BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định hàm lượng vitamin b2 trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC

BÁO CÁO MƠN: DƯỢC PHÂN TÍCH CHUN ĐỀ: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B2 TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) Giáo viên hướng dẫn: Danh sách nhóm báo cáo: I./ Đặt vấn đề: Vitamin có vai trị quan trọng sức khỏe người, đặt biệt khả tăng trưởng phát triển trẻ nhỏ Trong 13 loại vitamin quan trong, có vitamin nhóm B tan nước cụ thể vitamin B2 có vai trị quan trọng thể Nó thành phần quan trọng men oxydase; trực tiếp tham gia vào phản ứng ơxy hóa hồn ngun; khống chế phản ứng hơ hấp chuyển hố tế bào; chuyển hoá chất: đường, đạm, béo lượng để cung cấp cho tế bào hoạt động; tác động đến việc hấp thu, tồn trữ sử dụng sắt thể (rất quan trọng việc phòng chống thiếu máu thiếu sắt) Vai trò vitamin quan trọng cần lưu ý sử dụng dược phẩm bổ sung vitamin để để tránh dư thừa gây tác dụng không mong muốn Vitamin B2 có nhiều thực phẩm nên việc lựa chọn thực phẩm để bổ sung vitamin lựa chọn ưu tiên Vì việc xác định hàm lượng vitamin bổ sung có ý nghĩa vấn đề đảm bảo quyền lợi sức khỏe người tiêu dùng Xuất phát từ nhu cầu để nghiên cứu vấn đề dinh dưỡng tiến hành nghiên cứu đề tài “ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN B2 TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC)” II./ Đối tượng nghiên cứu phương pháp nghiên cứu: Tính chất lý hóa vitamin B2: Vitamin B2 hay cịn gọi Riboflavin Cơng thức :C17H20N4O6 - Tính chất: bột kết tinh màu vàng cam khó mùi, khó tan nước , ethanol, khơng tan ether, clorofrom, benzene Dễ tan không ổn định môi trường kiềm , ổn định môi trường acid , khơng ổn định với ánh sáng Do có hệ nối đôi luân phiên nên vitamin B2 hấp thụ xạ UV_Vis Do đó, thao tác phân tích hoạt động với giải pháp riboflavin nên thực bóng tối ánh sáng đỏ Nếu bảo vệ từ ánh sáng, riboflavin tương đối ổn định so với nhiệt oxy Riboflavin vitamin B2 thành phần hoạt động (nhóm giả) nucleotide flavin FAD (flavin adenine dinucleotide) FMN (flavin mononucleotide = riboflavin-5'-phosphate), mà hoạt động coenzyme oxidoreductase nhiều chức liên quan đến chuyển nhượng hydro xúc tác phản ứng q trình chuyển hóa carbohydrate, chất béo protein FMN FAD hòa tan nước (3 g 100 ml pH 25 ° C) Nói chung, riboflavin coi loại vitamin "quan trọng" hơn, thay đổi từ đến mg ngày cho người lớn, đáp ứng chí cao nhóm dân số nước phương Tây Vitamin B2 có loại thực phẩm ta dùng ngày như: ngũ cốc, rau xanh, đậu loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách có vitamin B2 (tỷ lệ vitamin B2 chế biến thức ăn khoảng 15 - 20%) Hàm lượng vitamin B2 động vật cao thực vật thường phối hợp với vitamin PP Ảnh hưởng vitamin B2 đến sức khỏe người: Nếu thiếu gây biểu mắt : Ngứa, rát bỏng, sợ ánh sáng, chảy nước mắt, viêm bờ mi loét mi, sung huyết mắt, viêm kết mạc kết tụ quanh rìa, viêm giác mạc chấm nông viêm kết, giác mạc bong, dẫn đến hoại tử loét sâu (không vi khuẩn ),quáng gà, đục nhân mắt Đáy mắt đơi có phù gai thị, chảy máu võng mạc Dấu hiệu toàn thân như: Mệt mỏi, giảm khả làm việc, vết thương lâu lành; thiếu máu; rối loạn chức ruột, ăn khơng tiêu; viêm ruột kết mạn tính; suy gan, viêm gan cấp; phát ban, ngứa toàn thân bong vảy; viêm mép (nứt, lt); viêm lưỡi (có màu tím đỏ, lưỡi hình đồ); phù niêm mạc mơi teo niêm mạc môi; viêm da tăng tiết bã nhờn (ở mặt, bìu dái, âm hộ); trẻ chậm lớn Dùng liều loại vitamin gây nên chuột rút Đặc biệt phụ nữ có thai ảnh hưởng đến thai việc cung cấp dinh dưỡng cho thai nhi, khiến thai nhi phát triển kém, nước tiểu chuyển màu vàng nhạt, gây sai lệch số xét nghiệm nước tiểu phịng thí nghiệm Dụng cụ, thiết bị hóa chất: 3.1 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị: - Hệ thống sắc ký lỏng cao áp với detector huỳnh quang FL detector PDA - Cân phân tích độ xác 0,0001g - Cân kỹ thuật độ xác 0,01g - Bếp đun cách thuỷ - Máy đo pH - Bình nón 250 ml -Phễu lọc - Bình định mức 100, 200 ml - Lọ thuỷ tinh nâu nút nhám loại 50ml, 100 - Pipet cỡ 10,20 ml - bình định mức cỡ 3.2 Chuẩn bị hóa chất:  Hoá chất thuốc thử sử dụng loại tinh khiết PA - Dung dịch HCl 1N - Dung dịch CH3COONa 0,05M -Dung môi Methanol (Merck) - Men amilase (Prolabo) - Acid acetic (Merck) - Dung dịch vitamin B2 chuẩn gốc 100ppm:  Cân 0,0250g chuẩn vitaminB2 dạng riboflavin cho vào bình định mức 250ml, hồ tan pha lỗng tới vạch mức nước (Lắc siêu âm để tan hoàn toàn, bọc giấy bạc tránh ánh sáng bảo quản nhiệt độ 4oC) - Dung dịch chuẩn làm việc vitamin B2 nồng độ 50, 25, 10, ppm pha dùng Điều kiện quy trình trình thực hiện: 4.1 Điều kiện quy trình: : Vitamin B2 nhạy với ánh sáng Cần có biện pháp để bảo vệ mẫu dung dịch tương ứng suốt q trình phân tích đựng dụng cụ thủy tinh màu nâu  Điều kiện chạy sắc ký: - Chạy sắc ký với detector FL bước sóng kích thích 422 bước sóng phát xạ 522nm - Dung môi pha động Pha động: CH3COONa 0,05M : MeOH = 70:30 (V/V) - Cột sắc ký pha ngược C18 - Tốc độ dòng 1ml/phút - Nhiệt độ phòng - Điều kiện chạy sắc ký với detector PDA bước sóng 254nm - Dung mơi Pha động H2O : MeOH: aceic acid tỷ lệ 45: 65: 0,1 (V/V/V) - Tốc độ dòng 0,8 ml/ phút - Cột RP 18 4.2 Quá trình thực hiện:  Chiết vitamin B2 từ thực phẩm * Xử lý mẫu: - Đối với mẫu rắn phải nghiền xay nhỏ đồng kỹ đóng vào túi nilon hay hộp kín tránh hút ẩm - Với mẫu thực phẩm lỏng: Đồng lắc trộn kỹ - Với thực phẩm vừa lỏng vừa rắn phải lấy nước đem nghiền kỹ đồng trước cân * Tiến hành - Cân xác khoảng 0,1- 10g mẫu cho vào bình nón 250 ml - Thêm vào bình 10 ml HCl 1N 90 ml nước - Thuỷ phân nồi cách thuỷ 1000C - Chỉnh pH dịch thuỷ phân đến pH=4,5 dung dịch natri acetat 2,5M - Thêm vào bình 0,1g men Amilase - Đặt bình vào tủ ấm ủ 370C 18 - Định mức dung dịch đến 200ml 250 ml nước cất lọc - Dịch lọc mẫu chuẩn bơm vào HPLC Tiến hành phân tích máy:  Giới hạn phát vitamin B2: 0.02 ng  Nhận biết riboflavin cách so sánh thời gian lưu pic sắc phổ thu dung dịch mẫu thử dung dịch chuẩn Có thể thực phép nhận biết pic cách thêm lượng nhỏ dung dịch chuẩn thích hợp vào dung dịch mẫu thử  Pha tĩnh: Supelco® LC-18-DB, m, 250 mm x 4,6 mm  Pha động: metanol (4.2.1): đệm phosphat, pH 3,5 (4.2.16) có chứa tetraetyl amoniclorua g/l (4.2.17) natri heptansulfonat mmol/l (4.2.18) (35:65)  Tốc độ dịng: 1,0 ml/min  Thể tích bơm: 20 l  Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích: 468 nm; bước sóng phát xạ: 520 nm III./ Tính tốn kết quả: Xây dựng đường chuẩn: - Khi thẩm định phương pháp cần phải xây dựng đường đường chuẩn qua điểm Tuy nhiên mẫu làm nhiều phương pháp ổn định q trình phân tích mẫu hàng ngày cần tính sở điểm chuẩn nằm khoảng tuyến tính - Các dung dịch chuẩn vitaminB2 để xây dựng đường chuẩn có nồng độ 20; 10; 5; 1, 0.5 mcg/ml Dung dịch chuẩn bơm vào máy HPLC, phần mềm máy lập đường chuẩn tương quan diện tích chiều cao peak với nồng độ chuẩn tương ứng Căn vào diện tích hay chiều cao peak mẫu đường chuẩn xây dựng được, tính hàm lượng vitaminB2 theo công thức sau: X(mcg/g)= 200 x Cm / m Trong : 200 thể tích bình định mức dịch sau thuỷ phân (ml) Cm: nồng độ mẫu phân tích tính theo đường chuẩn (mcg/ml) hay nồng độ dung dịch chuẩn m: Khối lượng mẫu lấy phân tích (g) Sắc kí đồ CHÚ DẪN X: Y: độ hấp thụ 1: 6,380 vitamin B2  Ngồi tính kết dựa đồ thị chuẩn sử dụng chương trình tương ứng máy tích phân sử dụng theo công thức giản lược sau đây: - Tính phần khối lượng vitamin B mẫu thử, w, miligam 100 g (mg/100 g), sử dụng Cơng thức (2): (2) Trong đó:  As diện tích pic chiều cao pic riboflavin thu từ dung dịch mẫu thử (6.3.3), tính đơn vị diện tích chiều cao;  AST diện tích pic chiều cao pic riboflavin thu với dung dịch chuẩn (4.4.2), tính đơn vị diện tích chiều cao;  V tổng thể tích dung dịch mẫu thử cuối (6.3.3), tính mililit (ml);  VE thể tích dịch chiết (6.3.2), tính mililit (ml);  VA thể tích phần mẫu thử dùng để pha loãng cuối (6.3.3), tính mililit (ml);   nồng độ khối lượng riboflavin dung dịch chuẩn (4.4.2), tính microgam mililit (g/ml);  ms khối lượng mẫu thử, tính gam (g);  1000 hệ số chuyển đổi từ microgam thành miligam;  100 hệ số chuyển đổi phần khối lượng 100 g;  E phần khối lượng riboflavin có enzym, tính miligam 100 g (mg/100 g);  mE khối lượng enzym sử dụng phép phân tích, tính gam (g) Báo cáo kết vitamin B2 miligam 100 g (mg/100g)  Độ xác ( độ lặp lại): Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập, đơn lẻ dựa vật liệu thử giống hệt người thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giới hạn lặp lại r Các giá trị riboflavin là: Sữa bột = 14,54 mg/100g r = 1,3048 mg/100g Gan lợn = 105,46 mg/100g r = 5,1104 mg/100g  Độ (độ tái lập): Chênh lệch tuyệt đối hai kết hai phép thử độc lập, thu tiến hành thử vật liệu giống hai phòng thử nghiệm khác nhau, không % trường hợp lớn giới hạn tái lập R Các giá trị riboflavin là: Sữa bột = 14,54 mg/100g R = 3,0078 mg/100g Gan lợn = 105,46 mg/100g R = 23,5342 mg/100g  Đảm bảo chất lượng: Sai lệch hai lần thử song song điều kiện so với giá trị trung bình khơng chênh lệch q 15% Các hệ thống HPLC thay Pha tĩnh Hypersil® ODS, m Kích thước cột mm x mm Pha động 125 x 4,6 Metanol: nước (50:50) Tốc độ dòng ml/min Detector huỳnh quang, nm 1,0 Kích thích: 462 Phát xạ: 520 Supelco® LC-18-DB, m Lichropher® RP 18, m Apex® C18, m 250 x 4,6 Metanol: đệm phosphat (4.2.16) chứa tetraetylamoniclorid, (C8H20NCl) = g/l natri heptansulfonat, c(C7H15NaO3S) = mmol/l (35:65) 1,0 25 x + 1,5 125 x Metanol: amoniac 0,025 % (+ g axit hexansulfonat); (250:500); pH 3,6 250 x Metanol: nước (1:1) 1,0 Kích thích: 468 Phát xạ: 520 Kích thích: 467 Phát xạ: 525 Kích thích: 450 Phát xạ: 510 Bondapak® C18 radialpak catridges Spherisorb® ODS2, m 100 x Metanol: mmol điện phosphat pH (35:65) 250 x 4,6 Metanol: nước (50:50) 1,0 Kích thích: 440 Phát xạ: 520 1,0 Kích thích: 450 Phát xạ: 510 Bondapak®C18, 10 m Kromasil®C-18, m 100 x Metanol: đệm natri axetat 0,05 M, pH 4.5 (40:60) 250 x 4,6 Metanol: nước (40:60) 1,0 Kích thích: 422 Phát xạ: 522 1,0 Kích thích: 440 Phát xạ: 520 Eurospher® C18, m 250 x 4,6 Metanol: nước (50:50) 1,0 Kích thích: 445 Phát xạ: 530 Spherisorb® ODS, m 250 x 4,6 Metanol: nước (50:50) 1,0 Kích thích: 410 Phát xạ: 510 IV./ Kết luận: Phân tích HPLC thành lập phương pháp lựa chọn để xác định riboflavin thực phẩm Phạm vi phân tích xác định quy trình sử dụng Sắc ký thực hiệnchủ yếu cột RP C18 cách sử dụng giải hấp isocratic thường xuyên Gradient với methanol-nước hỗn hợp acetonitril bị chua đệm phát fluorimetric phương pháp định lượng nhạy cảm Trong thực phẩm giàu bổ sung, riboflavin xác định UV phát với đầy đủ độ xác Tài liệu tham khảo TCVN 8975-2011 - Thực Phẩm - Xác Định Vitamin B2 Bằng Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (HPLC) HPLC Determination of Riboflavin in fortified food - Roland Bitsch, Irmgard Bitsch https://www.researchgate.net/publication/230547667 ... fluorimetric phương pháp định lượng nhạy cảm Trong thực phẩm giàu bổ sung, riboflavin xác định UV phát với đầy đủ độ xác Tài liệu tham khảo TCVN 8975-2011 - Thực Phẩm - Xác Định Vitamin B2 Bằng Sắc... dược phẩm bổ sung vitamin để để tránh dư thừa gây tác dụng không mong muốn Vitamin B2 có nhiều thực phẩm nên việc lựa chọn thực phẩm để bổ sung vitamin lựa chọn ưu tiên Vì việc xác định hàm lượng. .. 410 Phát xạ: 510 IV./ Kết luận: Phân tích HPLC thành lập phương pháp lựa chọn để xác định riboflavin thực phẩm Phạm vi phân tích xác định quy trình sử dụng Sắc ký thực hiệnchủ yếu cột RP C18 cách