BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) phân tích hàm lượng 3 MCPD trong nước tương BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký KHÍ KHỐI PHỔ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Ý BÁO CÁO DƯỢC PHÂN TÍCH Đề tài: XÁC ĐỊNH 3-MCPD TRONG NƯỚC TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ-KHỐI PHỔ GVHD: SV: NỘI DUNG: I ĐẶT VẤN ĐỀ I.1 Tình hình nước tương có chứa 3-MCPD giới I.2 Tình hình nhiễm 3-MCPD nước tương thị trường Việt Nam II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP II.1 Đối tượng II.2 Phương pháp II.2.1 Nguyên lý II.2.2 Dấu hiệu nhận biết 3-MCPD a.Công thức cấu tạo b.Tính chất vật lý c Tính chất hóa học d.Ảnh hưởng 3MCPD II.2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất II.2.4 Cách tiến hành III TÍNH TỐN IV NHẬN XÉT QUÁ TRÌNH V PHỤ LỤC VI TÀI LIỆU THAM KHẢO I ĐẶT VẤN ĐỀ Thực phẩm yếu tố quan trọng song hành với sinh tồn loài người Theo q trình tiến hố phát triển lồi người, thực phẩm phát triển theo Cùng với tiến triển khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm phát triển Nguy tác hại đến sức khoẻ thực phẩm từ nguồn thức ăn thơ nguy tự nhiên đến từ thành phần chứa thực phẩm tạp nhiễm môi trường, biến đổi theo quy trình chế biến thực phẩm công nghiệp tạp nhiễm phát sinh Nhu cầu thực phẩm đáp ứng dinh dưỡng mà cịn tính an tồn khơng gây hại cho sức khoẻ người tiêu dùng cần thiết Vì mà kỹ thuật đánh giá mối nguy hại thực phẩm sức khoẻ đòi hỏi phải phát triển để bắt kịp với công nghệ chế biến thức ăn ngày cao đa dạng, nhằm phát loại trừ bớt nguy tác hại đến thể người tiêu dùng Đánh giá nguy tác hại đến sức khoẻ 3-MCPD hoá chất sản sinh khâu chế biến sản phẩm xì dầu nước tương dầu hào, vấn đề người tiêu dùng quan tâm Tình hình nước tương có chứa 3-MCPD giới Năm 2001, WHO quy định thể tiêu thụ tối đa 2µg/kg trọng lượng Do tình hình tiêu thụ sản phẩm có chứa 3-MCPD vùng , nước khác nên có nồng độ cho phép diện chất khác Quốc gia Nồng độ 3-mcpd cho phép 1kg nước tương (mg/kg) Canada, Phần Lan, Áo, tiểu 1,0 vương quốc Ả Rập Mỹ 1,0 Úc, Newzealand 0,2 Hà Lan,Bồ Đào 0,02 Nha,Malaysia,Thụy Điển Anh 0,01 Việt Nam 1,0 Tình hình nhiễm 3-MCPD nước tương thị trường Việt Nam - Cho đến 11/2001, lần Việt Nam kiểm nghiệm 3-mcpd tiến hành xác định nồng độ chất có mặt số sản phẩm nước tương thị trường Việt Nam cao ngưỡng cho phép nhiều Hàm lượng cao mức cho phép từ lần đến 2.215 lần - Năm 2007 10/14 mẫu có chứa chất 3-MCPD vượt mức cho phép (mức cao 4.202 lần thấp 1,65 lần) - Đà nẵng: từ 38,7 - 49,17mg/kg, gấp 38 - 49 lần mức cho phép II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng : nước tương dầu hào Phương pháp: Xác định hàm lượng 3-monoclo propan-1,2-diol (3-MCPD) sắc ký khí/khối phổ Gas Chromatography Mass Spectometry (GC/MS) Tương tự hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ bao gồm phận: nguồn cung cấp khí, lị cột, phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dị, phận ghi nhận tín hiệu, phận in liệu phân tích; đó, đầu dị đầu dò khối phổ Các cấu tử mẫu sau tách khỏi cột mao quản vào đầu dò khối phổ Tại đây, tùy thuộc vào chất chất cần phân tích, diễn q trình ion hóa với kiểu ion hóa khác (API, ESI hay APPI), sau ion