Trang: THƯỜNG QUY KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ASEN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT HYDRUA HÓA Nguyên tắc - Mẫu vơ lị vi sóng áp dụng chương trình cho đối tượng, As (V) khử As (III) KI axit ascorbic phản ứng với NaBH môi trường H+ để tạo thành hợp chất AsH3 Dịng khí mang Ar dẫn AsH3 vào cuvet chữ T để nguyên tử hóa - Định lượng As sinh phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử bước sóng đặc trưng As 193,7 nm Phạm vi áp dụng Áp dụng cho đối tượng thực phẩm Tài liệu viện dẫn AOAC Official Method 986.15, (2000), Arsenic, Cadmium, Lead, Selenium, and Zinc in Human and Pet Foods Thiết bị - Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử - Bộ hydrua hóa - Cell thạch anh - Lị vi sóng phá mẫu tương đương - Cân phân tích, có độ xác đến 0,0001 g - Cân kỹ thuật độ xác 0,01 g - Bếp cách thủy - Bếp khuấy từ gia nhiệt Dụng cụ - Giấy lọc, loại trung tính - Phễu lọc, đũa thủy tinh - Micropipet 1000 µl, 200 µl Hóa chất, thuốc thử - Tất hoá chất đem dùng hoá chất tinh khiết dùng cho phân tích nguyên tố lượng vết, loại pA Merk tương đương - Chuẩn As dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm, (Merck) - HNO3 65%, (Merck) - HCl 37%, (Merck) - H2O2 30%, (Merck) - NaOH tinh thể, (Merck) - NaBH4, (Merck) - KI (Merck) - Axit ascobic (Merck) - Nước cất hai lần - Khí Argon, (tinh khiết đến 99%) - Khí Axetylen, (tinh khiết đến 99%) Cách pha chế dung dịch Pha chế dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn trung gian As 100 ppb Lấy ml dung dịch chuẩn As 1000 ppm vào bình định mức 100 ml, định mức tới vạch định mức HCl 5% thu dung dịch chuẩn As 10 ppm Lấy ml dung dịch chuẩn As 10 ppm vào bình định mức 100 ml, định mức tới vạch định mức HCl 5% thu dung dịch chuẩn As 100 ppb Dung dịch chuẩn làm việc Trang: Lấy ml dung dịch chuẩn trung gian As 100 ppb vào bình định mức 100 ml, 50 ml, 25 ml, sau cho 10 ml; ml; 2,5 ml dung dịch KI 10% axit ascorbic 1% vào bình định mức trên, sau định mức đến vạch định mức HCl 5% Pha chế hóa chất, thuốc thử Dung dịch KI 10% Cân 10 gam KI hòa tan nước cất lần định mức vào bình định mức 100 ml Dung dịch axit ascorbic % Cân gam axit ascorbic hòa tan nước cất lần định mức vào bình định mức 100ml Dung dịch HCl 5% Lấy 135 ml dung dịch HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức tới vạch định mức nước cất lần Dung dịch HCl 5M Lấy 200 ml dung dịch HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức tới vạch định mức nước cất lần Dung dịch NaBH4 0,5% NaOH 0,5% Cân gam NaBH4, gam NaOH hịa tan nước cất, định mức vào bình định mức 200 ml Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu sơ Đồng mẫu Xử lý mẫu 8.2.1 Đối với mẫu thực phẩm (mẫu thử) 8.2.1.1 Vô hóa mẫu lị vi sóng phá mẫu (vơ hóa hệ kín) - Đối với mẫu dạng lỏng: Hút xác ml dịch mẫu cân xác gam mẫu, thêm ml HNO3 65%, ml H2O2 30% ml H2O Sau lên chương trình nhiệt độ vơ cơ` lị vi sóng phá mẫu - Đối với mẫu dạng rắn: cân xác từ 0,2 – gam mẫu, thêm ml HNO 65%, ml H2O2 ml H2O, đun bếp khuấy từ gia nhiệt khơng thấy khí NO bay Sau đặt chương trình nhiệt độ vơ lị vi sóng phá mẫu Mẫu vơ hóa lị vi sóng xong, lấy cốc có mỏ dung tích 100 ml đuổi axit bếp cách thủy đến muối ẩm Lấy cốc định mức HCl 5%, thêm KI 10% tỷ lệ 1:10, axit ascobic % tỷ lệ 1: 10, để yên 15 phút