Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH LÊ ANH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I HÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH LÊ ANH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I CHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh Nơi thực hiện: Trường Đại Học Dược Hà Nội Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa Thời gian thực hiện: 20/01 – 20/5/2015 HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ quý báu từ các thầy cô giáo trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị đồng nghiệp của Trung tâm kiểm nghiệm Thanh Hóa. Nhân dịp này tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báu trong quá trình thực hiện luận văn cũng như trong quá trình học tập, công tác. Tôi trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng tập thể cán bộ Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi trân thành cảm ơn và bày tỏ tình cảm sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015 Học viên Trịnh Lê Anh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CGI : Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection ESI : Chế độ ion hóa bằng phun điện tử HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao LC : Sắc ký lỏng LC-MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần m/z : Khối lượng/ điện tích MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol mM : Milimol MRM : Chế độ bắt đa mảnh phổ MS : Khối phổ PA : Tinh khiết phân tích PDA : Detector photo diod array Q : Quadrupple tứ cực R : Hệ số tương quan tuyến tính RSD : Độ lệch chuẩn tương đối SD, CV : Độ lệch chuẩn tuyệt đối SIM : Chế độ bắt phổ chọn lọc SRM : Chế độ bắt một mảnh phổ UPLC : Sắc ký lỏng siêu cao áp UV Tia tử ngoại MỤC LỤC MỤC TRANG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION (CGI). 1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI. 1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt chất. 1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định thuốc tiêm CGI. 3 3 3 5 1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI 7 1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS) 9 1.2.1.Khái niệm. 9 1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba [20], [18] 9 1.2.3 Ứng dụng 14 1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 15 1.3.1. Tính đặc hiệu 15 1.3.2. Độ tuyến tính 15 1.3.3. Độ đúng 15 1.3.4. Độ chính xác 16 1.3.5. Độ vững 17 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU 18 18 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU 18 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 20 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.3.3 Xử lý kết quả 24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 25 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ 25 3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành phần của thuốc tiêm CGI. 29 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 31 3.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp 31 3.2.2 Độ tuyến tính của phương pháp 34 3.2.3 Độ chính xác 36 3.2.4 Độ đúng 41 3.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích 45 Chương 4. BÀN LUẬN 46 4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 48 4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG TRANG Bảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1. 19 Bảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2. 19 Bảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3. 19 Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4. 20 Bảng 3.1 Các thông số khối phổ 25 Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI. 31 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp 33 Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp 35 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 38 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp 40 Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng đối với thành phần Glycin 42 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng đối với thành phần Glycyrrhizin 43 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng đối với thành phần L-Cystein 44 Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất trong điều kiện thí nghiệm. 45 DANH MỤC CÁC HÌNH TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin 3 Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycine. 4 Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid 4 Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ. 9 Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI 11 Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba 12 Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực 12 Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76) tạo ra mảnh con (m/z = 29). 26 Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76). 26 Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh glycyrrhizin (m/z = 840) tạo ra mảnh con (m/z = 453) 27 Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840). 27 Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein (m/z = 121) tạo ra mảnh con (m/z = 58). 28 Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121). 28 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng. 32 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng. 32 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng. 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) chứa ba thành phần hoạt chất bao gồm: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein 20mg, được dùng trong điều trị rối loạn chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm gan C; hỗ trợ điều trị eczema [14], [15]. Thuốc có trong danh mục thuốc thanh toán bảo hiểm y tế và danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam vì vậy thuốc được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị nhất là điều trị nội trú, bảo vệ gan trước sự tác động có hại của các loại thuốc khác. Tại Việt Nam hiện nay đang tiến hành làm hồ sơ xin cấp phép lưu hành [14]. Tại Nhật Bản thuốc có thành phần tương tự được sử dụng rộng rãi trong điều trị [15]. Để xây dựng tiêu chuẩn của thuốc, một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất là phải xây dựng được phương pháp định tính và định lượng được các hoạt chất đảm bảo tính đặc hiệu, ổn định và chính xác [5], [6]. Đối với hai thành phần acid amin L-Cystein, Glycin trong chế phẩm thuốc Compound Glycyrrhizin Injection - là những hoạt chất không hấp thụ UV nên không thể định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS [12], [18], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector thông thường như: UV-VIS; PDA cũng không định lượng được các thành phần hoạt chất này. Các hoạt chất này có thể phân tích được dựa vào phản ứng dẫn xuất nhóm amin với thuốc thử thích hợp và phát hiện bằng HPLC với detector huỳnh quang [17]. Quá trình dẫn xuất được thực hiện trước cột hoặc sau cột khi phân tích bằng sắc ký, nhưng kết quả thường kém ổn định và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là phương pháp phân tích hiện đại, có tính đặc hiệu và lặp lại cao, có thể phân tích trực tiếp đồng thời các chất trong hỗn hợp ngay cả khi các chất phân tích không tách rời nhau khi qua hệ thống sắc ký. Do 1 đó, kỹ thuật này được sử dụng ngày càng nhiều trong phân tích thuốc, đặc biệt những phép phân tích khó như các thuốc có thành phần phức tạp, phân tử lớn, hàm lượng thấp. Để góp phần triển khai kỹ thuật phân tích mới tại trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thanh Hóa và nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc lưu hành trên thị trường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau: 1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích để định tính, định lượng đồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein bằng kỹ thuật LCMS/MS. 2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein trong chế phẩm thuốc CGI, từ đó hoàn thiện qui trình định tính, định lượng các thành phần hoạt chất trong chế phẩm thuốc CGI bằng LC-MS/MS. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION (CGI). 1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI. + Nguồn gốc: Thuốc tiêm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) được sản xuất bởi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd. No.7 Rongchang East Street, BDA, Beijing, China. + Công thức bào chế 20 ml dung dịch tiêm CGI: Monoamoni Glycyrrhizinate tương đương Acid Glycyrrhizin 40 mg Glycin 400 mg L-cystein hydrochlorid 20 mg Tá dược: Natri sulfit khan, natri clorid, amoniac, nước cất vừa đủ 20 ml [13]. Thuốc đóng trong lọ thủy tinh trung tính, màu trắng, dung dịch thuốc trong suốt, không màu. 1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt chất. Monoamoni Glycyrrhizinat COOH H O H O NH4OOC O HO HO H O HOOC HO HO O OH Hình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin 3 - Công thức phân tử: C42H62O16; - Trọng lượng phân tử: 839,97 g/mol; - Tên khoa học: Acid (3β,18α)-30-hydroxy-11,30-dioxoolean-12-en-3yl 2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosiduronic. - Bột kết tinh màu trắng; - Tan tốt trong nước; tan trong ethanol, khó tan trong methylen clorid, không tan trong ether [14] Glycin O OH NH2 Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycin - Công thức phân tử: C2H5NO2; Công thức cấu tạo: H2N-CH2-COOH; Trọng lượng phân tử: 75,07 g/mol; Tên khoa học: Acid aminoacetic; Bột kết tinh màu trắng, vị ngọt; Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường kiềm, tan trong ethanol, không tan trong ether [4], [13], [18]. L – Cystein hydroclorid O OH . HCL HS NH2 Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid. - Công thức phân tử: C2H5NO2; Công thức cấu tạo: HSCH2CH(NH2)COOH . HCl; Trọng lượng phân tử: 157,62 g/mol; Tên khoa học: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid; 4 - Bột kết tinh màu trắng; - Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường kiềm, tan trong ethanol, không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực [4], [13], [18]. 1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định thuốc tiêm CGI Dược lực học [15] + Tác dụng chống viêm: Ức chế các enzym chuyển hóa acid arachidonic: Glycyrrhizin có thể liên kết với phospholipase A2 (enzym hoạt hóa cho sự chuyển hóa acid arachidonic) và lipoxygenase (chất gây ảnh hưởng đến acid arachidonic và là nguyên nhân sản xuất trung gian viêm), thông qua đó ức chế chọn lọc sự phosphoryl hóa và gây ức chế sự hoạt hóa các enzym. + Tác dụng ức chế sự tổn thương tế bào gan: Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gan chuột trong ống nghiệm, glycyrrhizin ức chế sự tổn thương tế bào gan do tetracloromethan gây ra. + Ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus: Ở những chuột thí nghiệm bị nhiễm viêm gan virus, điều trị với glycyrrhizin có thể kéo dài thêm tuổi thọ. Ở thỏ thí nghiệm bị nhiễm virus bệnh đậu mùa, glycyrrhizin có thể ức chế sự phát triển của virus. Trong các thử nghiệm in-vitro khác, glycyrrhizin cũng thể hiện tác dụng ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus. Glycin và cystein gây ức chế hoặc giảm chứng tăng aldosteron giả do các bất thường trao đổi điện giải trong quá trình điều trị dài ngày với glycyrrhizin. Dược động học [15] + Hấp thu: Đối với người khỏe mạnh, nồng độ thuốc trong máu giảm đáng kể sau 10 giờ tiêm 40 ml dung dịch Compound Glycyrrhizin Injection (chứa 80 mg glycyrrhizin). Sau đó nồng độ thuốc giảm dần dần. Acid glycyrrhizic, sản phẩm thủy phân của glycyrrhizin, xuất hiện sau 6 giờ tiêm thuốc, đạt nồng độ đỉnh sau 24 giờ và bị thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể sau 48 giờ. 5 + Thải trừ qua nước tiểu: Đối với người khỏe mạnh sau khi tiêm glycyrrhizin, nồng độ thuốc trong nước tiểu giảm dần. Tốc độ thải trừ là 1,2% liều sau 27 giờ tiêm thuốc. Acid glycyrrhizic bắt đầu xuất hiện sau 6 giờ và đạt nồng độ đỉnh sau 22 -27 giờ tiêm thuốc. Chỉ định [15] + Hỗ trợ điều trị viêm gan mạn tính và cải thiện rối loạn chức năng gan. + Hỗ trợ điều trị eczema, viêm da, nổi mày đay. Liều lượng và cách sử dụng [15] + Thuốc dùng đường tiêm truyền tĩnh mạch. Dùng theo chỉ dẫn của bác sĩ điều trị. Người lớn: Liều thông thường: Tiêm 5-20 ml mỗi ngày một lần. Có thể điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của bệnh nhân. + Bệnh nhân viêm gan: Tiêm hoặc truyền tĩnh mạch 40-60 ml mỗi ngày một lần. Có thể điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của bệnh nhân. Liều hàng ngày tối đa không được vượt quá 100 ml/ ngày. + Bệnh nhân nhi: Chưa có nghiên cứu đầy đủ. Không khuyến cáo dùng cho nhóm đối tượng này. + Bệnh nhân cao tuổi: Bệnh nhân cao tuổi thường có khuynh hướng bị hạ kali máu. Do đó, việc sử dụng thuốc của bệnh nhân cần được theo dõi chặt chẽ. + Sử dụng cho phụ nữ có thai và cho con bú: Chưa có nghiên cứu đầy đủ và được kiểm soát tốt trên bệnh nhân nhi. Không dùng cho nhóm đối tượng này. Chống chỉ định [15] + Quá mẫn cảm với bất kỳ thành phần nào của thuốc. + Tăng aldosteron, đau cơ hoặc hạ kali máu. + Phụ nữ có thai hoặc nuôi con bú. 6 1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI Trên thế giới đã có nhiều tài liệu công bố về các phương pháp định tính, định lượng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khác nhau bằng các kỹ thuật: sắc ký lỏng [11], [13], [16]; chuẩn độ thể tích [12], [13], [18]; sắc ký lỏng khối phổ [19], [17], [22]. Tuy thuốc CGI đã được sản xuất tại Nhật Bản, Trung Quốc và sử dụng tại nhiều nơi trên thế giới, xong chưa có quốc gia nào đưa chuyên luận thuốc tiêm có chứa các thành phần nói trên vào Dược Điển của mình. Cũng chưa tìm thấy tài liệu công bố phương pháp định lượng đồng thời ba hoạt chất nói trên. Đối với thành phần Glycin dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ môi trường khan, trong đó chất phân tích được hòa tan trong acid actetic băng, hoặc hỗn hợp acid acetic băng và acid formic rồi chuẩn độ bằng acid percloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể hoặc xác định điểm tương đương bằng đo điện thế [13]; [16]; [18]. Với phương pháp này dựa vào tính kiềm của nhóm -NH2 trong phân tử hoạt chất, phương pháp này sẽ bị hạn chế nếu có mặt của nước (là một dung môi khá phổ biến của thuốc tiêm), làm cho chất phân tích vừa thể hiện tính kiềm, vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trở nên trung tính, không chuẩn độ được. Chuyên luận thuốc tiêm Glycin (Glycine Irrigation Solution) trong một số dược điển của các nước tiên tiến đã sử dụng phương pháp trung hòa [13]; [16]; [18]. Nguyên tắc của phương pháp này là trong môi trường nước các acid amin vừa thể hiện tính base vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trung tính. Khi có mặt formol các nhóm –NH2 bị khóa lại nên tính acid trội lên có thể định lượng được bằng một dung dịch base chuẩn. Cả hai phương pháp định lượng hóa học dựa vào tính kiềm của nhóm –NH2; hoặc tính acid của nhóm –COOH đều không đặc hiệu. Phương pháp có giới hạn phát hiện cũng như giới hạn định lượng cao. Khi trong công thức có thêm các thành phần tá dược có tác dụng đệm pH, nền mẫu phức tạp phương pháp sẽ gặp sai số hoặc không tiến hành được. 7 Hoạt chất Cystein dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ oxy hóa khử, trong đó chất phân tích được hòa tan trong nước rồi chuẩn độ bằng dung dịch iod 0,1N phương pháp thừa trừ hoặc chuẩn độ trực tiếp với chỉ thị hồ tinh bột [13]; [16]; [18]. Phương pháp này dựa vào tính khử của nhóm -SH trong phân tử hoạt chất, độ đặc hiệu kém và đôi khi bị ảnh hưởng của sự có mặt một số chất oxy hóa, như oxy hòa tan trong dung dịch. Chế phẩm thuốc chứa Cystein một số tài liệu đã sử dụng phương pháp oxy hóa khử với dung dịch chuẩn độ iod 0,1N chuẩn độ bằng phương pháp trực tiếp hay phương pháp thừa trừ; hoặc dùng dung dịch chuẩn độ là dung dịch bromid, phương pháp thừa trừ. Các phương pháp trên đều có chung nhược điểm như độ nhạy kém, và không đặc hiệu với thành phần hoạt chất, phương pháp gặp phải sai số nhất định khi có một số tá dược chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm [12], [13], [18]. Một số tài liệu công bố phương pháp định lượng thành phần LCystein dạng nguyên liệu cũng như dạng chế phẩm bằng phương pháp HPLC detetor huỳnh quang; sử dụng bộ Kit tạo dẫn xuất huỳnh quang, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một số khó khăn như bộ Kit đắt tiền và không sẵn có [23]. Hoạt chất Glycyrrhizin trong chế phẩm thuốc tiêm CGI được xây dựng phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV bước sóng 252 nm; hoặc detector PDA với bước sóng lấy pic là 252 nm [12]. Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R đã tiến hành định lượng acid Glycyrrhizin và các chất chuyển hóa của Acid Glycyrrhizin bằng phương pháp LC-MS/MS, ở khoảng nồng độ thấp khoảng 1-2 µg/ml [22]. 8 1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS) 1.2.1 Khái niệm Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích có sự kết hợp giữa khả năng phân tách của hệ thống sắc ký (HPLC) với khả năng phân tích khối của hệ thống khối phổ. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một hệ thống có vai trò tách các chất dựa trên sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng [4]. Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc một từ trường nhất định [18], [13]. 1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba (Triple Quadrupole) hay còn gọi là khối phổ hai lần (MS/MS) được sử dụng nhiều trong công tác nghiên cứu, kiểm tra chất lượng thuốc, nhất là định lượng thuốc trong dịch sinh học, nghiên cứu tương đương sinh học, nghiên cứu định lượng các thuốc có thành phần phức tạp vì thiết bị có độ nhạy, độ chọn lọc cao. Trong các kiểu hình thành ion, kỹ thuật phun điện tử ESI (Electrospray Ionazition – ESI) được sử dụng nhiều hơn cả. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng kiểu ion hóa theo kỹ thuật ESI vì vậy trong phần tổng quan này chúng tôi sẽ trình bày về hệ Triple Quadrupole với nguồn Ion hóa kiểu ESI [18], [20]. Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ. 9 Một máy khối phổ tứ cực chập ba gồm có các bộ phận chính sau: Bộ phận nạp mẫu, đưa mẫu vào (Inlet); Bộ nguồn ion hóa (ion source); Bộ phận phân tích khối lần 1 (Q1): phân tích mảnh mẹ; Bộ phận buồng va chạm (Collision cell); Bộ phận phân tích khối lần 2 (Q2): phân tích mảnh con; Bộ phận phát hiện ion (Detector); Bộ phận ghi nhận và xử lý số liệu (data system). Bộ phận nạp mẫu Bộ phận nạp mẫu để chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ. Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760 mm Hg) vào buồng chân không (10-5 – 10-8 Torr) phải không được ngắt chân không của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) và bộ phận phát hiện (detector) nên bộ phận nạp mẫu của LC-MS có khác biệt: Đầu ra của LC là dòng dung môi, nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòng dung môi vào phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và vận hành của thiết bị. Mặt khác khi các ion có trong thành phần của dung môi dễ dàng va chạm với các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng di chuyển và bị bơm chân không hút ra ngoài. Do đó quá trình nạp mẫu từ LC vào MS thường phải qua giao diện ghép nối phù hợp. Một ghép nối LC-MS cần có các đặc tính: cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC sang MS mà không phá hủy hay làm mất chất phân tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu. 10 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI) Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI Trong ESI, tại đầu mao quản dưới ảnh hưởng của điện thế cao, sự hỗ trợ của khí mang và nhiệt độ mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích bề mặt. Điều kiện nhiệt độ trong buồng phun cao làm cho dung môi trong các hạt sương bốc hơi khi đó mật độ điện tích tại các bề mặt hạt sương gia tăng đến một giá trị tới hạn và tiếp tục phân chia thành các hạt sương nhỏ hơn vì lực đẩy tĩnh điện lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi từ đó đi vào bộ phận phân tích khối. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra ngoài bởi bơm chân không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc và hội tụ bởi một điện thế, khi đi ra khỏi buồng ion hóa các phân tử có tốc độ đạt cao nhất rồi đi vào phần phân tích khối là một dòng tập trung và đồng nhất. Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Kỹ thuật ion hóa kiểu phun điện tử được áp dụng để phân tích những chất phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân tử lớn và các chất kém bền với nhiệt. 11 Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập 3 Q3 Q1 Q2 (Collision cell) Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực Bộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1; Q2; Q3. Các tứ cực này được cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành hai cặp điện cực. Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực. Dưới tác động của dòng điện từ trường trong lòng ống điện cực, các ion di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào số khối. ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại. Q1 sẽ tách các ion cần quan tâm bằng cách các ion có tỷ số m/z xác định đã lựa chọn sẽ đi thẳng đến tứ cực thứ 2 (Q2), những ion khác bị dập tắt do va chạm với thành của tứ cực ở các bản điện cực trái dấu. Tứ cực thứ 2 (Q2) còn gọi là buồng va chạm (Collision cell), bên trong chứa khí trơ (Argon) thường được thiết kế cong để tăng sự va chạm. Các ion di chuyển từ tứ cực Q1 vào Q2 có vận tốc lớn va chạm với các 12 phân tử khí trơ trong Q2, lúc này năng lượng động học của ion biến thành nội năng nên các ion bị vỡ ra từng mảng tạo thành các ion con bé hơn. Tứ cực thứ 3 (Q3) có cấu tạo giống Q1, các ion mới được hình thành trong Q2 sẽ được di chuyển tiếp đến Q3. Q3 sẽ phân tích tách và bắt giữ tín hiệu của các ion con đặc trưng cần quan tâm của chất phân tích và đưa đến bộ phận phát hiện (Detector). Bộ phận phát hiện (detector) Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion sẽ được đưa tới bộ phận nhận tín hiệu, phát hiện ion. Bộ phận tín hiệu cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được đưa đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ Full-scan: Khi thao tác với chế độ full-scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ. Chế độ chọn lọc ion: (Selected Ion Monitoring SIM): Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ. SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring): Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM. SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện. 13 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện. 1.2.3 Ứng dụng Phương pháp phân tích khối phổ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa học và công nghệ như: thực phẩm – đồ uống; môi trường; độc chất học; tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật; dược phẩm … Trong ngành dược một số ứng dụng cơ bản của kỹ thuật này: Xác định khối lượng phân tử, khối lượng nguyên tử; Xét đoán cấu trúc phân tử; Kiểm nghiệm thuốc: định tính, định lượng, kiểm tra độ tinh khiết nguyên liệu, xác định tạp chất liên quan…; Nghiên cứu phát triển hợp chất mới; Phân tích thuốc trong dịch sinh học: nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…; Một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh đã được trang bị thiết bị này như: Hà Nội, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Huế… nhưng chưa triển khai được nhièu để phục vụ công tác kiểm nghiệm. + Nghiên cứu xác định tạp chất liên quan là lĩnh vực thế mạnh của thiết bị khi các tạp chất có nồng độ thấp, độ nhạy của các thiết bị HPLC thông thường không đủ đáp ứng, đặc biệt khi không có chất chuẩn, vẫn có thể định tính và xác định được dựa thư viện phổ của các chất đã được lưu giữ trong Detector khối phổ. + Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng một số nhóm hoạt chất không hấp thụ quang như: bán thành phẩm kháng sinh nhóm 14 Aminoglycosid, phục vụ sản xuất mà trước đây không thực hiện được bằng các phương pháp khác. + Phân tích dư lượng một số dung môi tồn dư trong nguyên liệu làm thuốc, theo quy định của GMP. 1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 1.3.1. Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng phân biệt rõ chất cần phân tích khi các thành phần khác có thể tồn tại trong mẫu thử. Thông thường gồm: các tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền. Trong LC-MS, tính đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu được trên sắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách và nhận diện rõ ràng. Tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng tại vị trí các pic của chất phân tích không được vượt quá 2%. 1.3.2. Độ tuyến tính Độ tuyến tính của một qui trình phân tích diễn tả đáp ứng phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử. Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữa nồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được. Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định. Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + b Yêu cầu: - Số điểm đường chuẩn n ≥ 5 - Hệ số tương quan r ≥ 0,998 1.3.3. Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chất phân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận. 15 Thường tiến hành ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của phương pháp (80% - 100% và 120%), mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu hoặc 6 mẫu ở mức nồng độ 100%. Yêu cầu: - Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%; (Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết) 1.3.4. Độ chính xác Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau (mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra. Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp. Độ lặp lại Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại biểu thị độ chính xác trong định lượng. Thường được tiến hành trên 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3 lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%. Yêu cầu: - Định lượng: RSD ≤ 2,0% - Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0% Độ chính xác trung gian Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện: các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau, và hóa chất khác lô sản xuất. 16 Yêu cầu: - Định lượng: RSD ≤ 2,0% - Độ hòa tan: RSD ≤ 4,0% - Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%. Độ tái lặp Độ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm (Phối hợp nghiên cứu giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩn hoá phương pháp). 1.3.5 Độ vững Đánh giá ảnh hưởng của các thay đổi nhỏ trong quy trình phân tích đến kết quả phân tích và độ ổn định của kết quả. Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá độ ổn định theo thời gian của hoạt chất trong điều kiện phân tích. 17 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU - Chất chuẩn: + Chất chuẩn: Glycin; nguồn gốc Viện Kiểm nghiệm thuốc TƯ, hàm lượng 99,87% (nguyên trạng); SKS: WS010814. + Chuẩn L-Cystein: chuẩn nhà sản xuất; hàm lượng 98,04% (nguyên trạng); SKS: C1276. + Chuẩn Monoamoni Glycyrrhizinat: chuẩn Sigma Aldrich, Mỹ; hàm lượng 80,0% (nguyên trạng); SKS: SLBBG1855V. - Dung môi hóa chất: + Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho sắc ký lỏng khối phổ LC/MS. + Các dung môi hóa chất khác: cloroform; acid formic; acid acetic; acid tricloacetic, amoni acetat đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích (PA). - Thiết bị dụng cụ: + Tất cả các thiết bị đều được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC 17025 : 2005; và GLP, bao gồm: + Hệ thống sắc ký lỏng UPLC – MS/MS, nguồn ion kiểu ESI, hãng Waters Acquity H (UPLC-Class); Detector Xevo TQD (Waters), Mỹ; + Cân phân tích Mettler Toledo MS240S (d=0,1 mg); + Các dụng cụ thủy tinh của phòng thí nghiệm cấp A; 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU - Mẫu Placebo: là các mẫu tự tạo có chứa các thành phần của công thức thuốc và không chứa hoạt chất tương ứng. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 04 mẫu placebo. Công thức các mẫu Placebo được trình bày cụ thể trong các bảng: 2.1, 2.2, 2.3, 2.4. 18 Bảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1 STT Thành phần 1 Natri sulfit khan 2 Natri clorid 3 Amoni hydroxyd 4 Nước cất Hàm lượng 20 mg 180 mg Điều chỉnh pH = 7,0 Vừa đủ 20 ml Bảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2 STT Thành phần Hàm lượng 1 Glycin 2 L-Cystein 20 mg 3 Natri sulfit khan 20 mg 4 Natri clorid 5 Amoni hydroxyd 6 Nước cất 400 mg 180 mg Điều chỉnh pH = 7,0 Vừa đủ 20 ml Bảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3 STT Thành phần Hàm lượng 1 Glycyrrhizin 40 mg 2 L-Cystein 20 mg 3 Natri sulfit khan 20 mg 4 Natri clorid 5 Amoni hydroxyd 6 Nước cất 180 mg Điều chỉnh pH = 7,0 Vừa đủ 20 ml 19 Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4 STT Thành phần 1 Glycyrrhizin 2 Glycin 3 Natri sulfit khan 4 Natri clorid 5 Amoni hydroxyd 6 Nước cất Hàm lượng 40 mg 400 mg 20 mg 180 mg Điều chỉnh pH = 7,0 Vừa đủ 20 ml - Mẫu thử: Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection; nhà sản xuất: Beijing Kawin Technology Share-Holding Co., Ltd. China; SKS: 20140906/077; ngày sản xuất: 24/09/2014; hạn dùng: 23/09/2017. - Mẫu chuẩn: là các dung dịch chuẩn được pha với nồng độ thích hợp trong pha động. 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích Xác định các điều kiện khối phổ phân tích Glycyrrhizin; Glycin; LCystein Sử dụng hệ thống khối phổ LC-MS/MS với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau: + Glycyrrhizin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng độ 2 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ 20µl/phút; 20 + Glycin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng độ 20 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ 20µl/phút; + Cystein được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng độ 1 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ 20µl/phút. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ với các nội dung sau: Xác định các ion mẹ; Tối ưu hóa các điều kiện ở nguồn ion hóa, bộ phận thấu kính hội tụ để lượng ion mẹ đi vào hệ thống khối phổ nhiều nhất và ổn định nhất; Xác định các mảnh ion con bền, ổn định và xác định năng lượng phân mảnh tối ưu nhất để lượng ion con tạo thành nhiều nhất và ổn định nhất. Khảo sát điều kiện sắc ký Qua tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) và cột C18; C8 (100 x 2 mm; 1,8 µm); trên các hệ pha động gồm Acetonitril; dung dịch đệm amoniacetat 0,5 mM pH=3,0; dung dịch acid formic 0,01%; dung dịch acid tricloacetic 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau. Từ kết quả khảo sát có thể chọn hệ sắc ký thích hợp để tiến hành định lượng đồng thời 3 hoạt chất trong thuốc tiêm CGI trên hệ thống UPLC-MS/MS. 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích Chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng như sau: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Chuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừa đủ 100 ml. 21 Dung dịch chuẩn Cystein làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ: 1,078 µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Chuẩn gốc Monoamoni glycyrrhizinat: cân 0,0165 g chuẩn Glycyrrhizin, pha trong nước vừa đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn Monoamoni glycyrrhizinat làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Glycyrhizin tương ứng: 2,0µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừa đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn Glycin làm việc: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml được dung dịch có nồng độ: 20,873µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Chuẩn bị mẫu thử: Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Mẫu trắng: Có chứa các thành phần tá dược, không chứa các thành phần chất phân tích. Chuẩn bị như mẫu thử. Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Asean [3]. Tính chọn lọc Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 lần phân tích mẫu placebo tương ứng với từng thành phần của thuốc và thành phần chuẩn đơn lẻ. Tiến hành ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng với mẫu chuẩn tại vị trí thơi gian lưu của chuẩn [3]. 22 Khoảng nồng độ tuyến tính Pha một dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp ban thành phần có nồng độ khác nhau tương ứng 50%; 75%; 100%; 125%; 150% nồng độ định lượng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ hoạt chất và diện tích píc đáp ứng [3]. Độ chính xác - Độ lặp lại Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng một ngày, cùng một kiểm nghiệm viên, cùng thiết bị. Tính toán kết quả và đánh giá độ lặp lại của phương pháp [3]. - Độ chính xác trung gian Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng ngày hôm sau, với kiểm nghiệm viên khác, sử dụng cột phân tích khác. Tính toán kết quả và đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp bằng cách so sánh kết quả phân tích của hai kiểm nghiệm viên trong hai ngày [3]. Độ đúng Độ đúng của phương pháp được tiến hành bằng cách phân tích mẫu tự tạo bằng cách thêm chuẩn vào mẫu placebo số 1 ở ba khoảng nồng độ 80%; 100% và 120% nồng độ định lượng. Mỗi nồng độ được tiến hành độc lập 03 mẫu. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, tính toán kết quả. Độ đúng được đánh giá dựa trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượng được so với nồng độ thực của mẫu [3]. Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích Mẫu thử được chuẩn bị trong phần thẩm định độ lặp lại của phương pháp được giữ lại bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ phân tích lại. So 23 sánh với kết quả ban đầu để đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong điều kiện phân tích [3]. 2.3.3 Xử lý kết quả Các số liệu về diện tích pic, thời gian lưu, mảnh khối của các chất phân tích trên sắc ký đồ, phổ đồ với phần mềm Maslyx của máy UPLCMS/MS Waters Acquity H (UPLC-Class); Detector Xevo TQD (Waters). Các số liệu phân tích được xử lý thống kê bằng phần mềmMicrosoft Excel. Công thức tính toán hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm: X (%)  St 100%  C C  1000  Sc HL  1000000 Trong đó: + St; Sc: diện tích pic của mẫu thử; mẫu chuẩn. + Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml). + HL: lượng hoạt chất có trong 1 ml chế phẩm (theo nhãn). 24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ Pha các dung dịch chuẩn Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong hỗn hợp MeOH: nước (1:1) có nồng độ lần lượt như sau: 2 µg/ml; 20 µg/ml; 1 µg/ml. Tiêm các dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ cùng với dòng pha động sắc ký (tốc độ 0,3 ml/phút). Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ một lần, quét toàn dải (Full scan MS); xác định các mảnh ion mẹ (parent ion) của các chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein. Kết quả xác định được các ion mẹ có số khối như sau: Glycin m/z = 76,332 Da; Glycyrrhizin m/z = 840,363 Da; L-Cystein m/z = 121,832 Da; ứng với cấu trúc nhận một proton. Sau khi xác định được các mảnh ion mẹ, tiến hành tối ưu điều kiện nguồn ion hóa: điện thế đầu cone (Cone voltage); năng lượng bắn phá để tạo ra mảnh ion con cường độ tín hiệu cao và bền nhất. Từ kết quả thực nhiệm chúng tôi đã xác định được như sau: Bảng 3.1 Các thông số khối phổ Khối lượng phân tử Năng Mảnh Cone Mảnh lượng ion mẹ Voltage ion con bắn phá Glycin 75,07 76,32 16 29,83 22 ESI+ Glycyrrhizin 839,36 840,46 26 453,25 32 ESI+ Cystein 120,8 121,83 24 58,88 20 ESI+ Thành phần 25 Chế độ ion Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76,3) tạo ra mảnh con (m/z = 29,8). Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76,3). 26 Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycyrrhizin (m/z = 840,4) tạo ra mảnh con (m/z = 453,3). Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840,4). 27 Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein (m/z = 121,8) tạo ra mảnh con (m/z = 58,9). Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121,83). 28 Thực nghiệm cho thấy khi thực hiện chế độ Intellistart (chế độ tune tự động) phân tử Glycin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da; Glycyrrhizin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 453,3 Da; L-Cystein bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da là những mảnh ion con có cường độ tín hiệu cao, bền vững và tín hiệu ổn định nhất. 3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành phần của thuốc tiêm CGI Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong pha động có nồng độ: + Glycyrrhizin: 2 µg/ml; + Glycin: 20 µg/ml; + Cystein: 1 µg/ml. Cố định pha tĩnh là cột C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát với các pha động: + Pha động 1: Methanol : dung dịch acid formic 0,1% (90:10); + Pha động 2: Acetonitril : dung dịch acid formic 0,1% (90:10); + Pha động 3: Methanol : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10); + Pha động 4: Acetonitril : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10); + Pha động 5: Methanol : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0 (90 : 10); + Pha động 6: Acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0 (90 : 10); Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy: Đối với pha động số 1; số 2 có chứa thành phần acid formic thành phần Cystein không ổn định trong pha động, bị phân hủy. Đối với pha động số 3; số 4 có chứa thành phần acid tricloacetic ở chế độ khối phổ của thành phần Cystein đường nền đáp ứng rất cao 105 vì acid tricloacetic gây nhiễu đường nền ở mảnh con 58,9 Da; dẫn đến độ nhạy thấp không đáp ứng yêu cầu. 29 Đối với pha động số 5; số 6 các thành phần hoạt chất ổn định trong pha động, đường nền ổn định và giá trị S/N cao, phù hợp cho phép phân tích. So sánh giữa pha động số 5 và số 6 chúng tôi thấy pha động số 6 các pic cân đối và ít bị kéo chân hơn. Từ kết quả khảo sát sơ bộ chúng tôi chọn pha động số 6 với thành phần acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0. Tiến hành khảo sát sâu hơn bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần của pha động số 6. Nếu tăng thành phần acetonitril lên pic Glycyrrhizin sẽ ra sớm hơn, thời gian lưu của Glycin và Cystein gần như không ảnh hưởng. Ở tỷ lệ pha động acetonitril : dung dịch đệm amoni actetat 5mM pH=3,0 (35 : 65), các pic tách nhau rõ ràng, thời gian lưu của Glycyrrhizin 2,2 phút. Giữ nguyên thành phần pha động thay đổi tốc độ dòng, khi tốc độ dòng 0,2 ml/phút, pic Glycyrrhizin bị kéo chân; khi tốc độ dòng tăng lên 0,4 ml/phút pic Glycyrrhizin ra sớm hơn xong áp suất hệ thống tăng cao, vì vậy chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút là phù hợp và đáp ứng yêu cầu. Giữ nguyên tốc độ và thành phần pha động, khảo sát trên cột dài hơn C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) pic Glycyrrhizin bị lưu giữ rất lâu tR = 7 – 8 phút, phải chạy chế độ Gradien tăng lượng acetonitril pic mới rửa giải ở tR khoảng 4 - 6 phút. Từ các kết quả khảo sát chúng tôi quyết định sử dụng hệ sắc ký khối phổ với các điều kiện như sau để định lượng đồng thời các thành phần trong thuốc tiêm CGI:  Điều kiện sắc ký. Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); Pha động: Hỗn hợp acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH = 3,0 (35:65); Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; Thể tích tiêm: 10 µl; 30  Điều kiện khối phổ. ion hóa bằng phun điện tử ion dương (ESI+); Chọn chế độ phát hiện MRM với các thông số sau: Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI. Mảnh mẹ m/z Cone Voltage (V) Mảnh con m/z Năng lượng bắn phá (V) Chế độ ion hóa Glycin 76,32 16 29,83 22 ESI+ Glycyrrhizin 840,46 26 453,25 32 ESI+ Cystein 121,83 24 58,88 20 ESI+ Thành phần Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động có nồng độ: + Glycyrrhizin 2 µg/ml; + Glycin 20 µg/ml; + Cystein 1 µg/ml. Mẫu thử được pha trong pha động để có nồng độ các thành phần tương đương với mẫu chuẩn. 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Sau khi đã xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời các thành phần của thuốc tiêm CGI, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo cách đã được trình bày ở mục 2.3.2 nhằm khẳng định phương pháp phân tích đã xây dựng là tin cậy và phù hợp mục đích sử dụng. 3.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn đơn của từng hoạt chất pha trong pha động để xác định thời gian lưu ứng với từng chất. 31 Phân tích các mẫu placebo tương ứng, các mẫu chuẩn tương ứng pha trong pha động mục 2.3.2 theo phương pháp đã xây dựng. So sánh diện tích pic thu được của từng chất trong mẫu chuẩn với diện tích pic thu được tại thời gian lưu tương ứng của chất chuẩn trong mẫu placebo tương ứng. Các sắc ký đồ được trình bày ở các hình 3.7; 3.8; 3.9. Kết quả tỷ lệ đáp ứng pic được trình bày ở bảng 3.3. Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng. Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng. 32 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng. Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp Glycin Glycyrrhizin Cystein TT A B A B A B 1 1622,728 10,518 128302,398 138,536 20181,395 6,212 2 1655,161 17,692 127433,203 97,439 20158,520 5,165 3 1725,132 12,321 129295,164 69,419 20001,854 7,113 4 1653,656 3,875 127898,143 60,057 20697,324 2,157 5 1722,254 2,090 128099,343 51,195 20562,162 5,879 6 1672,872 3,636 128861,127 54,439 20661,182 4,098 TB 1675,301 8,355 128314,896 78,514 20377,073 5,104 Tỷ lệ đáp ứng píc (%) 0,5% - 0,06 - 0,03 A: Đáp ứng pic chất phân tích của mẫu chuẩn B: Đáp ứng pic tại tR tương ứng với pic chất phân tích của mẫu trắng Kết quả thực nghiệm cho thấy: 33 + Trên sắc ký đồ mẫu trắng (hình 3.7; 3.8; 3.9) tại các thời gian lưu tương ứng của chất phân tích không xuất hiện các pic có: mảnh phổ m/z = 76,33 -> 29,83 (đặc trưng cho Glycin); mảnh phổ m/z = 840,363 -> 453,338 (đặc trưng cho Glycyrrhizin); mảnh phổ m/z = 121,832 -> 58,88 (đặc trưng cho Cystein). + Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn (hình 3.7; 3.8; 3.9) các pic chất chuẩn xuất hiện cân đối. + Tỷ lệ đáp ứng pic mẫu trắng so với mẫu chuẩn tại thời gian lưu tương ứng lần lượt: Glycin 0,5%; Glycyrrhizin 0,06%; Cystein là 0,03% (không quá 2%). Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ chọn lọc để phân tích đồng thời các thành phần hoạt chất trong thuốc tiêm CGI. 3.2.2 Độ tuyến tính của phương pháp Từ dung dịch chuẩn gốc Glycin; Glycyrrhizin; L-Cystein mục 2.3.2 tiến hành pha loãng bằng pha động được một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau. Tiến hành phân tích theo quy trình. Ghi lại sắc ký đồ và đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ và diện tích pic. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4. 34 Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp STT % so với nồng độ định lượng Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic đáp ứng Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic đáp ứng Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic đáp ứng 1 50 10,436 1029,237 1,00 63987,199 0,539 10100,721 2 75 15,655 1293,753 1,50 96226,798 0,808 15572,046 3 100 20,873 1725,132 2,00 128302,398 1,078 20181,395 4 125 26,091 2155,562 2,50 160433,997 1,347 25226,743 5 150 31,309 2589,978 3,00 193009,970 1,617 30309,093 Glycin Glycyrrizin L-Cystein Phương trình hồi quy: y = 80,17 x + 65,42 y = 64450,55 x – 509,02 y = 18579,21x + 253,33 Hệ số tương quan tuyến tính r = 0,9964 r = 1,000 r = 0,9997 35 Kết quả thực nghiệm cho thấy: + Khoảng tuyến tính của thành phần Glycin (bảng 3.6) từ: 10,4 – 31,3 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ số tương quan tuyến tính r = 0,9964 và hệ số chắn b = 65,41(tương đương 3,79% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%. + Khoảng tuyến tính của thành phần Glycyrrhizin (bảng 3.6) từ: 1,0 – 3,0 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ số tương quan tuyến tính r = 1,000 và hệ số chắn b = 509,02 (tương đương 0,4% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%. + Khoảng tuyến tính của thành phần L-Cystein (bảng 3.6) từ: 0,54 – 1,62 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ số tương quan tuyến tính r = 0,9997 và hệ số chắn b = 253,32 (tương đương 1,2% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%. Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ tuyến tính để phân tích các thành phần hoạt chất trong thuốc tiêm CGI. 3.2.3 Độ chính xác Tiến hành thẩm định 2 tiêu chí là độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Độ lặp lại Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích đã xây dựng. Tiến hành phân tích độc lập mẫu thử 6 lần. Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp như sau Chuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừa đủ 100 ml. 36 Chuẩn gốc Glycyrrhizin: cân 0,0125 g chuẩn Glycyrrhizin, pha trong nước vừa đủ 100 ml. Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừa đủ 100 ml. Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc Cystein; 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc Glycyrrhizin; và 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc Glycin vào bình định mức 100 ml, thêm pha động vừa đủ. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ tương ứng: Cystein1,08 µg/ml; Glycyrrhizin: 2,00 µg/ml; Glycin: 20,87µg/ml. Chuẩn bị mẫu thử Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5. 37 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp Glycin Glycyrrhizin L-Cystein STT Diện tích pic Hàm lượng % so nhãn Diện tích pic Hàm lượng % so nhãn Diện tích pic Hàm lượng % so nhãn Chuẩn 1675 - 133343 - 20181 - 1 1656 103,18 147800 108,52 18909 98,96 2 1599 99,63 147725 108,47 18933 99,08 3 1609 100,25 148405 108,96 18704 97,88 4 1649 102,75 148829 109,28 18999 99,43 5 1598 99,57 147836 108,55 18740 98,07 6 1645 102,50 147749 108,48 18678 97,75 Trung bình: 101,31 108,71 98,53 RSD (%): 1,65 0,31 0,72 38 Kết quả thực nghiệm cho thấy: + Định lượng lặp lại 6 lần độc lập đối với mẫu thử trong cùng một ngày với cùng một kiểm nghiệm viên, tiến hành trong các điều kiện thử nghiệm hoàn toàn giống nhau cho thấy các thành phần hoạt chất trong thuốc CGI có độ lặp lại đáp ứng yêu cầu đặt ra: + Glycin: RSD = 1,65% < 2%; + Glycyrrhizin: RSD = 0,31% < 2%; + L-Cystein: RSD =0,72% < 2%; Độ chính xác trung gian Để đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp phân tích đã xây dựng. Tiến hành phân tích độc lập mẫu thử 6 lần với kiểm nghiệm viên khác, ngày phân tích khác. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. 39 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp Glycin STT Diện tích pic Glycyrrhizin Hàm lượng % so nhãn Diện tích pic Hàm lượng % so nhãn 132335 L-Cystein Diện tích pic Hàm lượng % so nhãn Chuẩn 1689 20891 1 1599 98,80 155426 99,23 15652 98,80 2 1604 99,11 156273 99,78 15202 95,96 3 1628 100,60 156227 99,75 15658 98,84 4 1594 98,49 155101 99,03 15606 98,51 5 1589 98,19 156335 99,81 15652 98,80 6 1618 99,98 155303 99,16 15684 99,00 Trung bình: 99,20 99,46 98,32 RSD (%): 0,93 0,36 1,19 Trung bình (n = 12) 100,25 98,99 98,42 RSD (n = 12) 1,69 0,73 0,94 40 Kết quả thực nghiệm cho thấy: + Định lượng lặp lại 12 lần độc lập đối với mẫu thử trong hai ngày khác nhau với hai kiểm nghiệm viên, tiến hành trên hai cột phân tích khác nhau thấy các thành phần hoạt chất trong thuốc CGI có độ chính xác trung gian đáp ứng yêu cầu đặt ra: + Glycin: RSD = 1,69% < 2%; + Glycyrrhizin: RSD = 0,73% < 2%; + L-Cystein: RSD = 0,94% < 2%; 3.2.4 Độ đúng Độ đúng được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu Placebo số 1 sao cho nồng độ hoạt chất tương đương 80%; 100%; 120% nồng độ định lượng, rồi tiến hành định lượng theo phương pháp đã xây dựng. Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Mẫu 80%: Cân chính xác 320,0 mg Glycin; 32,0 mg Glycyrhizin; 16,0 mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo. Mẫu 100%: Cân chính xác 400,0 mg Glycin; 40,0 mg Glycyrhizin; 20,0 mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo. Mẫu 120%: Cân chính xác 480,0 mg Glycin; 48,0 mg Glycyrhizin; 24,0mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo. Xử lý mẫu như hướng dẫn trong quy trình phân tích đã quy định, tiến hành phân tích. Đánh giá độ đúng thông qua tỷ lệ thu hồi hoạt chất. Mỗi nồng độ tiến hành độc lập ba lần. Kết quả được trình bày trong các bảng: 3.7; 3.8; 3.9. 41 Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng đối với Glycin STT Mẫu Lượng hoạt Lượng hoạt chất thêm vào Diện tích pic chất tìm lại (g) (g) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 Chuẩn 2 80%(1) 0,3210 1296 0,3162 98,52 3 80%(2) 0,3192 1292 0,3117 98,76 4 80%(3) 0,3205 1328 0,3239 101,07 5 100%(1) 0,4011 1615 0,3939 98,21 6 100%(2) 0,4054 1642 0,4007 98,84 7 100%(3) 0,4095 1677 0,4091 99,90 8 120%(1) 0,4896 1989 0,4852 99,10 9 120%(2) 0,4876 1989 0,4852 99,50 10 120%(3) 0,4856 1965 0,4793 98,71 1689 Trung bình 98,18 RSD (%): 0,88 42 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng đối với Glycyrrhizin STT Mẫu Lượng hoạt chất thêm vào Diện tích pic (g) Lượng hoạt chất tìm lại (g) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 Chuẩn 132335 2 80%(1) 0,0321 124340 0,0321 100,11 3 80%(2) 0,0322 123347 0,0319 99,00 4 80%(3) 0,0319 124330 0,0321 100,72 5 100%(1) 0,0410 156578 0,0405 98,70 6 100%(2) 0,0411 156067 0,0403 98,13 7 100%(3) 0,0409 155411 0,0402 98,20 8 120%(1) 0,0481 187665 0,0485 100,83 9 120%(2) 0,0479 188664 0,0488 101,79 10 120%(3) 0,0469 178933 0,0462 98,60 Trung bình 99,56 RSD (%): 1,33 43 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng đối với L-Cystein STT Mẫu Lượng hoạt chất thêm vào Diện tích pic (g) Lượng hoạt chất tìm lại (g) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 Chuẩn 20891 2 80%(1) 0,0167 12754 0,0163 98,34 3 80%(2) 0,0164 12533 0,0161 98,40 4 80%(3) 0,0162 12509 0,0161 99,43 5 100%(1) 0,0202 15681 0,0202 99,96 6 100%(2) 0,0211 16349 0,0211 99,77 7 100%(3) 0,0214 16387 0,0211 98,60 8 120%(1) 0,0241 18614 0,0240 99,45 9 120%(2) 0,0242 18609 0,0240 99,01 10 120%(3) 0,0244 18860 0,0243 99,53 Trung bình 99,17 RSD (%): 0,61 Kết quả thực nghiệm cho thấy cả ba khoảng nồng độ 80%; 100%; 120% tỷ lệ thu hồi đối với từng thành phần như sau: Đối với thành phần Glycin: trung bình: 98,18%; RSD = 0,88%; Đối với thành phần Glycyrrhizin: trung bình: 99,56%; RSD = 1,33%; Đối với thành phần L-Cystein: trung bình: 99,17%; RSD = 0,61%; Từ kết quả thẩm định cho thấy ở cả ba khoảng nồng độ, tỷ lệ thu hồi trung bình đạt từ 98,18% đến 99,56%, các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%. Do đó phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng yêu cầu dùng cho phép thử định lượng. 44 3.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích Mẫu thử được chuẩn bị trong phần đánh giá độ lặp lại của phương pháp được giữ lại bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng và phân tích sau 24 giờ, so sánh với kết quả định lượng ban đầu, đánh giá sự ổn định của dược chất trong điều kiện thí nghiệm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất trong điều kiện thí nghiệm. Hoạt Hàm lượng Glycin chất so nhãn (%) Hàm lượng Glycyrrhizin so nhãn (%) Hàm lượng L-Cystein so nhãn (%) Lần 1 Sau 24h Lần 1 Sau 24h Lần 1 Sau 24h 1 103,18 101,89 108,52 105,09 98,96 100,02 2 99,63 100,07 108,47 106,91 99,08 98,05 3 100,25 99,87 108,96 108,92 97,88 98,09 4 102,75 99,93 109,28 109,01 99,43 100,06 5 99,57 100,02 108,55 109,45 98,07 98,83 6 102,50 101,23 108,48 107,63 97,75 98,26 Trung bình 101,31 100,50 108,71 107,84 98,53 98,89 1,67 0,85 0,33 1,65 0,71 0,94 STT SD. T-test T table 1,25 1,52 0,68 2,57 (df=5; p = 0,05; 2 đuôi) Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy, nồng độ hoạt chất trong mẫu phân tích đã chuẩn bị trong điều kiện thí nghiệm bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng sau 24 giờ so với kết quả định lượng ngay sau khi chuẩn bị mẫu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với mức tin cậy 95%. Như vậy mẫu phân tích ổn định trong điều kiện thí nghiệm trong vòng 24 giờ đáp ứng yêu cầu cho việc phân tích mẫu. 45 Chương 4. BÀN LUẬN Theo thống kê mới nhất hội gan mật, hiện nay Việt Nam có khoảng 20 triệu người nhiễm virus viêm gan; khoảng 12-16 triệu người nhiễm virus viêm gan B; 4,5 triệu người nhiễm virus viêm gan C. Các nghiên cứu khoa học cho thấy virus viêm gan có thể gây bệnh cho mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính, khả năng lây lan cũng không có giới hạn, trong đó nguy hiểm nhất là virus viêm gan B và C. Hai loại virus này thường có trong máu người bệnh, lây chủ yếu qua đường tiêm chích, truyền máu, giao hợp, từ mẹ sang con lúc sinh nở. Hiện nay, khoảng 5-10 % những người bị nhiễm virus viêm gan B, khoảng 20 % những người nhiễm virus viêm gan C có nguy cơ biến chứng sang xơ gan [6]. Các thuốc thuộc nhóm bệnh này chủ yếu gồm các acid amin như Arginin, L-Ornithin aspartate, Biphenyl-dimethyl-Dicarboxylate Chế phẩm thuốc CGI (Compound Glycyrrhizin Injection) do Công ty TNHH xuất nhập khẩu y tế Delta phân phối có thành phần Glycyrrhizin 40 mg; L-Cystein 20 mg; Glycin 400 mg trong 20 ml có tác dụng chống viêm và ức chế sự nhân lên của virus. Thuốc được chỉ định trong các trường hợp: viêm gan mạn tính, cải thiện rối loạn chức năng gan; hỗ trợ điều trị eczema, viêm da và nổi mày đay. Tại Nhật Bản thuốc tiêm Minophagen của hãng Eisai với thành phần tương tự với chỉ định điều trị viêm gan do virus viêm gan C. Thuốc có được bán tại các quốc gia trên thế giới như: Singapore, Philippin, Hồng Kông, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam, Myanmar, Căm phu chia, Lào, Brunei, Úc, các nước Trung Đông: (Jordan, Ả rập xê út, Yemen), Nga. Trong nước nhu cầu về thuốc trên là rất lớn, do vậy các công ty sản xuất dược phẩm trong nước cũng quan tâm đầu tư nghiên cứu để đăng ký sản xuất thuốc trên. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu này dựa trên các tài liệu tham khảo, các trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc và tiến tới có 46 thể chuyển giao cho các công ty đăng ký sản xuất thuốc cũng như áp dụng kiểm tra chất lượng thuốc lưu hành trên thị trường. Chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời các hoạt chất có mặt trong thuốc bằng phương pháp LC-MS/MS. Phương pháp được thẩm định đầy đủ, theo quy định của Bộ Y tế đáp ứng yêu cầu của một phương pháp dùng kiểm tra chất lượng thuốc. Phương pháp UPLC-MS/MS là một trong những kỹ thuật phân tích hiện đại vào hạng bậc nhất hiện nay tại Việt Nam. Phương pháp có thời gian phân tích ngắn, tiết kiệm dung môi hóa chất và góp phần bảo vệ môi trường. Độ nhạy phương pháp cao, có thể phát hiện và định tính, định lượng được những hợp chất có nồng độ ppb (dạng vết) trong các nền mẫu phức tạp. Đặc biệt thiết bị có khả năng phát hiện được sự có mặt của hoạt chất không phụ thuộc vào đặc tính phân tử của chúng (có hấp thụ UV hay không), khi được tích hợp ngân hàng phổ thiết bị có thể định tính chúng không cần dùng chất đối chiếu, điều này giải quyết được khó khăn của các phòng thí nghiệm Việt Nam hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh những mặt mạnh kỹ thuật UPLC-MS/MS cũng có những hạn chế nhất định như: mức độ phổ biến của thiết bị hiện nay chưa nhiều, giá thành thiết bị khá đắt. Đối với Trung tâm Kiểm nghiệm Thanh Hóa là một đơn vị kiểm nghiệm tuyến tỉnh đã đạt hai tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025:2005, được trang bị thiết bị UPLC-MS/MS là một kỹ thuật cao, đòi hỏi kiểm nghiệm viên phải có tay nghề vững, được đào tạo cơ bản và liên tục. Thiết bị có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích khác nhau như: thuốc, thực phẩm, môi trường… đã mở ra nhiều cơ hội phát triển cho đơn vị. So sánh với các phương pháp định tính định lượng các hoạt chất của thuốc tiêm CGI nói trên, phương pháp chúng tôi xây dựa trên kỹ thuật UPLC-MS/MS có nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, có khả năng định lượng đồng thời các hoạt chất trong mẫu và thời gian phân tích ngắn. Từ quá trình thực nghiệm chúng tôi có một số bàn luận như sau: 47 4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp UPLC-MS/MS mới được đưa vào ứng dụng tại Việt Nam với những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc và độ đặc hiệu. Chính vì vậy phương pháp được ứng dụng ngày càng nhiều trong các nghiên cứu như: định lượng thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh học, theo dõi quá trình điều trị, nghiên cứu sinh dược học, đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học của thuốc. Thuốc tiêm CGI trong 20 ml dung dịch chứa: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein 20 mg. Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bố phương pháp định lượng riêng lẻ từng thành phần của thuốc. Đối với thành phần glycyrrhizin là một hoạt chất chiết từ cây cam thảo có vị ngọt có tính chất của saponin. Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng glycyrrhizin bằng phương pháp HLPC với detector UV-VIS [13]. Theo chuyên luận của Dược điển Châu Âu EP 5.0 xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất monoamoni glycyrhinat bằng phương pháp chuẩn độ môi trường khan với mức chỉ tiêu chất lượng yêu cầu từ 98,0% đến 102,0%, cũng trong tiêu chuẩn này quy định hàm lượng tạp chất liên quan không được quá 17%. Điều này cho thấy phương pháp định lượng hoạt chất mà EP 5.0 xây dựng không đảm bảo độ đặc hiệu dẫn đến mâu thuẫn giữa hai chỉ tiêu chất lượng. Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng Glycin bằng phương pháp chuẩn độ trung hòa, phương pháp dùng formol để định lượng acid amin. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản xong không đặc hiệu [13]. L-cystein là một acid amin có chứa nhóm -SH là nhóm mang tính khử, Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất này bằng phương pháp chuẩn độ Bromid. Phương pháp này tiến hành dễ dàng, 48 đơn giản xong độ đặc hiệu không cao, có thể định lượng nhầm một số thành phần khác có mặt trong công thức hoặc khi hoạt chất đã bị biến đổi nhưng vẫn mang tính khử. Hai thành phần acid amin trong công thức là glycin; L-cystein là những chất không hấp thụ tia UV nên việc định lượng chúng trong các thuốc gặp nhiều khó khăn, thông thường để định lượng các hoạt chất này bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC người ta phải tạo dẫn chất của chúng và sử dụng các detector huỳnh quang, hoặc detector UV. Có hai phương pháp để tạo dẫn chất đó là: tạo dẫn chất trước cột, phương pháp này có độ lặp lại và ổn định không cao; tạo dẫn chất sau cột phương pháp này ổn định hơn xong lại cần thêm thiết bị phụ kiện và thuốc thử dùng cũng đắt tiền. Với phương pháp HPLC thông thường để định lượng đồng thời hai thành phần Glycin và L-Cystein phải dùng cột chuyên dùng để phân tích các acid amin xong khả năng tách Glycin và L-cystein ra khỏi nhau là rất khó, hai pic khó đạt yêu cầu về độ phân giải. Với hệ thống UPLC chịu được áp suất cao, chúng tôi đã sử dụng cột phân tích có khả năng phân tích tốt, cỡ hạt nhồi bé 1,8 µm xong hai pic Glycin và L-Cystein vẫn không tách khỏi nhau, thời gian lưu trùng nhau hoàn toàn 0,41 phút. Với sự hỗ trợ của detector khối phổ, chọn chế độ MRM (Multi Reaction Monitoring) tín hiệu của pic Glycin và L-Cystein được tách riêng và ghi thành hai kênh khác nhau nên vẫn có thể định lượng riêng từng thành phần cho dù chúng không tách khỏi nhau khi đi qua hệ thống sắc ký. Như vậy với phương pháp UPLC-MS/MS đã xây dựng có thể tiến hành phân tích đồng thời, trực tiếp ba chất so với các điều kiện của các tài liệu đã công bố khác rút ngắn thời gian phân tích, dơn giản hóa khâu chuẩn bị mẫu. 49 Chúng tôi đã xây dựng được phương pháp LC-MS/MS dùng để định tính và định lượng các thành phần Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong thuốc tiêm CGI. Phương pháp xây dựng có độ tuyến tính rộng (từ 50% đến 150% nồng độ định lượng), thời gian phân tích ngăn, chi phí về dung môi hóa chất thấp phù hợp về mặt kinh tế cho sản xuất, và góp phần bảo vệ môi trường. Phương pháp phân tích mà chúng tôi đã xây dựng việc chuẩn bị mẫu đơn giản. Chúng tôi đã khảo sát và tìm được một hệ pha động đảm bảo tách tốt các chất trong mẫu phân tích, các pic xuất hiện cân đối. Các thành phần trong mẫu phân tích ổn định trong pha động và trong dung môi pha mẫu. Kết quả từ quá trình thực nghiệm cho thấy: chúng tôi đã tiến hành khảo sát pha mẫu trong một số loại pha động để xác định các điều kiện sắc ký và các thông số của khối phổ xong rất khó để ổn định được cả ba thành phần hoạt chất trong thuốc, nhất là thành phần L-Cystein rất nhạy cảm. 4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp phân tích định tính, định lượng đồng thời các thành phần hoạt chất: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong thuốc tiêm CGI đã được thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Asean. Các chỉ tiêu đã được thẩm định bao gồm: độ chọn lọc; độ tuyến tính; độ lặp lại; độ chính xác trung gian; độ đúng; độ sai lệch thô. Kết quả thẩm định cho thấy: Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) của phương pháp, nền mẫu và các thành phần trong dung môi sắc ký không gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích các thành phân hoạt chất trong thuốc. Kết quả đáp ứng của mẫu trắng tại các vị trí thời gian lưu các thành phần giao động từ 0,03% đến 0,50% đáp 50 ứng của mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ tương đương chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu (chọn lọc) phù hợp mục đích sử dụng. Độ tuyến tính: tiến hành thẩm định độ tuyến tính của các thành phần hoạt chất trong khoảng 50% đến 150% nồng độ định lượng có hệ số tương quan tuyến tính từ 0,9994 đến 1,0000 đạt yêu cầu đề ra. Độ lặp lại (độ chính xác trong ngày) n = 6 giá trị RSD từ 0,31% đến 1,60%; độ chính xác trung gian (độ chính xác khác ngày) n = 12 giá trị RSD từ 0,73% đến 1,69% phù hợp với yêu cầu của phép phân tích định lượng. Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi hoạt chất trung bình từ 98,70% đến 99,08%; với RSD của tỷ lệ thu hồi từ 0,77% đến 1,34% phù hợp với yêu cầu của phép phân tích định lượng. Các hoạt chất bền vững trong pha động cũng là dung môi pha mẫu. Sau 24 giờ bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng hàm lượng hoạt chất trong dung dịch mẫu thử khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với hàm lượng ban đầu ở mức tin cậy 95%. Đối chiếu với các yêu cầu quy định trong hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Asean đạt yêu cầu các chỉ tiêu đề ra. Có thể sử dụng để triển khai phân tích mẫu thực chứa các thành phần này phục vụ tiêu chuẩn hóa cũng như quản lý chất lượng thuốc lưu hành. 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau quá trình thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời các thành phần hoạt chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong chế phẩm thuốc tiêm CGI bằng phương pháp LC-MS/MS. Điều kiện cụ thể như sau: Điều kiện sắc ký: Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng; Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : dung dịch Đệm Amoni acetat 5,0 mM pH = 3,0 (35:65); Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; Thể tích tiêm: 10 µl; Nhiệt độ Autosampler: nhiệt độ phòng. Phát hiện chế độ MRM với các thông số: Cone Voltage (V) Năng lượng bắn phá (V) Chế độ ion hóa Glycin 16 22 ESI+ 76,32 29,83 Glycyrrhizin 26 32 ESI+ 840,46 453,25 Cystein 24 20 ESI+ 121,83 58,88 Chất phân tích Mảnh mẹ Mảnh con Chuẩn bị mẫu. Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động với các nồng độ: Glycyrrhizin 2 µg/ml; Glycin 20 µg/ml; Cystein 1 µg/ml. Dung dịch mẫu thử: Lấy thuốc của 5 ống, trộn đều. Hút chính xác 2,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ 100 ml. Lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên, pha loãng bằng pha động vừa đủ 20 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. 52 Đánh giá kết quả định tính, định lượng. + Định tính: so sánh thời gian lưu, mảnh khối chất phân tích trong sắc ký đồ/ phổ đồ của dung dịch thử với dung dịch mẫu chuẩn. + Định lượng: dưa vào diện tích pic của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn, dung dịch thử, nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn, thể tích và độ pha loãng của dung dịch chế phẩm tính hàm lượng % từng hoạt chất so với hàm lượng ghi trên nhãn. 2. Đã thẩm định phương pháp đầy đủ theo hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Asean và quy định của Bộ Y tế. Kết quả thẩm định cho thấy: Phương pháp đã xây dựng có độ chọn lọc cao với các thành phần hoạt chất, không bị ảnh hưởng của nền mẫu; khoảng tuyến tính rộng từ 50% đến 150% nồng độ định lượng với hệ số tương quan tuyến tính r > 0,997 đối với cả ba chất; độ lặp lại tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 2%); độ đúng cao (giá trị trung bình của độ tìm lại 98,70 đến 99,08%); dung dịch mẫu đã chuẩn bị ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ. KIẾN NGHỊ Sau khi thực hiện đề tài với những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi có một số kiến nghị sau: + Áp dụng phương pháp định tính, định lượng các thành phần hoạt chất trong chế phẩm thuốc nói trên để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đăng ký sản xuất, lưu thông tại Việt Nam. + Kỹ thuật LC-MS/MS là một kỹ thuật tiên tiến, hiện đại có những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc, thời gian phân tích ngăn. Do vậy phương pháp này cần được cân nhắc xây dựng trong các chuyên luận Dược điển trong các lần xuất bản tiếp theo. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt. 1. Trần Tử An và cs, 2010. Kiểm nghiệm dược phẩm, tập 2, tr 107 -121, 2950318, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Asean (bản Tiếng Việt). 3. Bộ Y tế, 2010. Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học. 4. Bộ Y tế, 2014. Thông tư 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2014, Hướng dẫn đăng ký thuốc. 5. Bộ Y tế, 2011. Tạp chí Y học Thực hành số 09 (782/2011). Nhà xuất bản Y Học. 6. Tào Duy Cần và cs, 2013. Thuốc và Biệt Dược, Nhà xuất bản Y học. 7. Trịnh Văn Lẩu, 2010. Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất bản Y học. 8. Trần Cao Sơn và cs, 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. 9. Phan Thị Nghĩa, 2014. Nghiên cứu định lượng Atenolol trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Luận văn Thạc sỹ dược học, trường Đại Học Dược Hà Nội. Tài liệu Tiếng Anh. 10. Amit K. De, Sripama Datta, and Arup Mukherjee. Quantitative analysis of Glycyrrhizic acid from herbal preperation using liquid chromatographic technique. Journal of advanced Pharmaceutical Technolgy & Research. Oct – Dec 2012. Doi 10.4103/22314040.104711. 11. Bristish Pharmacopoeia commission office, 2013. Bristish Pharmacopoiea 2013. 12. Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No. 6, East Rongjing Street, BDA, Beijing, 100176, P.R.China. Specification and test Method of Compound Glycyrrhizin Injection 20 ml. 13. Celine A. coiffard, Laurence j coiffard Francoise M. Peigne and Yannick M de Roeck-Halthanre, 1998. Monoamonium Glycyrrhizinate stability in anqueous buffer solution. University of Nance France (08/01/1998). 14. Eisai Enters; In-licensing Agreement with Minophagen Pharmaceutical. For Liver Disease/Allergic Disease Agents, Stronger Neo-Minophagen® C and Glycyron® Tablets. 15. Test Method for Monoammonium Glycyrrhizinate 35 mg, Glycine 25 mg, DL-Methionine 25 mg Tablets. http://www.nihs.go.jp/drug/Orange_Book_JPN 16. Univ.-Prof. Dr. Christoph Klein. Amino acid analysis in biofluids using LC-MS/MS: Method development, validation and application in clinical research and dairy science. 17. United States Pharmacopeial Convention 2012. United states of Pharmacopeia 34-NF 29. 18. Xiaoyan Chen, Dafang Zhong*, Ying Han and Zhiyong Xie, 2010. Determination of carbocysteine in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry employing precolumn derivatizationLaboratory Pharmacokinetics, of Shenyang Drug Metabolism Pharmaceutical Wenhua Road, Shenyang 110016, China. University, and 103 19. Wenyun Lu, Elizabeth Kimball, and Joshua D. Rabinowitz. A Highperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for Quantitation of Nitrogen. 20. Ahuja S, Scypinski S. Hand book of modern pharmaceutical analysis. USA. Academic Press 2005. Page 415-42. 21. Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R. Analysis and pharmacokinetics of glycyrrhizic acid in humans and experimaental animal. Steroids. 1994:59:121-6 [PubMed]. 22. Ivana Kabelová, Markéta Dvořáková, Hana Čížková, Pavel Dostálek and Karel Melzoch. Determination of free amino acids in cheeses from the Czech market. Department of Fermentation Chemistry and Bioengineering, Faculty of Food and Biochemical. PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phân tích các thành phần hoạt chất Glycin, L-Cystein, Glycyrhizin trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký khối phổ (LC-MS/MS). Điều kiện sắc ký: Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng; Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : dung dịch Đệm Amoni acetat 5,0 mM pH = 3,0 (35:65); Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; Thể tích tiêm: 10 µl; Nhiệt độ Autosampler: nhiệt độ phòng. Điều kiện khối phổ: chế độ MRM với các thông số sau. Chất phân tích Cone Voltage (V) Năng lượng Chế độ bắn phá ion hóa Mảnh mẹ Mảnh con (V) Glycin 16 22 ESI+ 76,32 29,83 Glycyrrhizin 26 32 ESI+ 840,46 453,25 Cystein 24 20 ESI+ 121,83 58,88 Chuẩn bị mẫu. Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động với các nồng độ: Glycyrrhizin 2 µg/ml; Glycin 20 µg/ml; Cystein 1 µg/ml. Dung dịch mẫu thử: Lấy thuốc của 5 ống, trộn đều. Hút chính xác 2,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ 100 ml. Lắc đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên, pha loãng bằng pha động vừa đủ 20 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Đánh giá kết quả định tính + Trên sắc ký đồ của mẫu thử phải cho các píc có cùng thời gian lưu với píc tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. + Mẫu thử phải thể hiện các mảng phổ đặc trưng của các thành phần hoạt chất cụ thể như sau: Glycin: 76,32 => 29,83 Da; L-Cystein: 121,83 => 58,88 Da; Glycyrhizin: 840,46 =>453,25 Da. Đánh giá kết quả định lượng Dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn, dung dịch thử, nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn, thể tích và độ pha loãng của dung dịch chế phẩm tính hàm lượng % từng hoạt chất so với hàm lượng ghi trên nhãn. Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 1 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Method: C:\MassLynx\Default.PRO\MethDB\CGI_240415_2.mdb 27 Apr 2015 15:22:44 Calibration: 27 Apr 2015 15:22:44 Name: Blank_ 1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:13:59, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 3.15 1.506e+002 2.42 3.94 2.17 100 0.72 1.21 100 % % 0 2.00 1.37 0.62 0.98 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.470e+002 1.60 1.00 2.89 3.88 1.93 Trace 1 1 Glycin 2 2 L-Cystein 3 3 Glycyrrhizin 0.32 % 2.00 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 4.526e+002 Glycyrrhizin 2.27 67.61 6.76e1 2.91 100 3.69 1.52 0.61 0 min 3.00 # Name test 2.67 0 min 1.00 Glycyrrhizin test min 3.00 1.00 IS Area 3.85 2.00 RT Area Response Primar... 76.332 > 29.83 0.37 4.786 4.786 bb 121.832 > 58.88 0.32 2.302 2.302 bb 840.363 > 453.338 2.27 67.609 67.609 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Blank_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:18:56, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 1.46 0.94 0.85 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.304e+002 2.71 3.12 2.38 3.91 Glycyrrhizin test 100 L-Cystein 0.32 3.69 3.69e0 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.98 1.628e+002 1.89 2.64 3.62 test MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 2.512e+002 0.06 100 1.00 1.14 1.64 3.76 2.77 3.27 3.73 3.90 0.63 % % 0 0 min 1.00 2.00 % 1.00 # Name Trace 1 1 Glycin 2 2 L-Cystein 3 3 Glycyrrhizin 0 min 3.00 2.00 3.00 min 1.00 IS Area 2.00 RT Area Response Primar... 76.332 > 29.83 0.49 0.031 0.031 bb 121.832 > 58.88 0.32 3.695 3.695 bb 840.363 > 453.338 2.36 19.514 19.514 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Blank_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:23:47, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 0.01 0.98 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 3.14 1.666e+002 2.63 1.78 3.48 2.35 3.92 % test 100 Glycyrrhizin MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.304e+002 0.76 2.24 0.14 2.49 3.69 1.09 2.17 % 0 min 1.00 2.00 3.00 test 100 0.35 0.69 0.79 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 2.87 2.508e+002 1.79 3.29 3.95 1.91 % 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 2 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Blank_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:23:47, ID: test, Description: # Name Trace 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 RT Area 0.39 2.548 IS Area Response Primar... 2.548 bb 2.18 30.756 30.756 bb Conc. %Dev Name: Chuan_50_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:28:38, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 1547.76 1.55e3 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.880e+004 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 10917.22 1.09e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.233e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 5.403e+005 Glycyrrhizin 2.29 67181.84 6.72e4 % 3.74 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 1547.755 Response Primar... 1547.755 bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 10917.215 10917.215 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 67181.844 67181.844 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_50_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:33:30, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 2114.25 2.11e3 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 2.470e+004 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 10952.11 1.10e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.203e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 5.404e+005 Glycyrrhizin 2.29 66593.33 6.66e4 % 3.75 0 0 min 1.00 2.00 3.00 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 2114.252 Response Primar... 2114.252 bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 10952.114 10952.114 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 66593.328 66593.328 bb 3.00 Conc. %Dev Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 3 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Chuan_50_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:38:21, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 2529.90 2.53e3 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 3.098e+004 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 11467.70 1.15e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.293e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 5.505e+005 Glycyrrhizin 2.29 68384.02 6.84e4 % 3.75 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 2529.895 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 min 1.00 IS Area 2.00 Response Primar... 2529.895 bb 11467.699 11467.699 bb 68384.016 68384.016 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_75_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:43:12, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 4196.53 4.20e3 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 4.896e+004 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 16515.57 1.65e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.789e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 8.134e+005 Glycyrrhizin 2.28 99927.65 9.99e4 % 3.74 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 4196.534 Response Primar... 4196.534 bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 16515.566 16515.566 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 99927.648 99927.648 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_75_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:48:04, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 5689.25 5.69e3 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 6.514e+004 % Glycyrrhizin test 100 L-Cystein 0.41 17069.29 1.71e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.864e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 8.295e+005 Glycyrrhizin 2.29 100559.12 1.01e5 % 3.76 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 4 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Chuan_75_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:48:04, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 5689.251 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 IS Area Response Primar... 5689.251 bb 17069.289 17069.289 bb 100559.117 100559.117 bb Conc. %Dev Name: Chuan_75_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:52:55, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 7487.32 7.49e3 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 8.330e+004 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 16695.61 1.67e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 1.802e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 8.177e+005 Glycyrrhizin 2.29 99776.16 9.98e4 % 3.76 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 7487.322 Response Primar... 7487.322 bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 16695.611 16695.611 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 99776.156 99776.156 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_100_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:57:46, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 10538.50 1.05e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.217e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 19749.31 1.97e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.072e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.098e+006 Glycyrrhizin 2.30 130397.56 1.30e5 % 3.76 0 0 min 1.00 2.00 3.00 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 10538.496 10538.496 Response Primar... bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 19749.311 19749.311 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 130397.563 130397.563 bb 3.00 Conc. %Dev Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 5 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Chuan_100_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:02:38, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 12910.00 1.29e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.471e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 20433.99 2.04e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.190e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.101e+006 Glycyrrhizin 2.29 131888.34 1.32e5 % 3.76 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 12909.999 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 min 1.00 IS Area 2.00 Response Primar... 12909.999 bb 20433.994 20433.994 bb 131888.344 131888.344 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_100_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:07:29, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 11537.54 1.15e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.293e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 20891.70 2.09e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.224e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.104e+006 Glycyrrhizin 2.29 132335.86 1.32e5 % 3.77 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 11537.538 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 min 1.00 IS Area 2.00 Response Primar... 11537.538 bb 20891.701 20891.701 bb 132335.859 132335.859 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_125_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:12:20, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 16929.73 1.69e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.931e+005 % Glycyrrhizin test 100 L-Cystein 0.41 24287.76 2.43e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.580e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.306e+006 Glycyrrhizin 2.29 153372.59 1.53e5 % 3.76 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 6 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Chuan_125_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:12:20, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 16929.734 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 IS Area Response Primar... 16929.734 bb 24287.756 24287.756 bb 153372.594 153372.594 bb Conc. %Dev Name: Chuan_125_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:17:11, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 17789.77 1.78e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 1.945e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 25143.44 2.51e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.745e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.299e+006 Glycyrrhizin 2.30 152612.78 1.53e5 % 3.77 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 17789.768 17789.768 Response Primar... bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 25143.438 25143.438 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 152612.781 152612.781 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_125_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:22:03, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 20118.41 2.01e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 2.221e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 23713.63 2.37e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 2.526e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.302e+006 Glycyrrhizin 2.29 152205.06 1.52e5 % 3.76 0 0 min 1.00 2.00 3.00 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 20118.412 20118.412 Response Primar... bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 23713.629 23713.629 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 152205.063 152205.063 bb 3.00 Conc. %Dev Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 7 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Chuan_150_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:26:54, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 25267.00 2.53e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 2.826e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 28846.24 2.88e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 3.028e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.593e+006 Glycyrrhizin 2.29 185119.20 1.85e5 % 3.75 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 25266.996 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 min 1.00 IS Area 2.00 Response Primar... 25266.996 bb 28846.242 28846.242 bb 185119.203 185119.203 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_150_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:31:45, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.41 26116.54 2.61e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 2.986e+005 Glycyrrhizin test 100 % L-Cystein 0.41 29684.95 2.97e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 3.205e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.590e+006 Glycyrrhizin 2.28 185413.69 1.85e5 % 3.74 0 0 min 1.00 2.00 0 min 3.00 1.00 2.00 3.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 26116.535 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 min 1.00 IS Area 2.00 Response Primar... 26116.535 bb 29684.945 29684.945 bb 185413.688 185413.688 bb 3.00 Conc. %Dev Name: Chuan_150_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:36:37, ID: test, Description: Glycin L-Cystein test 100 Glycin 0.40 29644.54 2.96e4 MRM of 4 channels,ES+ 76.332 > 29.83 3.356e+005 % Glycyrrhizin test 100 L-Cystein 0.41 29409.42 2.94e4 MRM of 4 channels,ES+ 121.832 > 58.88 3.162e+005 % test 100 MRM of 4 channels,ES+ 840.363 > 453.338 1.546e+006 Glycyrrhizin 2.29 183740.77 1.84e5 % 3.76 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 Quantify Sample Report MassLynx MassLynx SCN855 Page 8 of 10 Dataset: Untitled Last Altered: Printed: Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time Name: Chuan_150_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:36:37, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.40 29644.543 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 IS Area Response Primar... 29644.543 bb 29409.416 29409.416 bb 183740.766 183740.766 bb Conc. %Dev Name: THu_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:41:28, ID: test, Description: Glycin L-Cystein Glycyrrhizin THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+ test 76.332 > 29.83 1.889e+005 Glycin 100 0.41 16856.69 1.69e4 THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+ test 121.832 > 58.88 1.505e+005 L-Cystein 100 0.41 15684.87 1.57e4 THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+ test 840.363 > 453.338 1.319e+006 Glycyrrhizin 100 2.31 155426.08 1.55e5 % % % 3.78 0 0 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 2.00 3.00 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 16856.691 16856.691 Response Primar... bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 15684.868 15684.868 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.31 155426.078 155426.078 bb 3.00 Conc. %Dev Name: THu_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:46:19, ID: test, Description: Glycin L-Cystein Glycyrrhizin THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+ test 76.332 > 29.83 1.913e+005 Glycin 100 0.41 17835.08 1.78e4 THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+ test 121.832 > 58.88 1.514e+005 L-Cystein 100 0.41 15652.79 1.57e4 THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+ test 840.363 > 453.338 1.317e+006 Glycyrrhizin 100 2.29 156273.31 1.56e5 % % % 3.77 0 0 min 1.00 2.00 3.00 min 1.00 2.00 3.00 0 min 1.00 IS Area 2.00 # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 76.332 > 29.83 0.41 17835.082 17835.082 Response Primar... bb 2 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 15652.791 15652.791 bb 3 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 156273.313 156273.313 bb 3.00 Conc. %Dev Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time # Name Trace 1 1 Glycin 2 3 IS Area Page 1 of 11 RT Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1029.237 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 10100.721 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 63987.199 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: Std_75%_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 09:56:41, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1293.753 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 15572.046 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 96226.798 bb Name: Std_100%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:00:51, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1725.132 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 20181.395 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 128302.398 bb Name: Std_125%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:04:21, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 2155.562 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 25226.743 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 160433.997 bb Name: Std_150%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:09:11, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 2598.978 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 30309.093 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 193009.970 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 2 of 11 Name: Std_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:15:09, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1675.098 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 20181.908 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 133343.023 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: Thu_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:18:01, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1656.028 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18909.012 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 147800.092 bb Name: Thu_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:22:17, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1665.908 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18956.005 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 148778.004 bb Name: Thu_1_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:25:11, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1675.008 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18856.605 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 147878.004 bb Name: Thu_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:29:01, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1599.099 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18933.056 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 147725.896 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 3 of 11 Name: Thu_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:33:17, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1589.076 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18956.044 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 147738.056 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: Thu_2_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:37:11, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1585.977 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18955.861 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 147895.328 bb Name: Thu_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:40:01, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1609.567 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18704.967 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 148405.955 bb Name: Thu_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:43:55, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1692.008 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18723.888 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 152654.675 bb Name: Thu_3_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:47:59, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1688.066 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 18733.876 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 153224.091 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 4 of 11 Name: Thu_4_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:01:31, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,39 1649.009 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18999.034 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 148829.922 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: Thu_4_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:04:55, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1650.554 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18893.099 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 147985.044 bb Name: Thu_4_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:08:59, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1674.097 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 189878.933 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 147888.915 bb Name: Thu_5_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:12:31, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,39 1598.656 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18740.981 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 147836.632 bb Name: Thu_5_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:15:05, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1609.523 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18861.098 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 148665.236 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 5 of 11 Name: Thu_5_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:18:58, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1599.733 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18667.944 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 147789.656 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: Thu_6_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:22:31, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,39 1645.554 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18678.563 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 147749.654 bb Name: Thu_6_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:25:05, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1655.522 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18766.955 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 147452.311 bb Name: Thu_6_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:28:58, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1667.538 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18677.933 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 148003.944 bb Name: Std_dd_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:33:11, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1689.882 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 20891.092 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 132335.647 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 6 of 11 Name: Std_dd_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:36:09, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1688.821 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 20887.992 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 133772.983 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: DD_80_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:39:01, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1296.219 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 12754.811 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 124340.735 bb Name: DD_80_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:42:17, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1299.291 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 12667.982 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 124652.452 bb Name: DD_80_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:45:11, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1292.821 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 12533.721 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 123347.731 bb Name: DD_80_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:49:01, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1289.129 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 12453.762 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 122939.839 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 7 of 11 Name: DD_80_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:53:17, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1328.912 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 12509.362 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 124330.647 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: DD_80_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:57:11, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1302.112 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 12548.933 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 124536.527 bb Name: DD_100_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:01:01, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1615.237 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 15681.083 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 156578.738 bb Name: DD_100_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:04:55, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1617.829 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 15762.351 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 156837.922 bb Name: DD_100_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:08:09, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1642.367 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.40 16349.362 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.29 156067.637 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 8 of 11 Name: DD_100_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:12:31, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,39 1623.872 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 16352.831 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 157002.811 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: DD_100_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:15:38, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1677.361 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 16387.372 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 155411.927 bb Name: DD_100_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:18:59, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1679.728 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 16427.356 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 156001.273 bb Name: DD_120_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:22:31, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,39 1989.736 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18614.263 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 187665.367 bb Name: DD_120_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:25:53, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1899.920 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18728.293 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 188367.352 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 9 of 11 Name: DD_120_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:28:58, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 1989.921 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18609.293 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 188664.722 bb Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Conc. %Dev Name: DD_120_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:32:31, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,39 1981.828 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.41 18677.920 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 187998.723 bb Name: DD_120_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:36:05, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,41 1965.728 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18860.362 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.28 178933.027 bb Name: DD_120_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:40:18, ID: test, Description: # Name Trace RT Area 1 1 Glycin 2 3 IS Area Primar… 76.332 > 29.83 0,40 2977.822 bb 2 L-Cystein 121.832 > 58.88 0.39 18799.262 bb 3 Glycyrrhizin 840.363 > 453.338 2.30 177927.712 bb Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855 Dataset: Untitled Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time Page 10 of 11 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lâp - Tự do – Hạnh phúc BÁO CÁO SỬA CHỮA LUẬN VĂN DSCK CẤP I KHÓA 16 Kính gửi: - Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I; - Phòng Sau đại học Trường đại học Dược Hà Nội; - Giáo viên hướng dẫn. Họ và tên học viên: Trịnh Lê Anh Tên đề tài: Nghiên cứu nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc tiêm CGI. Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc. Mã số: Đã bảo vệ luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I vào hồi: 8 giờ 30 phút ngày 13 tháng 9 năm 2015 tại thành phố Thanh Hóa. Quyết định số: 611/QĐ-DHN ngày 07 tháng 8 năm 2015 của Hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà Nội. NỘI DUNG SỬA CHỮA, HOÀN CHỈNH 1. Những nội dung đã được sửa chữa theo yêu cầu của Hội đồng:  Tên luận văn chưa phù hợp với nội dung: + Đổi lại tên mới: “Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”.  Cần nêu rõ nguồn gốc của thuốc tiêm CGI: + Đã bổ xung thêm nguồn gốc thuốc tiêm CGI vào trong luận văn.  Cách viết tài liệu tham khảo chưa đúng, một số tài liệu tham khảo đã quá cũ. + Lược bỏ một số tài liệu tham khảo đã cũ của luận văn. Viết lại các tài liệu tham khảo theo đúng quy định về trình bày tài liệu tham khảo của luận văn tốt nghiệp, nghiên cứu khoa học.  Sửa từ “Độ thô” thành “Độ vững”. + Đã sửa lại.  Trang 22: xem lại lượng cân và nồng độ của dung dịch chuẩn. + Đã xem xét lại và hiệu chỉnh các lượng cân mẫu phù hợp.  Bàn luận cần so sánh với các kết quả đã công bố. + Bổ sung bàn luận so sánh giữa kết quả định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS và kết quả định lượng bằng phương phương pháp đã xây dựng trong TCCS của chế phẩm.  Nội dung chưa đề cập đến phương pháp phân tích định tính. + Bổ sung thêm phần định tính.  Nên có phụ lục về quy trình phân tích. + Đã bổ sung quy trình phân tích định tính và định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LCMS/MS.  Còn một số lỗi chính tả.  + Đã đính chính các lỗi chính tả. 2. Những nội dung xin bảo lưu: Không có. Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2015 Xác nhận của cán bộ hướng dẫn Học viên Trịnh Lê Anh PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN Ủy viên thư ký Hội đồng TS. Nguyễn Trần Linh Chủ tịch Hội đồng PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện [...]... trng; - Tan tt trong nc; tan trong ethanol, khú tan trong methylen clorid, khụng tan trong ether [14] Glycin O OH NH2 Hỡnh 1.2 Cụng thc cu to ca Glycin - Cụng thc phõn t: C2H5NO2; Cụng thc cu to: H2N-CH2-COOH; Trng lng phõn t: 75,07 g/mol; Tờn khoa hc: Acid aminoacetic; Bt kt tinh mu trng, v ngt; Tan tt trong nc; tan trong c mụi trng acid v mụi trng kim, tan trong ethanol, khụng tan trong ether [4],... t: 157,62 g/mol; Tờn khoa hc: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid; 4 - Bt kt tinh mu trng; - Tan tt trong nc; tan trong c mụi trng acid v mụi trng kim, tan trong ethanol, khụng tan trong cỏc dung mụi hu c ớt phõn cc [4], [13], [18] 1.1.3 Tỏc dng dc lý, dc ng hc, ch nh, chng ch nh thuc tiờm CGI Dc lc hc [15] + Tỏc dng chng viờm: c ch cỏc enzym chuyn húa acid arachidonic: Glycyrrhizin cú th liờn... kali mỏu + Ph n cú thai hoc nuụi con bỳ 6 1.1.4 Phng phỏp nh lng cỏc hot cht trong thuc tiờm CGI Trờn th gii ó cú nhiu ti liu cụng b v cỏc phng phỏp nh tớnh, nh lng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khỏc nhau bng cỏc k thut: sc ký lng [11], [13], [16]; chun th tớch [12], [13], [18]; sc ký lng khi ph [19], [17], [22] Tuy thuc CGI ó c sn xut ti Nht Bn, Trung Quc v s dng ti nhiu ni trờn th gii, xong cha... sc ký (HPLC) vi kh nng phõn tớch khi ca h thng khi ph Sc ký lng hiu nng cao l mt h thng cú vai trũ tỏch cỏc cht da trờn s khỏc nhau v cỏc tớnh cht húa lý ca chỳng [4] Khi ph l k thut o trc tip t s khi lng v in tớch ca ion (m/z) c to thnh trong pha khớ t phõn t hoc nguyờn t ca mu da trờn s chuyn ng ca cỏc ion nguyờn t hay ion phõn t trong mt in trng hoc mt t trng nht nh [18], [13] 1.2.2 H thng sc ký. .. thng sc ký lng khi ph loi t cc chp ba (Triple Quadrupole) hay cũn gi l khi ph hai ln (MS/MS) c s dng nhiu trong cụng tỏc nghiờn cu, kim tra cht lng thuc, nht l nh lng thuc trong dch sinh hc, nghiờn cu tng ng sinh hc, nghiờn cu nh lng cỏc thuc cú thnh phn phc tp vỡ thit b cú nhy, chn lc cao Trong cỏc kiu hỡnh thnh ion, k thut phun in t ESI (Electrospray Ionazition ESI) c s dng nhiu hn c Trong nghiờn... ti trong mu th Thụng thng gm: cỏc tp cht, sn phm phõn hy, cht nn Trong LC-MS, tớnh c hiu c th hin khi kt qu thu c trờn sc ký mu th cho thy pic ca cht cn phõn tớch c phõn tỏch v nhn din rừ rng T l ỏp ng ca mu trng ti v trớ cỏc pic ca cht phõn tớch khụng c vt quỏ 2% 1.3.2 tuyn tớnh tuyn tớnh ca mt qui trỡnh phõn tớch din t ỏp ng phõn tớch thu c t l vi nng (trong khong nht nh) ca cht phõn tớch trong. ..Chng 1 TNG QUAN 1.1 THUC TIấM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION (CGI) 1.1.1 Ngun gc v cụng thc bo ch ca thuc tiờm CGI + Ngun gc: Thuc tiờm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) c sn xut bi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No.7 Rongchang East Street, BDA, Beijing, China + Cụng thc bo ch 20 ml dung dch tiờm CGI: Monoamoni Glycyrrhizinate tng ng Acid Glycyrrhizin 40 mg Glycin 400... cao Khi trong cụng thc cú thờm cỏc thnh phn tỏ dc cú tỏc dng m pH, nn mu phc tp phng phỏp s gp sai s hoc khụng tin hnh c 7 Hot cht Cystein dng nguyờn liu mt s dc in ó xõy dng phng phỏp nh lng bng chun oxy húa kh, trong ú cht phõn tớch c hũa tan trong nc ri chun bng dung dch iod 0,1N phng phỏp tha tr hoc chun trc tip vi ch th h tinh bt [13]; [16]; [18] Phng phỏp ny da vo tớnh kh ca nhúm -SH trong phõn... Glycyrrhizin trong ch phm thuc tiờm CGI c xõy dng phng phỏp nh lng bng sc ký lng hiu nng cao vi detector UV bc súng 252 nm; hoc detector PDA vi bc súng ly pic l 252 nm [12] Krọhenbỹhl S, Hasler F, Krapf R ó tin hnh nh lng acid Glycyrrhizin v cỏc cht chuyn húa ca Acid Glycyrrhizin bng phng phỏp LC-MS/MS, khong nng thp khong 1-2 àg/ml [22] 8 1.2 SC Kí LNG - KHI PH (LC-MS) 1.2.1 Khỏi nim Sc ký lng khi... t mc gn nhau (mc phõn tỏn) gia mt dóy kt qu thu c ca cỏc mu th c chun b t mt mu ng nht trong iu kin ó ra chớnh xỏc chia lm 3 cp: lp li, chớnh xỏc trung gian v tỏi lp lp li lp li din t chớnh xỏc ca quy trỡnh phõn tớch tin hnh trong cựng iu kin thớ nghim trong khong thi gian ngn lp li biu th chớnh xỏc trong nh lng Thng c tin hnh trờn 3 nng khỏc nhau, mi nng 3 ln (suy ra t ỳng) Cng cú th ... Lờ Anh DANH MC CC CH VIT TT CGI : Thuc tiờm Compound Glycyrrhizin Injection ESI : Ch ion húa bng phun in t HPLC : Sc ký lng hiu nng cao LC : Sc ký lng LC-MS/MS : Sc ký lng ph ln m/z : Khi lng/... 3.7 Sc ký mu chun Glycin v mu trng 32 Hỡnh 3.8 Sc ký mu chun Glycyrrhizin v mu trng 32 Hỡnh 3.9 Sc ký mu chun L-Cystein v mu trng 33 T VN Thuc tiờm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) cha... Cỏc sc ký c trỡnh by cỏc hỡnh 3.7; 3.8; 3.9 Kt qu t l ỏp ng pic c trỡnh by bng 3.3 Hỡnh 3.7 Sc ký mu chun Glycin v mu trng Hỡnh 3.8 Sc ký mu chun Glycyrrhizin v mu trng 32 Hỡnh 3.9 Sc ký mu