ghi nhận đầu dị Sắc ký khí (GC): Cửa tiêm mẫu (injection port): 1µl dung mơi chứa hỗn hợp chất tiêm vào hệ thống cửa Mẫu sau dẫn qua hệ thống khí trơ, thường helium Nhiệt độ cửa tiêm mẫu nâng lên 3000 C để mẫu trở thành dạng khí Vỏ ngồi (Oven): Phần vỏ hệ thống GC lị nung đặc biệt Nhiệt độ lò dao động dao động từ 400 C 3200C Cột nhồi ( column): Bên hệ thống GC cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt tráng loại polymer đặc biệt Các chất hỗn hợp phân tách chạy dọc theo cột Khối phổ (MS): Được dùng để xác định loại chất hóa học dựa cấu trúc Nguồn Ion( Ion source): Sau qua cột sắc ký khí, hóa chất tiếp tục vào pha khối phổ Các phân tử phải qua luồng electrons chúng bị phân chia thành mảnh nhỏ tích điện dương Các mảnh gọi ion Điều quan trọng hạt cần trạng thái điện tích qua lọc Bộ lọc (Filter): Khi ion di chuyển phận khối phổ, dựa khối lượng mà chúng sàng lọc trường điện từ Bộ lọc có khả lựa chọn, tức cho phép hạt có khối lượng nằm giới hạn định qua Bộ cảm biến (detecter) : Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng hạt có khối lượng Thơng tin sau chuyển đến máy tính Tại phép tính thực xuất kết gọi khối phổ (mass spectrum) Khối phổ biểu đồ phản ánh số lượng hạt ion với khối lượng khác qua lọc Máy tính: Bộ phận chịu trách nhiệm tính tốn tín hiệu cảm ứng cung cấp đưa kết khối phổ 2.1 Nguyên lý: Mẫu cho hấp phụ qua cột extrelut, giải hấp 3-MCPD dietyl ête Sau cho tạo dẫn xuất với dung dịch acid toluen-4-sulfonic aceton thành 4-(clometyl)-2,2-dimetyl-1,3dioxolan, phản ứng thực 40oC, 90 phút Sau đo máy sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS) - Giới hạn phát phương pháp: 4,01 ppb; Giới hạn định lượng: 13,37ppb 2.2 Dấu hiệu nhận biết 3MCPD a Công thức cấu tạo: 3-MCPD(3-monochloropropane-1,2-diol) Thuộc nhóm chlorapropanols CT: C3H7O2Cl b   Tính chất vật lí Chất lỏng khơng màu có vị Nhiệt độ nóng chảy: -63oC    Nhiệt độ sôi: 61oC Chiết suất: 1,4459 200C, 589 nm Tỷ trọng: 1,48 g / cm3 c Tính chất hố học  Phân hủy bị chiếu sáng  Không có khả phản ứng với hợp chất peroxyde, kiềm mạnh, kim loại Mg, Al tác nhân oxi hóa mạnh  Tạo phức với Cu điều kiện thường tạo thành hợp chất màu xanh đặc trưng d Ảnh hưởng 3MCPD người động vật: Phần lớn nghiên cứu độc tính chất 3-MCPD thực động vật, vi sinh vật dòng tế bào chuẩn, thí nghiệm động vật cho thấy, 3-MCPD gây hại đến hầu hết quan cản trở thể sản xuất testosterol dẫn đến giảm khả tình dục, làm teo tinh hoàn, xuất u hạt viêm, gây bệnh thận mãn tính, tăng đường niệu, giảm tế bào máu suy tủy, tăng nguy ung thư vú giống đực, có khả nắng gây ung thư, làm thay đổi q trình nhân gene - Khi vào thể người, 3-MCPD biến đổi thành số chất khác, tất chúng gây nguy hiểm cho sức khoẻ người II.2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất a Dụng cụ - Cân phân tích (chính xác đến mg) - Bình định mức 100ml, 50ml, 20ml, 10ml - Bình cầu cất 250ml - Cốc thủy tinh 10ml, 50ml, 100ml - Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml - Ống thủy tinh có nắp vặn 5ml, 10ml - Xylanh, Đũa thủy tinh - Phễu lọc, giấy lọc b Thiết bị i Bộ cất quay chân khơng ii Hệ thống máy sắc ký khí khối phổ  Yêu cầu hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC/MS): Có thể sử dụng hệ thống Trace GC-Trace MS Plus (Hãng sản xuất Thermo Finigan) hệ thống máy sắc ký khí khối phổ tương đương với cấu hình kỹ thuật tối thiểu: - Đầu dị khối phổ Bộ phận tiêm mẫu chia/ khơng chia dịng (Split/ Splitless Injector), chương trình nhiệt độ (PTV Injector: Programmed Temperature Vaporation Injector) - Cột sắc ký mao quản SPB – 1701, dài 30m, đường kính 0.25mm, lớp film 0.25m - Máy tính điều khiển thiết bị xử lý liệu  Điều kiện chạy máy: Điều kiện sắc ký: - Chương trình nhiệt độ cột : + Nhiệt độ đầu 45oC, giữ phút; + Sau tăng lên 120oC với tốc độ gia nhiệt 6oC/ phút; + Tiếp tục tăng nhiệt độ lên đến 250oC; với tốc độ gia nhiệt 15oC / phút, giữ nhiệt độ phút; - Tiêm mẫu : Tiêm mẫu với chế độ khơng chia dịng + Nhiệt độ phận tiêm mẫu : 250oC + Thể tích mẫu tiêm : - Tốc độ khí mang He : 2l 1,5 ml/phút Điều kiện khối phổ: * MS Tune file: + Nguồn Ion hóa : EI + Năng lượng ion hóa : 70eV + Nhiệt độ nguồn ion : 180oC 200oC + Nhiệt độ Interface: + Giá trị khuếch đại Multiplier : 300 – 500V * MS method - Chế độ quét Fullscan + Thời gian quét : - 15 phút + Khoảng khối quét : 35 - 150 amu - Chế độ quét Ion chọn lọc SIM ( Selected Ion Monitoring) + Số khối lựa chọn để quét: 135 +Thời gian quét : – 10 phút c Hóa chất, thuốc thử  Hố chất, thuốc thử Hóa chất sử dụng có độ tinh khiết phân tích (TKPT); dung mơi dung mơi dùng cho sắc ký a) Chất chuẩn 3-MCPD b) Diethyl ete loại dùng cho sắc ký c) Aceton loại dùng cho sắc ký d) Acid toluen -4-Sulfonic đ) Ethyl acetat loại dùng cho sắc ký e) Cột Extrelut: Dùng xylanh 60ml, nhồi bơng thủy tinh vào đầu ống xylanh Sau cho từ từ 10g hạt Extrelut vào xy lanh, dùng đũa thủy tinh gõ nhẹ vào thành ống cho hạt xuống chặt g) Natri clorua: Dung dịch bão hoà nước h) Khí Nitơ 99,999% i) Khí Hêli 99,999%  Pha chế dung dịch a) Dung dịch acid toluen - - sulfonic Aceton (1g/L): Cân xác 0,1000g acid toluen - - sulfonic (3.3.1.d) cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch aceton, lắc b) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 100ppm: Cân xác 0,0100g 3-MCPD cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch ethyl acetat, lắc c) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 10ppm: Hút 1ml dung dịch 3-MCPD 100ppm vào bình định mức 10ml Định mức đến vạch ethyl acetat, lắc d) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 200ppb: Hút 1ml dung dịch 3-MCPD 10ppm vào bình định mức 50ml Định mức đến vạch ethyl acetat, lắc đ) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 20ppb: Hút 2ml dung dịch 3-MCPD 200ppb vào bình định mức 20ml Định mức đến vạch ethyl acetat, lắc Các dung dịch chuẩn bảo quản tủ lạnh II.2.4 TIẾN HÀNH XÁC ĐỊNH a Chuẩn bị mẫu Cân 4g mẫu, xác đến 0,001g vào cốc thủy tinh 50ml Thêm vào 8g dung dịch NaCl bão hịa, khuấy Cho tồn dung dịch vào cột extrelut Để ổn định 15 phút cho toàn nước chất dung dịch phân bố bề mặt hạt extrelut Rửa giải 3-MCPD 150ml dietyl ête Thu dịch rửa giải vào bình cầu cất Sau đem quay chân khơng đến gần cạn, dùng khí nitơ thổi khơ b Dẫn xuất hóa Dùng pipet hút xác 2ml dung dịch acid Toluen-4-sulfonic aceton (1g/L) vào bình cầu cất, lắc chuyển tồn dung dịch vào ống nghiệm có nút Đặt ống nghiệm vào bếp cách thủy 40oC 90 phút, lấy để nguội nhiệt độ phịng, sau chuyển vào chai 1,5ml để đo máy GC/MS (dịch thử) c Chuẩn bị mẫu chuẩn Các mẫu chuẩn theo nồng độ xác định chuẩn bị, cụ thể theo bước bảng sau: Bảng : Chuẩn bị mẫu chuẩn 3-MCPD chuẩn (20ppb) cho vào cột extrelut Dung dịch sau rửa giải dietyl ête ống 1ml ống 2ml ống 6ml Cô quay chân không đến gần cạn, thổi khơ khí Nitơ Dung dịch acid Toluen-4-Sulfonic aceton (1g/L) Nồng độ 3-MCPD chuẩn (ppb) ống 4ml ml Lắc đều, đặt ống nghiệm vào bếp cách thủy 40oC 90 phút Để nguội nhiệt độ phòng, chuyển vào lọ 1,5ml để đo máy GC/MS 10 20 40 60 d Xây dựng đường chuẩn Kiểm tra thiết bị chạy ổn định theo điều kiện mô tả, tiêm mẫu chuẩn chuẩn bị Ghi lại diện tích pic tương ứng với nồng độ Dựa vào nồng độ diện tích pic chuẩn, thiết lập phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ chuẩn diện tích pic e Tiến hành phân tích Tiến hành tiêm mẫu phân tích vào máy, ghi lại sắc ký đồ lần tiêm mẫu Ghi lại diện tích có thời gian lưu phổ khối tương ứng với thơì gian lưu phổ khối chất chuẩn Dựa vào phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ chuẩn diện tích pic, tính nồng độ 3-MCPD có dịch thử III TÍNH KẾT QUẢ Hàm lượng 3-MCPD mẫu thử tính theo cơng thức sau : Cx  V C (ppm) =   F m Trong : Cx : nồng độ 3-MCPD dịch thử (ppm) m : Khối lượng mẫu đem phân tích (g) V : Thể tích cuối (ml) F : Hệ số pha lỗng đo (F=1: khơng pha lỗng) IV NHẬN XÉT Q TRÌNH Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) phương pháp sắc ký đạinhất với độ nhạy,độ đặc hiệu cao sử dụng nghiên cứu phân tích kết hợp Hiệu suất thu hồi tính % (X) theo cơng thức: 100% Trong : xR : Lượng hoạt chất tìm thấy mẫu trắng cho thêm hoạt chất X0 : Lượng hoạt chất tìm thấy mẫu trắng XA V : Lượng hoạt chất đưa vào mẫu trắng PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ VÀ PHỔ KHỐI CỦA CHUẨN 3-MCPD VI TÀI LIỆU THAM KHẢO - Quá trình hình thành 3-mcpd thực phẩm, Ths Tôn Nữ Minh Nguyệt - http://luanvan.net.vn/luan-van/nghien-cuu-ve-3-mcpd-38672/ - D.C.Meierhans, S.Bruehlmann, J.Meili, C.Taeschler, Sensitive method for the determination of 3-Chloropropane –1,2-diol and Chloropropane – 1,3-diol by capillary gas chromatography with mass spectrometric detection, Journal of Chromatography A., 325-333, 1998 - Food Law News – EU – 2001 http://www.fst.rdg.ac.uk/foodlaw/news/eu-01125.htm - Nguyễn Thanh Khuyến, Giáo trình giảng dạy lý thuyết sắc ký, 1998, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Tp.HCM - Trung Tâm Kỹ Thuật – Kỹ thuật sắc ký khối phổ - Tiêu chuẩn ngành Y tế 52TCN TQTP 0010:2005  ... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng : nước tương dầu hào Phương pháp: Xác định hàm lượng 3- monoclo propan-1,2-diol (3- MCPD) sắc ký khí/ khối phổ Gas Chromatography Mass Spectometry (GC/MS) Tương tự... hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ bao gồm phận: nguồn cung cấp khí, lị cột, phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dị, phận ghi nhận tín hiệu, phận in liệu phân tích; đó,... (ppm) m : Khối lượng mẫu đem phân tích (g) V : Thể tích cuối (ml) F : Hệ số pha lỗng đo (F=1: khơng pha lỗng) IV NHẬN XÉT Q TRÌNH Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) phương pháp sắc ký đạinhất với