BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định chất bảo quản natri benzoat bằng phương pháp HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y XÁC ĐỊNH CHẤT BẢO QUẢN NATRI BENZOAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC GVHD: DANH SÁCH NHÓM: I Đặt vấn đề: Vấn đề chất phụ gia thực phẩm mối quan tâm nhiều người Nhất thực phẩm đưa vào sản xuất quy mơ cơng nghiệp người thấy tầm quan trọng phụ gia, với mục đích đáp ứng nhu cầu cơng nghệ q trình sản xuất, vận chuyển, đóng gói, bảo quản, tăng giá trị dinh dưỡng thực phẩm Các phụ gia sử dụng liều lượng thời gian dài gây ngộ độc hóa học trẻ em, nhạy cảm số người sử dụng mức an toàn Hiện nay, 2500 phụ gia sử dụng công nghệ thực phẩm với nhiều mục đích khác nhau, đó, việc sử dụng phụ gia chống vi sinh vật Natri Benzoat sử dụng phổ biến Một nguyên nhân việc gia tăng sử dụng phụ gia thay đổi sản xuất tiêu thụ sản phẩm thực phẩm Ngày nay, người tiêu dùng mong muốn tất loại thực phẩm có quanh năm, khơng bị nhiễm độc có thời hạn sử dụng hợp lý Do phụ gia chống vi sinh vật có vai trò quan trọng việc bảo quản thực phẩm, có cải tiến hệ thống đóng gói chế biến để bảo vệ thực phẩm mà khơng cần dùng đến hóa chất Để định lượng hoạt chất trên, Thường qui kỹ thuật (4021/2003/QĐ-BYT) Qui chuẩn Việt Nam (QCVN 4-12: 2010/BYT) Bộ Y tế xác định nguyên liệu hóa chất phương pháp chuẩn độ môi trường khan Trong mẫu phức tạp thực phẩm, phương pháp áp dụng Cho đến nay, việc xác định hàm lượng chất bảo quản sản phẩm thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) chưa có tài liệu đề cập đến Trong báo này, chúng tơi giới thiệu quy trình xác định chất phụ gia Natri Benzoate số sản phẩm thực phẩm phương pháp HPLC nghiên cứu áp dụng số mẫu thực phẩm Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm TP HCM cho kết tốt II Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng: Khảo sát hàm lượng Natri benzoat mẫu nước giải khát TP HCM 1.1 Tính chất lí hố Natri benzoat: Natri benzoat có cơng thức hố học NaC 6H5CO2 Nó muối natri axit benzoic tồn dạng hồ tan nước Nó sản xuất phản ứng natri hydroxit axit benzoic Natri benzoate Danh IUPAC Tên khác Natri benzoate pháp Natri benzoate E211, benzoat natri Thuộc tính Cơng thức NaC6H5CO2 phân tử Phân tử gam 144.11 g/mol Tỷ trọng Điểm chảy 1.497 g/cm3 nóng 300 °C Độ hịa tan tan nước Độ hịa tan tan etanol Độ axít (pKa) 8.0 Nguồn: vi.wikipedia.org 1.2 Ảnh hưởng Natri benzoat tới sức khoẻ Thúc đẩy ung thư tiêu diệt tế bào khỏe mạnh Nó có khả ngăn cản phần tử ADN, gây bệnh Parkinson xơ gan, gây thiệt hại cho ty thể – nguồn cung cấp lượng cho tế bào Ty thể hấp thụ oxi cung cấp lượng, chúng bệnh tật công thể bạn Một số nghiên cứu Natri benzoat với phẩm màu thực phẩm nhân tạo làm tăng hành vi hiếu động số trẻ III Nội dung phương pháp nghiên cứu Dụng cụ hóa chất: 1.1 Dụng cụ: - Cân phân tích AUW220D ( 0,01 mg) hãng Shimadzu, Nhật Bản - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Series 20A hãng Shimadzu, Nhật Bản - Cột sắc ký pha đảo C18; màng lọc 0,45 µm - Các thiết bị khác như, tủ sấy, máy lắc, máy cất nước hai lần, thiết bị lọc nước siêu - Các dụng cụ thủy tinh bình định mức loại, pipet vạch pipet bầu loại, cốc mỏ - Micropipet loại (0,5-10 L, 10-100 mL, 100-1000 mL,…) - Syranh lọc mẫu; bình định mức loại, cốc có mỏ loại 1.2 Hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao Hình: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp HPLC a Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có đường dung mơi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng bình chứa dung môi lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn tổng tỉ lệ đường 100% Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, sử dụng đường dung môi lúc mà thường sử dụng đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản giúp ổn định trình rửa giải Lưu ý: Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC Tất hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu pha hệ đệm phải hóa chất tích khiết dùng cho phân tích Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên peak tạp trình phân tích b Bộ khử khí Degases Mục đích sử dụng khử khí nhằm lọai trừ bọt nhỏ cịn sót lại dung mơi pha động, tránh xảy số tượng có sau:  Tỷ lệ pha động đường dung môi không làm cho thời gian lưu peak thay đổi  Trong trường hợp bọt nhiều, khử khí khơng thể lọai trừ hết bơm cao áp khơng hút dung mơi, ảnh hưởng đến áp suất hoạt động hệ thống HPLC Trong trường hợp dẫn đến sai kết phân tích c Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt áp suất cao khỏang 250-600bar tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút d Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đồi Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (autosample) e Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 525cm đường kính 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,… Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột kiểu sắc ký f Đầu dò Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dị phù hợp Tín hiệu đầu dị thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên sở đó, người ta sản xuất lọai đầu dị sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát chất hấp thụ quang Đây lọai đầu dị thơng dụng - Đầu dò hùynh quang (RF) để phát chất hữu chứa huỳnh quang tự nhiên dẫn suất có huỳnh quang - Đầu dị DAD (Detector Diod Array) có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thụ cực đại chất - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng loại đường - Đầu dị điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… g Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dò phát Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thơng số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý thông số liên quan đến kết phân tich h In liệu Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển 1.3 Hóa chất: Tất hóa chất loại tinh khiết phân tích - Chất chuẩn Natri Benzoat , Acid phosphoric đậm đặc, dung dịch NaOH 0,1N pha từ ống chuẩn, dung dịch H2SO4 10%, dung dịch Phenolphtalein 1% pha ethanol 600 - Dung dịch kalifericyanid K3Fe(CN)6: Hoà tan 10,6g K3Fe(CN)6 50ml nước, lắc cho tan hoàn toàn, thêm nước vừa đủ 100ml - Dung dịch Dikali hydrophosphat K 2HPO4 0,02M: Hòa tan 3,484g K2HPO4 100ml nước 1.3 Dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: Cân 0,1000g chuẩn loại, thêm 2-3ml methanol, lắc cho tan hoàn toàn, thêm nước cất vừa đủ 100 ml - Từ dung dịch chuẩn gốc, pha chuẩn làm việc có nồng độ ppm ;5 ppm; 10 ppm; 20 ppm ; 50 ppm ; 100 ppm ; 200 ppm Điều kiện qui trình trình thực 2.1 Điều kiện quy trình Pha động: hỗn hợp dikali hydrophosphat : methanol [70:30]; chỉnh pH = 5,0 axit H3PO4 Lọc qua màng 0,45 µm, lắc siêu âm đuổi bọt khí - Cột pha đảo RP18 (150 ì 4,6 mm ; 3àm) - Th tớch bơm mẫu 20µl - Tốc độ dịng 1,5 ml/phút - Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng - Detector : DAD bước sóng λ = 230 nm 2.2 Qúa trình thực Hút xác 20-50ml mẫu cho vào cốc có mỏ 250 ml, thêm 25ml dung dịch dung dịch NaOH 1N, thủy phân bếp cách thủy nhiệt độ 70 0C 30 phút Làm nguội nhiệt độ phịng, chuyển vào bình định mức 100ml, trung hịa mẫu dung dịch H2SO4 10% để dung dịch có pH = 8,5 Thêm 2ml dung dịch kalifericyanid, lắc loại tạp Dùng methanol tráng rửa cốc cho vào bình định mức, thêm 10ml dung dịch K2HPO4 0,2M, lắc kỹ, định mức methanol vừa đủ 100ml Lọc qua màng lọc 0,45µm trước bơm vào máy HPLC → Kết tính theo cơng thức: C(mg/l) = Cx n/R 20 -50ml mẫu lỏng + 25 ml NaOH 0,1N Cách thủy t0 = 700 c 30 phút + H2SO4 10% → pH = 8,5 + ml ddịch fericyamid + 10 ml K2HPO4 0,2 M Định mức vừa đủ 100ml lọc qua 0,45µm HPLC IV Tính tốn kết Khảo sát độ tuyến tính Khảo sát dung dịch chuẩn Natri Benzoat với nồng độ khác Kết thực nghiệm thể bảng sau Sắc kí đồ Hình: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Natri benzoat mẫu nước có chứa Natri benzoat Khảo sát độ lặp lại Tiến hành khảo sát độ lặp lại phương pháp mẫu nước giải khát có chất Natri benzoat với điều với sắc ký lựa chọn Kết khảo sát trình bày bảng sau Nhận xét: Phương pháp định lượng xây dựng có độ lặp lại tốt, có RSD < 2% Khảo sát độ Độ xác định mẫu nước giải khát, với chương trình sắc ký chon Tiến hành thêm xác lượng dung dịch chuẩn Natri Benzoat vào mẫu thử với tỷ lệ thêm 50(µg/ml); 100(µg/ml); 150(µg/ml) Sau định lượng chất chuẩn tìm lại so với lượng thêm vào (với phép thử song song) Kết khảo sát độ phương pháp trình bày bảng Kết khảo sát độ mẫu nước giải khát (n= 5) Kết khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Giới hạn phát giới hạn định lượng xác định theo “qui tắc 3σ” Từ khoảng tuyến tính xây dựng với phương trình đường chuẩn tương ứng hoạt chất Natri Benzoat ta tính xác định LOD LOQ phương pháp trình bày bảng Kết xác định LOD LOQ phương pháp phân tích HPLC V Kết luận  Phương pháp định lượng hoạt chất Natri Benzoat số sản phẩm thực phẩm phương pháp HPLC xây dựng thẩm định Các kết thực nghiệm thu cho thấy phương pháp có giới hạn định lượng rộng, độ tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ diện tích peak, độ lặp lại độ thu hồi tốt  So sánh với nồng độ Natri Benzoat cho phép thực phẩm với liều lượng 647–825 mg/kg khối lượng thể ngày, hàm lượng Natri benzoat mẫu nằm mức cho phép VI Tài liệu tham khảo  AOAC (2005), Official methods of analysis of AOAC international  Bộ Y tế, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm (2005), “Các văn quy phạm pháp luật vệ sinh an toàn thực phẩm”, Nhà xuất Hà nội, tập II, tr 186-192  Bộ Y tế, QCVN 4-2010/BYT “Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia phụ gia thực phẩm – Chất bảo quản”, Nhà xuất Hà nội, phụ lục 2,5  Bộ Y tế (1998), “Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh lương thực thực phẩm” QĐ số 867/1998/QĐ-BYT Bộ trưởng Bộ Y tế ngày 04 tháng 04 năm 1998 ... tính xác định LOD LOQ phương pháp trình bày bảng Kết xác định LOD LOQ phương pháp phân tích HPLC V Kết luận  Phương pháp định lượng hoạt chất Natri Benzoat số sản phẩm thực phẩm phương pháp HPLC. .. tế xác định nguyên liệu hóa chất phương pháp chuẩn độ mơi trường khan Trong mẫu phức tạp thực phẩm, phương pháp áp dụng Cho đến nay, việc xác định hàm lượng chất bảo quản sản phẩm thực phẩm phương. .. sản xuất phản ứng natri hydroxit axit benzoic Natri benzoate Danh IUPAC Tên khác Natri benzoate pháp Natri benzoate E211, benzoat natri Thuộc tính Cơng thức NaC6H5CO2 phân tử Phân tử gam 144.11