêm chất acid acetic, acid formic…Trong nghiên cứu dùng dung dịch chuẩn CAP nồng độ 2ng/ml d Thẩm định phương pháp phân tích thơng qua việc phân tích mẫu thêm chuẩn thử nghiệm phân tích mẫu thực tế o Phân tích mẫu trắng Mẫu trắng: gà ni thức ăn tự nhiên không sử dụng kháng sinh thời gian ni) Tiến hành phân tích lặp lại lần thu độ thu hồi cao 80% mức nồng độ 0,5; ng/g o Thử nghiệm phân tích mẫu thực tế Mẫu thực tế: lấy quầy thịt gà chợ địa bàn quận Thủ Đức Quá trình phân tích máy Nạp mẫu Hóa khí mẫu Bơm hút Ion hóa Phân tích ion theo số khối Detector Xửả.lý số liệu Tính tốn kết qu Lập đường chuẩn Phương pháp LC-MS/MS có khoảng tuyến tính rõ rệt (tất hệ số hồi qui Sơ đồ trình phân tích máy tuyến tính dao động khoảng từ 0,99 đến 1) Cụ th ể CAP có khoảng tuyến tính từ 0,5 đến ng/g với hệ số hồi qui tuyến tính 0,9994 Khoảng tuyến tính khảo sát 0,5 – Phương trình đường chuẩn R² LOD (ng/g) LOQ (ng/g) Y = 6x10¯⁵x – 0,0256 0,9994 0,009 0,03 đường chuẩn CAP 2.5 2.5 y (ng/g) III 1.5 0.5 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 x (cm²) Độ xác Giới hạn phát phương pháp (LOD) CAP = 0,009ng/g Chỉ số LOD cho phép phát CAP độ nhạy cao, khoảng 0,009 ppb Giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) CAP = 0,03ng/g Kết phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích dư lượng kháng sinh CAP thịt gà 0.45 IV Hiệu xuất thu hồi phương pháp Để đánh giá hiệu phương pháp, nghiên cứu xác định độ thu hồi phương pháp với mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn ba mức nồng độ quan tâm (xung quanh nồng độ thấp khoảng tuyến tính) Kết cho thấy, phương pháp đáp ứng tốt với CAP nghiên cứu, độ thu hồi đạt 83% Kết luận Kết nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phát chất cấm CAP thịt gà: ' Độ thu hồi đạt mẫu tương đối cao (>80%) ' Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) lần đo tương đối nhỏ (
Ngày đăng: 08/04/2021, 19:49
Xem thêm:
