Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

20 Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp 33 Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp

LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I

HÀ NỘI 2015

Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa

Thời gian thực hiện: 20/01 – 20/5/2015

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ quý báu từ các thầy cô giáo trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị đồng nghiệp của Trung tâm kiểm nghiệm Thanh Hóa

Nhân dịp này tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn

Thị Kiều Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báu

trong quá trình thực hiện luận văn cũng như trong quá trình học tập, công tác

Tôi trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học này

Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng tập thể cán

bộ Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi trân thành cảm ơn và bày tỏ tình cảm sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015

Học viên Trịnh Lê Anh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt

1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU 18

3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần công thức mẫu Placebo số 1 19

Bảng 2.2 Thành phần công thức mẫu Placebo số 2 19

Bảng 2.3 Thành phần công thức mẫu Placebo số 3 19

Bảng 2.4 Thành phần công thức mẫu Placebo số 4 20

Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp 33

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp 35

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 38

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng

Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất trong điều

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid 4

Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ 9

Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI 11

Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba 12

Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76) tạo ra

Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76) 26

Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh glycyrrhizin (m/z = 840)

Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840) 27

Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein (m/z = 121) tạo

Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121) 28

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng 32

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng 32

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng 33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) chứa ba thành phần hoạt chất bao gồm: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein 20mg, được dùng trong điều trị rối loạn chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm gan C; hỗ trợ điều trị eczema [14], [15] Thuốc có trong danh mục thuốc thanh toán bảo hiểm y tế và danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam vì vậy thuốc được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị nhất là điều trị nội trú, bảo vệ gan trước sự tác động có hại của các loại thuốc khác

Tại Việt Nam hiện nay đang tiến hành làm hồ sơ xin cấp phép lưu hành [14] Tại Nhật Bản thuốc có thành phần tương tự được sử dụng rộng rãi trong điều trị [15]

Để xây dựng tiêu chuẩn của thuốc, một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất là phải xây dựng được phương pháp định tính và định lượng được các hoạt chất đảm bảo tính đặc hiệu, ổn định và chính xác [5], [6] Đối với hai thành phần acid amin L-Cystein, Glycin trong chế phẩm thuốc Compound Glycyrrhizin Injection - là những hoạt chất không hấp thụ UV nên không thể định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS [12], [18], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector thông thường như: UV-VIS; PDA cũng không định lượng được các thành phần hoạt chất này Các hoạt chất này có thể phân tích được dựa vào phản ứng dẫn xuất nhóm amin với thuốc thử thích hợp và phát hiện bằng HPLC với detector huỳnh quang [17] Quá trình dẫn xuất được thực hiện trước cột hoặc sau cột khi phân tích bằng sắc ký, nhưng kết quả thường kém ổn định

và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là phương pháp phân tích hiện đại, có tính đặc hiệu và lặp lại cao, có thể phân tích trực tiếp đồng thời các chất trong hỗn hợp ngay

cả khi các chất phân tích không tách rời nhau khi qua hệ thống sắc ký Do

lưu hành trên thị trường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau:

1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích để định tính, định lượng đồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein bằng kỹ thuật LC-MS/MS

2 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein trong chế phẩm thuốc CGI, từ đó hoàn thiện qui trình định tính, định lượng các thành phần hoạt chất trong chế phẩm thuốc CGI bằng LC-MS/MS

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION (CGI)

1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI

+ Nguồn gốc:

Thuốc tiêm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) được sản xuất bởi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No.7 Rongchang East Street, BDA, Beijing, China

+ Công thức bào chế 20 ml dung dịch tiêm CGI:

Monoamoni Glycyrrhizinate tương đương Acid Glycyrrhizin 40 mg

O

O

HO HO HOOC O

4

- Công thức phân tử: C42H62O16;

- Trọng lượng phân tử: 839,97 g/mol;

- Tên khoa học: Acid

- Công thức cấu tạo: H2N-CH2-COOH;

- Trọng lượng phân tử: 75,07 g/mol;

- Tên khoa học: Acid aminoacetic;

NH2HS

Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid

- Công thức phân tử: C2H5NO2;

- Trọng lượng phân tử: 157,62 g/mol;

- Tên khoa học: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid;

5

- Bột kết tinh màu trắng;

- Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường kiềm, tan trong ethanol, không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực [4], [13], [18]

1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định thuốc

tiêm CGI

Dược lực học [15]

+ Tác dụng chống viêm: Ức chế các enzym chuyển hóa acid arachidonic: Glycyrrhizin có thể liên kết với phospholipase A2 (enzym hoạt hóa cho sự chuyển hóa acid arachidonic) và lipoxygenase (chất gây ảnh hưởng đến acid arachidonic và là nguyên nhân sản xuất trung gian viêm), thông qua đó ức chế chọn lọc sự phosphoryl hóa và gây ức chế sự hoạt hóa các enzym

+ Tác dụng ức chế sự tổn thương tế bào gan: Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gan chuột trong ống nghiệm, glycyrrhizin ức chế sự tổn thương tế bào gan do tetracloromethan gây ra

+ Ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus: Ở những chuột thí nghiệm bị nhiễm viêm gan virus, điều trị với glycyrrhizin có thể kéo dài thêm tuổi thọ Ở thỏ thí nghiệm bị nhiễm virus bệnh đậu mùa, glycyrrhizin

có thể ức chế sự phát triển của virus Trong các thử nghiệm in-vitro khác,

glycyrrhizin cũng thể hiện tác dụng ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus Glycin và cystein gây ức chế hoặc giảm chứng tăng aldosteron giả do các bất thường trao đổi điện giải trong quá trình điều trị dài ngày với glycyrrhizin

Dược động học [15]

+ Hấp thu: Đối với người khỏe mạnh, nồng độ thuốc trong máu giảm đáng kể sau 10 giờ tiêm 40 ml dung dịch Compound Glycyrrhizin Injection (chứa 80 mg glycyrrhizin) Sau đó nồng độ thuốc giảm dần dần Acid glycyrrhizic, sản phẩm thủy phân của glycyrrhizin, xuất hiện sau 6 giờ tiêm thuốc, đạt nồng độ đỉnh sau 24 giờ và bị thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể sau

48 giờ

6

+ Thải trừ qua nước tiểu: Đối với người khỏe mạnh sau khi tiêm glycyrrhizin, nồng độ thuốc trong nước tiểu giảm dần Tốc độ thải trừ là 1,2% liều sau 27 giờ tiêm thuốc Acid glycyrrhizic bắt đầu xuất hiện sau 6 giờ và đạt nồng độ đỉnh sau 22 -27 giờ tiêm thuốc

+ Bệnh nhân cao tuổi: Bệnh nhân cao tuổi thường có khuynh hướng bị

hạ kali máu Do đó, việc sử dụng thuốc của bệnh nhân cần được theo dõi chặt chẽ

+ Sử dụng cho phụ nữ có thai và cho con bú: Chưa có nghiên cứu đầy

đủ và được kiểm soát tốt trên bệnh nhân nhi Không dùng cho nhóm đối tượng này

Chống chỉ định [15]

+ Quá mẫn cảm với bất kỳ thành phần nào của thuốc

+ Tăng aldosteron, đau cơ hoặc hạ kali máu

+ Phụ nữ có thai hoặc nuôi con bú

7

1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI

Trên thế giới đã có nhiều tài liệu công bố về các phương pháp định tính, định lượng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khác nhau bằng các kỹ thuật: sắc ký lỏng [11], [13], [16]; chuẩn độ thể tích [12], [13], [18]; sắc ký lỏng khối phổ [19], [17], [22]

Tuy thuốc CGI đã được sản xuất tại Nhật Bản, Trung Quốc và sử dụng tại nhiều nơi trên thế giới, xong chưa có quốc gia nào đưa chuyên luận thuốc tiêm có chứa các thành phần nói trên vào Dược Điển của mình Cũng chưa tìm thấy tài liệu công bố phương pháp định lượng đồng thời ba hoạt chất nói trên

Đối với thành phần Glycin dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ môi trường khan, trong

đó chất phân tích được hòa tan trong acid actetic băng, hoặc hỗn hợp acid acetic băng và acid formic rồi chuẩn độ bằng acid percloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể hoặc xác định điểm tương đương bằng đo điện thế [13]; [16]; [18] Với phương pháp này dựa vào tính kiềm của nhóm -NH2 trong phân

tử hoạt chất, phương pháp này sẽ bị hạn chế nếu có mặt của nước (là một dung môi khá phổ biến của thuốc tiêm), làm cho chất phân tích vừa thể hiện tính kiềm, vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trở nên trung tính, không chuẩn độ được

Chuyên luận thuốc tiêm Glycin (Glycine Irrigation Solution) trong một số dược điển của các nước tiên tiến đã sử dụng phương pháp trung hòa [13]; [16]; [18] Nguyên tắc của phương pháp này là trong môi trường nước các acid amin vừa thể hiện tính base vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trung tính Khi có mặt formol các nhóm –NH2 bị khóa lại nên tính acid trội lên có thể định lượng được bằng một dung dịch base chuẩn Cả hai phương pháp định lượng hóa học dựa vào tính kiềm của nhóm –NH2; hoặc tính acid của nhóm –COOH đều không đặc hiệu Phương pháp có giới hạn phát hiện cũng như giới hạn định lượng cao Khi trong công thức có thêm các thành phần tá dược có tác dụng đệm pH, nền mẫu phức tạp phương pháp sẽ gặp sai số hoặc không tiến hành được

8

Hoạt chất Cystein dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ oxy hóa khử, trong đó chất phân tích được hòa tan trong nước rồi chuẩn độ bằng dung dịch iod 0,1N phương pháp thừa trừ hoặc chuẩn độ trực tiếp với chỉ thị hồ tinh bột [13]; [16]; [18] Phương pháp này dựa vào tính khử của nhóm -SH trong phân tử hoạt chất, độ đặc hiệu kém và đôi khi bị ảnh hưởng của sự có mặt một số chất oxy hóa, như oxy hòa tan trong dung dịch

Chế phẩm thuốc chứa Cystein một số tài liệu đã sử dụng phương pháp oxy hóa khử với dung dịch chuẩn độ iod 0,1N chuẩn độ bằng phương pháp trực tiếp hay phương pháp thừa trừ; hoặc dùng dung dịch chuẩn độ là dung dịch bromid, phương pháp thừa trừ Các phương pháp trên đều có chung nhược điểm như độ nhạy kém, và không đặc hiệu với thành phần hoạt chất, phương pháp gặp phải sai số nhất định khi có một số tá dược chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm [12], [13], [18]

Một số tài liệu công bố phương pháp định lượng thành phần Cystein dạng nguyên liệu cũng như dạng chế phẩm bằng phương pháp HPLC detetor huỳnh quang; sử dụng bộ Kit tạo dẫn xuất huỳnh quang, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một số khó khăn như bộ Kit đắt tiền và không sẵn có [23]

L-Hoạt chất Glycyrrhizin trong chế phẩm thuốc tiêm CGI được xây dựng phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector

UV bước sóng 252 nm; hoặc detector PDA với bước sóng lấy pic là 252

nm [12]

Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R đã tiến hành định lượng acid Glycyrrhizin và các chất chuyển hóa của Acid Glycyrrhizin bằng phương pháp LC-MS/MS, ở khoảng nồng độ thấp khoảng 1-2 µg/ml [22]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một hệ thống có vai trò tách các chất dựa trên sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng [4]

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc một từ trường nhất định [18], [13]

1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba (Triple Quadrupole) hay còn gọi là khối phổ hai lần (MS/MS) được sử dụng nhiều trong công tác nghiên cứu, kiểm tra chất lượng thuốc, nhất là định lượng thuốc trong dịch sinh học, nghiên cứu tương đương sinh học, nghiên cứu định lượng các thuốc có thành phần phức tạp vì thiết bị có độ nhạy, độ chọn lọc cao

Trong các kiểu hình thành ion, kỹ thuật phun điện tử ESI (Electrospray Ionazition – ESI) được sử dụng nhiều hơn cả Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng kiểu ion hóa theo kỹ thuật ESI vì vậy trong phần tổng quan này chúng tôi sẽ trình bày về hệ Triple Quadrupole với nguồn Ion hóa kiểu ESI [18], [20]

Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ

10

Một máy khối phổ tứ cực chập ba gồm có các bộ phận chính sau:

Bộ phận nạp mẫu, đưa mẫu vào (Inlet);

Bộ nguồn ion hóa (ion source);

Bộ phận phân tích khối lần 1 (Q1): phân tích mảnh mẹ;

Bộ phận buồng va chạm (Collision cell);

Bộ phận phân tích khối lần 2 (Q2): phân tích mảnh con;

Bộ phận phát hiện ion (Detector);

Bộ phận ghi nhận và xử lý số liệu (data system)

Bộ phận nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu để chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760 mm Hg) vào buồng chân không (10-5 – 10-8 Torr) phải không được ngắt chân không của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) và bộ phận phát hiện (detector) nên bộ phận nạp mẫu của LC-MS có khác biệt:

Đầu ra của LC là dòng dung môi, nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòng dung môi vào phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và vận hành của thiết bị Mặt khác khi các ion có trong thành phần của dung môi dễ dàng va chạm với các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng

di chuyển và bị bơm chân không hút ra ngoài Do đó quá trình nạp mẫu từ

LC vào MS thường phải qua giao diện ghép nối phù hợp

Một ghép nối LC-MS cần có các đặc tính: cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC sang MS mà không phá hủy hay làm mất chất phân tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu

11

Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)

Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI

Trong ESI, tại đầu mao quản dưới ảnh hưởng của điện thế cao, sự hỗ trợ của khí mang và nhiệt độ mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích bề mặt Điều kiện nhiệt độ trong buồng phun cao làm cho dung môi trong các hạt sương bốc hơi khi đó mật độ điện tích tại các bề mặt hạt sương gia tăng đến một giá trị tới hạn và tiếp tục phân chia thành các hạt sương nhỏ hơn vì lực đẩy tĩnh điện lúc này lớn hơn sức căng bề mặt Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi từ đó đi vào bộ phận phân tích khối Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra ngoài bởi bơm chân không của thiết bị MS Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc và hội tụ bởi một điện thế, khi đi ra khỏi buồng ion hóa các phân tử có tốc độ đạt cao nhất rồi

đi vào phần phân tích khối là một dòng tập trung và đồng nhất

Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương Điều này phụ thuộc vào dung môi

sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch

Kỹ thuật ion hóa kiểu phun điện tử được áp dụng để phân tích những chất phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân tử lớn và các chất kém bền với nhiệt

12

Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập 3

Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba

Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực

Bộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1; Q2; Q3 Các tứ cực này được cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành hai cặp điện cực

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực Dưới tác động của dòng điện từ trường trong lòng ống điện cực, các ion di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào số khối ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại

Q1 sẽ tách các ion cần quan tâm bằng cách các ion có tỷ số m/z xác định đã lựa chọn sẽ đi thẳng đến tứ cực thứ 2 (Q2), những ion khác bị dập tắt do va chạm với thành của tứ cực ở các bản điện cực trái dấu

Tứ cực thứ 2 (Q2) còn gọi là buồng va chạm (Collision cell), bên trong chứa khí trơ (Argon) thường được thiết kế cong để tăng sự va chạm Các ion di chuyển từ tứ cực Q1 vào Q2 có vận tốc lớn va chạm với các

Q3

Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ

Full-scan: Khi thao tác với chế độ full-scan, đầu dò sẽ nhận được tất

cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ

Chế độ chọn lọc ion: (Selected Ion Monitoring SIM): Trong chế

độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện

có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring): Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai

lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò

để phát hiện

14

MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất

là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

1.2.3 Ứng dụng

Phương pháp phân tích khối phổ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa học và công nghệ như: thực phẩm – đồ uống; môi trường; độc chất học; tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật; dược phẩm …

Trong ngành dược một số ứng dụng cơ bản của kỹ thuật này:

Xác định khối lượng phân tử, khối lượng nguyên tử;

Xét đoán cấu trúc phân tử;

Kiểm nghiệm thuốc: định tính, định lượng, kiểm tra độ tinh khiết nguyên liệu, xác định tạp chất liên quan…;

Nghiên cứu phát triển hợp chất mới;

Phân tích thuốc trong dịch sinh học: nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…;

Một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh đã được trang bị thiết bị này như: Hà Nội, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Huế… nhưng chưa triển khai được nhièu để phục vụ công tác kiểm nghiệm

+ Nghiên cứu xác định tạp chất liên quan là lĩnh vực thế mạnh của thiết bị khi các tạp chất có nồng độ thấp, độ nhạy của các thiết bị HPLC thông thường không đủ đáp ứng, đặc biệt khi không có chất chuẩn, vẫn có thể định tính và xác định được dựa thư viện phổ của các chất đã được lưu giữ trong Detector khối phổ

+ Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng một số nhóm hoạt chất không hấp thụ quang như: bán thành phẩm kháng sinh nhóm

Trong LC-MS, tính đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu được trên sắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách và nhận diện rõ ràng Tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng tại vị trí các pic của chất phân tích không được vượt quá 2%

1.3.2 Độ tuyến tính

Độ tuyến tính của một qui trình phân tích diễn tả đáp ứng phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử

Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữa nồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được

Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định

Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + b

16

Thường tiến hành ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của phương pháp (80% - 100% và 120%), mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu hoặc 6 mẫu ở mức nồng độ 100%

Yêu cầu:

- Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%;

(Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết)

1.3.4 Độ chính xác

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau (mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra

Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và

độ tái lặp

Độ lặp lại

Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Độ lặp lại biểu thị độ chính xác trong định lượng

Thường được tiến hành trên 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3 lần (suy ra từ độ đúng) Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%

1.3.5 Độ vững

Đánh giá ảnh hưởng của các thay đổi nhỏ trong quy trình phân tích đến kết quả phân tích và độ ổn định của kết quả Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá độ ổn định theo thời gian của hoạt chất trong điều kiện phân tích

18

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU

- Dung môi hóa chất:

+ Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho sắc ký lỏng khối phổ LC/MS

+ Các dung môi hóa chất khác: cloroform; acid formic; acid acetic; acid tricloacetic, amoni acetat đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích (PA)

+ Cân phân tích Mettler Toledo MS240S (d=0,1 mg);

+ Các dụng cụ thủy tinh của phòng thí nghiệm cấp A;

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU

- Mẫu Placebo: là các mẫu tự tạo có chứa các thành phần của công thức thuốc và không chứa hoạt chất tương ứng Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 04 mẫu placebo Công thức các mẫu Placebo được trình bày cụ thể trong các bảng: 2.1, 2.2, 2.3, 2.4

- Mẫu chuẩn: là các dung dịch chuẩn được pha với nồng độ thích hợp trong pha động

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

Xác định các điều kiện khối phổ phân tích Glycyrrhizin; Glycin; Cystein

L-Sử dụng hệ thống khối phổ LC-MS/MS với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

+ Glycyrrhizin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng độ 2 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ 20µl/phút;

21

+ Glycin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng

độ 20 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ 20µl/phút;

+ Cystein được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng

độ 1 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ 20µl/phút

Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ với các nội dung sau:

Xác định các ion mẹ;

Tối ưu hóa các điều kiện ở nguồn ion hóa, bộ phận thấu kính hội tụ

để lượng ion mẹ đi vào hệ thống khối phổ nhiều nhất và ổn định nhất;

Xác định các mảnh ion con bền, ổn định và xác định năng lượng phân mảnh tối ưu nhất để lượng ion con tạo thành nhiều nhất và ổn định nhất

Khảo sát điều kiện sắc ký

Qua tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) và cột C18; C8 (100 x 2 mm; 1,8 µm); trên các hệ pha động gồm Acetonitril; dung dịch đệm amoniacetat 0,5 mM pH=3,0; dung dịch acid formic 0,01%; dung dịch acid tricloacetic 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau

Từ kết quả khảo sát có thể chọn hệ sắc ký thích hợp để tiến hành định lượng đồng thời 3 hoạt chất trong thuốc tiêm CGI trên hệ thống UPLC-MS/MS

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng như sau:

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Chuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừa

đủ 100 ml

22

Dung dịch chuẩn Cystein làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch

chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ: 1,078 µg/ml Lọc qua màng lọc 0,2 µm

Chuẩn gốc Monoamoni glycyrrhizinat: cân 0,0165 g chuẩn

Glycyrrhizin, pha trong nước vừa đủ 100 ml

Dung dịch chuẩn Monoamoni glycyrrhizinat làm việc: Hút chính

xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50

ml Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Glycyrhizin tương ứng: 2,0µg/ml Lọc qua màng lọc 0,2 µm

Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừa

đủ 100 ml

Dung dịch chuẩn Glycin làm việc: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch

chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml được dung dịch có nồng độ: 20,873µg/ml Lọc qua màng lọc 0,2 µm

Chuẩn bị mẫu thử:

Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml

Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml Lọc qua màng lọc 0,2 µm

Mẫu trắng: Có chứa các thành phần tá dược, không chứa các thành

phần chất phân tích Chuẩn bị như mẫu thử

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Asean [3]

Tính chọn lọc

Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 lần phân tích mẫu placebo tương ứng với từng thành phần của thuốc và thành phần chuẩn đơn lẻ Tiến hành ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng với mẫu chuẩn tại vị trí thơi gian lưu của chuẩn [3]

23

Khoảng nồng độ tuyến tính

Pha một dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp ban thành phần có nồng

độ khác nhau tương ứng 50%; 75%; 100%; 125%; 150% nồng độ định lượng Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ hoạt chất và diện tích píc đáp ứng [3]

Độ chính xác

- Độ lặp lại

Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng một ngày, cùng một kiểm nghiệm viên, cùng thiết bị Tính toán kết quả và đánh giá độ lặp lại của phương pháp [3]

- Độ chính xác trung gian

Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng ngày hôm sau, với kiểm nghiệm viên khác, sử dụng cột phân tích khác Tính toán kết quả và đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp bằng cách so sánh kết quả phân tích của hai kiểm nghiệm viên trong hai ngày [3]

Độ đúng

Độ đúng của phương pháp được tiến hành bằng cách phân tích mẫu

tự tạo bằng cách thêm chuẩn vào mẫu placebo số 1 ở ba khoảng nồng độ 80%; 100% và 120% nồng độ định lượng Mỗi nồng độ được tiến hành độc lập 03 mẫu Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, tính toán kết quả Độ đúng được đánh giá dựa trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượng được so với nồng độ thực của mẫu [3]

Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích

Mẫu thử được chuẩn bị trong phần thẩm định độ lặp lại của phương pháp được giữ lại bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ phân tích lại So

Các số liệu phân tích được xử lý thống kê bằng phần mềmMicrosoft Excel

Công thức tính toán hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm:

1000000

%1001000

25

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ

Pha các dung dịch chuẩn Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong hỗn hợp MeOH: nước (1:1) có nồng độ lần lượt như sau: 2 µg/ml; 20 µg/ml; 1 µg/ml

Tiêm các dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ cùng với dòng pha động sắc ký (tốc độ 0,3 ml/phút) Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ một lần, quét toàn dải (Full scan MS); xác định các mảnh ion mẹ (parent ion) của các chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein

Kết quả xác định được các ion mẹ có số khối như sau: Glycin m/z = 76,332 Da; Glycyrrhizin m/z = 840,363 Da; L-Cystein m/z = 121,832 Da; ứng với cấu trúc nhận một proton

Sau khi xác định được các mảnh ion mẹ, tiến hành tối ưu điều kiện nguồn ion hóa: điện thế đầu cone (Cone voltage); năng lượng bắn phá để tạo ra mảnh ion con cường độ tín hiệu cao và bền nhất

Từ kết quả thực nhiệm chúng tôi đã xác định được như sau:

Bảng 3.1 Các thông số khối phổ

Thành phần

Khối lượng phân

tử

Mảnh ion mẹ

Cone Voltage

Mảnh ion con

Năng lượng bắn phá

Chế

độ ion

29

Thực nghiệm cho thấy khi thực hiện chế độ Intellistart (chế độ tune

tự động) phân tử Glycin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da; Glycyrrhizin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 453,3 Da; L-Cystein

bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da là những mảnh ion con có cường độ tín hiệu cao, bền vững và tín hiệu ổn định nhất

3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành phần của thuốc tiêm CGI

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong pha động có nồng độ:

+ Pha động 1: Methanol : dung dịch acid formic 0,1% (90:10);

+ Pha động 2: Acetonitril : dung dịch acid formic 0,1% (90:10); + Pha động 3: Methanol : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10); + Pha động 4: Acetonitril : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10); + Pha động 5: Methanol : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0 (90 : 10);

+ Pha động 6: Acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0 (90 : 10);

Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy:

Đối với pha động số 1; số 2 có chứa thành phần acid formic thành phần Cystein không ổn định trong pha động, bị phân hủy

Đối với pha động số 3; số 4 có chứa thành phần acid tricloacetic ở chế độ khối phổ của thành phần Cystein đường nền đáp ứng rất cao 105 vì acid tricloacetic gây nhiễu đường nền ở mảnh con 58,9 Da; dẫn đến độ nhạy thấp không đáp ứng yêu cầu

mM pH=3,0

Tiến hành khảo sát sâu hơn bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần của pha động số 6 Nếu tăng thành phần acetonitril lên pic Glycyrrhizin sẽ ra sớm hơn, thời gian lưu của Glycin và Cystein gần như không ảnh hưởng Ở

tỷ lệ pha động acetonitril : dung dịch đệm amoni actetat 5mM pH=3,0 (35 : 65), các pic tách nhau rõ ràng, thời gian lưu của Glycyrrhizin 2,2 phút

Giữ nguyên thành phần pha động thay đổi tốc độ dòng, khi tốc độ dòng 0,2 ml/phút, pic Glycyrrhizin bị kéo chân; khi tốc độ dòng tăng lên 0,4 ml/phút pic Glycyrrhizin ra sớm hơn xong áp suất hệ thống tăng cao, vì vậy chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút là phù hợp và đáp ứng yêu cầu

Giữ nguyên tốc độ và thành phần pha động, khảo sát trên cột dài hơn C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) pic Glycyrrhizin bị lưu giữ rất lâu tR = 7 – 8 phút, phải chạy chế độ Gradien tăng lượng acetonitril pic mới rửa giải ở tRkhoảng 4 - 6 phút

Từ các kết quả khảo sát chúng tôi quyết định sử dụng hệ sắc ký khối phổ với các điều kiện như sau để định lượng đồng thời các thành phần trong thuốc tiêm CGI:

31

 Điều kiện khối phổ

ion hóa bằng phun điện tử ion dương (ESI+);

Chọn chế độ phát hiện MRM với các thông số sau:

Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần

hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI

Thành phần Mảnh mẹ

m/z

Cone Voltage (V)

Mảnh con m/z

Năng lượng bắn phá (V)

Chế độ ion hóa

3.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp

Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn đơn của từng hoạt chất pha trong pha động để xác định thời gian lưu ứng với từng chất

32

Phân tích các mẫu placebo tương ứng, các mẫu chuẩn tương ứng pha trong pha động mục 2.3.2 theo phương pháp đã xây dựng So sánh diện tích pic thu được của từng chất trong mẫu chuẩn với diện tích pic thu được tại thời gian lưu tương ứng của chất chuẩn trong mẫu placebo tương ứng

Các sắc ký đồ được trình bày ở các hình 3.7; 3.8; 3.9 Kết quả tỷ lệ đáp ứng pic được trình bày ở bảng 3.3

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng