Chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng như sau:
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Chuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừa đủ 100 ml.
22
Dung dịch chuẩn Cystein làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ: 1,078 µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Chuẩn gốc Monoamoni glycyrrhizinat: cân 0,0165 g chuẩn Glycyrrhizin, pha trong nước vừa đủ 100 ml.
Dung dịch chuẩn Monoamoni glycyrrhizinat làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Glycyrhizin tương ứng: 2,0µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừa đủ 100 ml.
Dung dịch chuẩn Glycin làm việc: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml được dung dịch có nồng độ: 20,873µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Chuẩn bị mẫu thử:
Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml.
Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Mẫu trắng: Có chứa các thành phần tá dược, không chứa các thành
phần chất phân tích. Chuẩn bị như mẫu thử.
Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Asean [3].
Tính chọn lọc
Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 lần phân tích mẫu placebo tương ứng với từng thành phần của thuốc và thành phần chuẩn đơn lẻ. Tiến hành ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng với mẫu chuẩn tại vị trí thơi gian lưu của chuẩn [3].
23
Khoảng nồng độ tuyến tính
Pha một dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp ban thành phần có nồng độ khác nhau tương ứng 50%; 75%; 100%; 125%; 150% nồng độ định lượng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ hoạt chất và diện tích píc đáp ứng [3].
Độ chính xác
- Độ lặp lại
Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng một ngày, cùng một kiểm nghiệm viên, cùng thiết bị. Tính toán kết quả và đánh giá độ lặp lại của phương pháp [3].
- Độ chính xác trung gian
Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng ngày hôm sau, với kiểm nghiệm viên khác, sử dụng cột phân tích khác. Tính toán kết quả và đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp bằng cách so sánh kết quả phân tích của hai kiểm nghiệm viên trong hai ngày [3].
Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được tiến hành bằng cách phân tích mẫu tự tạo bằng cách thêm chuẩn vào mẫu placebo số 1 ở ba khoảng nồng độ 80%; 100% và 120% nồng độ định lượng. Mỗi nồng độ được tiến hành độc lập 03 mẫu. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, tính toán kết quả. Độ đúng được đánh giá dựa trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượng được so với nồng độ thực của mẫu [3].
Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích
Mẫu thử được chuẩn bị trong phần thẩm định độ lặp lại của phương pháp được giữ lại bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ phân tích lại. So
24
sánh với kết quả ban đầu để đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong điều kiện phân tích [3].