của thuốc tiêm CGI
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong pha động có nồng độ: + Glycyrrhizin: 2 µg/ml;
+ Glycin: 20 µg/ml; + Cystein: 1 µg/ml.
Cố định pha tĩnh là cột C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát với các pha động:
+ Pha động 1: Methanol : dung dịch acid formic 0,1% (90:10); + Pha động 2: Acetonitril : dung dịch acid formic 0,1% (90:10); + Pha động 3: Methanol : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10); + Pha động 4: Acetonitril : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10); + Pha động 5: Methanol : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0 (90 : 10);
+ Pha động 6: Acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0 (90 : 10);
Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy:
Đối với pha động số 1; số 2 có chứa thành phần acid formic thành phần Cystein không ổn định trong pha động, bị phân hủy.
Đối với pha động số 3; số 4 có chứa thành phần acid tricloacetic ở chế độ khối phổ của thành phần Cystein đường nền đáp ứng rất cao 105 vì acid tricloacetic gây nhiễu đường nền ở mảnh con 58,9 Da; dẫn đến độ nhạy thấp không đáp ứng yêu cầu.
30
Đối với pha động số 5; số 6 các thành phần hoạt chất ổn định trong pha động, đường nền ổn định và giá trị S/N cao, phù hợp cho phép phân tích.
So sánh giữa pha động số 5 và số 6 chúng tôi thấy pha động số 6 các pic cân đối và ít bị kéo chân hơn. Từ kết quả khảo sát sơ bộ chúng tôi chọn pha động số 6 với thành phần acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0.
Tiến hành khảo sát sâu hơn bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần của pha động số 6. Nếu tăng thành phần acetonitril lên pic Glycyrrhizin sẽ ra sớm hơn, thời gian lưu của Glycin và Cystein gần như không ảnh hưởng. Ở tỷ lệ pha động acetonitril : dung dịch đệm amoni actetat 5mM pH=3,0 (35 : 65), các pic tách nhau rõ ràng, thời gian lưu của Glycyrrhizin 2,2 phút.
Giữ nguyên thành phần pha động thay đổi tốc độ dòng, khi tốc độ dòng 0,2 ml/phút, pic Glycyrrhizin bị kéo chân; khi tốc độ dòng tăng lên 0,4 ml/phút pic Glycyrrhizin ra sớm hơn xong áp suất hệ thống tăng cao, vì vậy chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút là phù hợp và đáp ứng yêu cầu.
Giữ nguyên tốc độ và thành phần pha động, khảo sát trên cột dài hơn C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) pic Glycyrrhizin bị lưu giữ rất lâu tR = 7 – 8 phút, phải chạy chế độ Gradien tăng lượng acetonitril pic mới rửa giải ở tR khoảng 4 - 6 phút.
Từ các kết quả khảo sát chúng tôi quyết định sử dụng hệ sắc ký khối phổ với các điều kiện như sau để định lượng đồng thời các thành phần trong thuốc tiêm CGI:
Điều kiện sắc ký.
Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm);
Pha động: Hỗn hợp acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH = 3,0 (35:65);
Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; Thể tích tiêm: 10 µl;
31
Điều kiện khối phổ.
ion hóa bằng phun điện tử ion dương (ESI+); Chọn chế độ phát hiện MRM với các thông số sau:
Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI.
Thành phần Mảnh mẹ m/z Cone Voltage (V) Mảnh con m/z Năng lượng bắn phá (V) Chế độ ion hóa Glycin 76,32 16 29,83 22 ESI+ Glycyrrhizin 840,46 26 453,25 32 ESI+ Cystein 121,83 24 58,88 20 ESI+
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động có nồng độ: + Glycyrrhizin 2 µg/ml;
+ Glycin 20 µg/ml; + Cystein 1 µg/ml.
Mẫu thử được pha trong pha động để có nồng độ các thành phần tương đương với mẫu chuẩn.