nhiệt độ 50 0C - 600C sau đem đo mẫu hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa Chú ý: mẫu nước axit hóa đo trực tiếp hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử cô để làm giàu mẫu 8.2.1.2 Vơ hóa mẫu bình Kendan (vơ hóa hệ hở) - Đối với mẫu dạng lỏng: hút từ – ml mẫu vào bình Kendan, thêm 10 ml HNO 65%, ml H2O2 30% lắc đều, đun sôi mẫu lăn tăn, đến mẫu tan hết, tạo dung dịch suốt (khoảng – giờ) Cho mẫu cốc có mỏ 100 ml, bếp cách thủy (hoặc bếp điện) đến muối ẩm Lấy cốc định mức HCl 5%, thêm KI 10% tỷ lệ 1:10, axit ascorbic tỷ lệ 1:10, để yên 15 phút nhiệt độ 500C – 600C sau đem đo mẫu hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa - Đối với mẫu dạng rắn: Cân từ – gam mẫu vào bình Kendan, thêm 15 – 20 ml HNO3 65% (tùy thuộc vào mẫu khó tan hay dễ tan mà cho thể tích HNO phù hợp), ml H2O2 30% lắc đều, đun sôi mẫu lăn tăn, đến mẫu tan hết, lúc mẫu vàng, cho mẫu cốc có mỏ 100 ml, bếp cách thủy đến muối ẩm Lấy cốc định mức HCl 5%, thêm KI 10% tỷ lệ 1:10, axit ascorbic tỷ lệ 1:10, để yên 15 phút nhiệt độ 50 0C – 600C sau đem đo mẫu hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa Chú ý: Đối với mẫu phức tạp thời gian vơ hóa lâu Trang: 8.2.2 Mẫu trắng Được làm tương tự mẫu thử, mẫu trắng mẫu không chứa chất cần phân tích Chú ý: Trong trường hợp khơng có mẫu trắng ta dùng mẫu trắng thuốc thử tiến hành tương tự trình 8.2.3 Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC) Mẫu thu hồi tiến hành giống mẫu thử có cho thêm chất phân tích vào mẫu sau cân mẫu Mẫu spike: thêm lượng xác dung dịch chuẩn trung gian vào mẫu trắng, tiến hành tương tự mẫu thử Lưu ý: Dung dịch chuẩn dùng để spike phải khác với dung dịch chuẩn dùng để lập đường chuẩn Nếu có mẫu QC dùng mẫu QC Các thơng số đo phổ As Vạch Phổ đo Asen 193,7 – nm Cường độ dòng đèn HCL 10 mA Khe đo 0,5 nm Chiều cao burner 4,3 – 4,5nm Khí mơi trường Argon Khí cháy Khơng khí nén + Axetylen Loại cuvét Cell thạch anh Air flow 13,5 L/phút Acetylene flow 2,10 L/phút Tốc độ dẫn mẫu mL/phút Tốc độ dẫn thuốc thử NaBH4 mL/phút Tốc độ dẫn thuốc thử HCl mL/phút Delay time 45 giây Measurement time 10 giây Chú ý: Đối với hãng máy khác điều kiện thông số đo phổ thay đổi cần phải khảo sát lại Xây dựng đường chuẩn Sau thiết bị đo phổ AAS ổn định, tiến hành đo dung dịch chuẩn làm việc chuẩn bị sẵn (7.1.2) Xác định Abs dãy chuẩn, dựng đường chuẩn phụ thuộc tuyến tính nồng độ độ hấp thụ Abs Tính kết Tính hàm lượng Asen mẫu rắn theo công thức: X ( g / kg ) C M V K m Trong đó: V: thể tích định mức (ml) CM: nồng độ Asen dung dịch mẫu đo máy (µg/l) m: khối lượng mẫu cân để làm (g) K: hệ số pha loãng X: hàm lượng Asen mẫu thực Tính hàm lượng Asen mẫu lỏng theo công thức: Trang: X ( g / kg ) C M V K m Trong đó: V: thể tích định mức (ml) CM: nồng độ Asen dung dịch mẫu đo phổ (µg/l) m: thể tích mẫu để phân tích (ml) K: hệ số pha loãng X: hàm lượng Asen mẫu thực 10 Kiểm sốt chất lượng Kết phân tích hai lần song song mẫu thử có sai số khơng lệch 20% so với giá trị trung bình Nếu sai số vượt 20% phải tiến hành phân tích lại Độ thu hồi phương pháp phải nằm giới hạn cho phép AOAC: độ thu hồi từ 40 – 120% nồng độ – 10ppb, từ 60 – 115% nồng độ 10 – 100ppb, từ 80 – 110% nồng độ 100ppb – 1ppm Trang: CÁC THÔNG SỐ CƠ BẢN CẦN THIẾT ĐỂ THẨM ĐỊNH MỘT PHƯƠNG PHÁP Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Cách 1: Làm mẫu trắng (mẫu trắng có thành phần mẫu thử khơng có chất phân tích) Phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn phải khác Tính LOD: LOD = x 3SD LOQ = x 10SD Với Trong đó: (x SD0 = 0i x0 ) n x0 = trung bình mẫu trắng SDo = độ lệch chuẩn mẫu trắng Cách 2: Làm mẫu thử: Làm 10 lần song song Nên chọn mẫu thử có nồng độ thấp (ví dụ, khoảng đến lần LOD ước lượng) Tính LOD: Tính giá trị trung bình x , độ lệch chuẩn SD LOD = x SD LOQ = 10 x SD (x SD i x) n Đánh giá LOD tính được: tính R = x / LOD Nếu < R < 10 nồng độ dung dịch thử phù hợp LOD tính đáng tin cậy Nếu R < phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, thêm chất chuẩn vào dung dịch thử dùng làm lại thí nghiệm tính lại R Nếu R > 10 phải dùng dung dịch thử lỗng hơn, pha loãng dung thử dùng làm lại thí nghiệm tính lại R Khoảng tuyến tính đường chuẩn Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn Xác định giá trị đo y theo nồng độ x Nếu phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn phương trình: y = ax + b hệ số tương quan: r ( x X )( y Y ) (x X ) ( y Y ) i i i i Nếu 0,995 < r2 ≤ : Có tương quan tuyến tính Khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng phương trình hồi quy khoảng này, tức xác định hệ số a b Trên đường hồi quy, lấy đoạn tuyến tính làm khoảng xác định (kể hai điểm đầu cuối) Độ lặp lại Với mẫu làm đồng nhất, tiến hành xác định phương pháp đề xuất n lần (n 10), sau tính SD hay RSD theo cơng thức: SD (x i X )2 n 100 SD RSD (%) X Trang: Trong đó: xi : value from analysis X : meaning n : number of samples - Tính độ lặp lại: Một người thực thiết bị, khoảng thời gian tương đối ngắn, với điều kiện thực thí nghiệm giống (n 10) Độ thu hồi Thêm lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử mẫu trắng, phân tích mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu lần phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo cơng thức sau đây: - Đối với mẫu thử: R% - C m c C m 100 Cc Đối với mẫu trắng: R% C tt 100 Cc Trong đó: R%: Độ thu hồi, % Cm+c: conc of spiked sample Cm: Nồng độ chất phân tích mẫu thử Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ctt: Nồng độ chất phân tích mẫu trắng thêm chuẩn Sau tính độ thu hồi chung trung bình độ thu hồi lần làm lặp lại Thêm chất chuẩn mức nồng độ mức thấp, trung bình cao khoảng nồng độ làm việc Nồng độ thực hiện: - Đối với chất có quy định giới hạn tồn dư tối đa (MRL) thực nồng độ: MRL, MRL/2 MRL*2 - Đối với chất cấm khơng quy định giới hạn cho phép, có mức yêu cầu hiệu tối thiểu (MRPL) thực tối thiểu 02 nồng độ < MRPL - Đối với chất dinh dưỡng, bổ sung chất gây hại thực nồng độ khoảng đầu, cuối khoảng tuyến tính ... thống quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa Chú ý: mẫu nước axit hóa đo trực tiếp hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử để làm giàu mẫu 8.2.1.2 Vơ hóa mẫu bình Kendan (vơ hóa hệ... cốc định mức HCl 5%, thêm KI 10% tỷ lệ 1:10, axit ascorbic tỷ lệ 1:10, để yên 15 phút nhiệt độ 500C – 600C sau đem đo mẫu hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa - Đối với. .. Lấy cốc định mức HCl 5%, thêm KI 10% tỷ lệ 1:10, axit ascorbic tỷ lệ 1:10, để yên 15 phút nhiệt độ 50 0C – 600C sau đem đo mẫu hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa Chú