Phương pháp UPLC-MS/MS mới được đưa vào ứng dụng tại Việt Nam với những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc và độ đặc hiệu. Chính vì vậy phương pháp được ứng dụng ngày càng nhiều trong các nghiên cứu như: định lượng thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh học, theo dõi quá trình điều trị, nghiên cứu sinh dược học, đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học của thuốc.
Thuốc tiêm CGI trong 20 ml dung dịch chứa: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein 20 mg. Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bố phương pháp định lượng riêng lẻ từng thành phần của thuốc.
Đối với thành phần glycyrrhizin là một hoạt chất chiết từ cây cam thảo có vị ngọt có tính chất của saponin. Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng glycyrrhizin bằng phương pháp HLPC với detector UV-VIS [13]. Theo chuyên luận của Dược điển Châu Âu EP 5.0 xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất monoamoni glycyrhinat bằng phương pháp chuẩn độ môi trường khan với mức chỉ tiêu chất lượng yêu cầu từ 98,0% đến 102,0%, cũng trong tiêu chuẩn này quy định hàm lượng tạp chất liên quan không được quá 17%. Điều này cho thấy phương pháp định lượng hoạt chất mà EP 5.0 xây dựng không đảm bảo độ đặc hiệu dẫn đến mâu thuẫn giữa hai chỉ tiêu chất lượng.
Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng Glycin bằng phương pháp chuẩn độ trung hòa, phương pháp dùng formol để định lượng acid amin. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản xong không đặc hiệu [13].
L-cystein là một acid amin có chứa nhóm -SH là nhóm mang tính khử, Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất này bằng phương pháp chuẩn độ Bromid. Phương pháp này tiến hành dễ dàng,
49
đơn giản xong độ đặc hiệu không cao, có thể định lượng nhầm một số thành phần khác có mặt trong công thức hoặc khi hoạt chất đã bị biến đổi nhưng vẫn mang tính khử.
Hai thành phần acid amin trong công thức là glycin; L-cystein là những chất không hấp thụ tia UV nên việc định lượng chúng trong các thuốc gặp nhiều khó khăn, thông thường để định lượng các hoạt chất này bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC người ta phải tạo dẫn chất của chúng và sử dụng các detector huỳnh quang, hoặc detector UV. Có hai phương pháp để tạo dẫn chất đó là: tạo dẫn chất trước cột, phương pháp này có độ lặp lại và ổn định không cao; tạo dẫn chất sau cột phương pháp này ổn định hơn xong lại cần thêm thiết bị phụ kiện và thuốc thử dùng cũng đắt tiền.
Với phương pháp HPLC thông thường để định lượng đồng thời hai thành phần Glycin và L-Cystein phải dùng cột chuyên dùng để phân tích các acid amin xong khả năng tách Glycin và L-cystein ra khỏi nhau là rất khó, hai pic khó đạt yêu cầu về độ phân giải.
Với hệ thống UPLC chịu được áp suất cao, chúng tôi đã sử dụng cột phân tích có khả năng phân tích tốt, cỡ hạt nhồi bé 1,8 µm xong hai pic Glycin và L-Cystein vẫn không tách khỏi nhau, thời gian lưu trùng nhau hoàn toàn 0,41 phút. Với sự hỗ trợ của detector khối phổ, chọn chế độ MRM (Multi Reaction Monitoring) tín hiệu của pic Glycin và L-Cystein được tách riêng và ghi thành hai kênh khác nhau nên vẫn có thể định lượng riêng từng thành phần cho dù chúng không tách khỏi nhau khi đi qua hệ thống sắc ký. Như vậy với phương pháp UPLC-MS/MS đã xây dựng có thể tiến hành phân tích đồng thời, trực tiếp ba chất so với các điều kiện của các tài liệu đã công bố khác rút ngắn thời gian phân tích, dơn giản hóa khâu chuẩn bị mẫu.
50
Chúng tôi đã xây dựng được phương pháp LC-MS/MS dùng để định tính và định lượng các thành phần Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong thuốc tiêm CGI. Phương pháp xây dựng có độ tuyến tính rộng (từ 50% đến 150% nồng độ định lượng), thời gian phân tích ngăn, chi phí về dung môi hóa chất thấp phù hợp về mặt kinh tế cho sản xuất, và góp phần bảo vệ môi trường.
Phương pháp phân tích mà chúng tôi đã xây dựng việc chuẩn bị mẫu đơn giản. Chúng tôi đã khảo sát và tìm được một hệ pha động đảm bảo tách tốt các chất trong mẫu phân tích, các pic xuất hiện cân đối. Các thành phần trong mẫu phân tích ổn định trong pha động và trong dung môi pha mẫu.
Kết quả từ quá trình thực nghiệm cho thấy: chúng tôi đã tiến hành khảo sát pha mẫu trong một số loại pha động để xác định các điều kiện sắc ký và các thông số của khối phổ xong rất khó để ổn định được cả ba thành phần hoạt chất trong thuốc, nhất là thành phần L-Cystein rất nhạy cảm.