Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích 11 nor 9 carboxy THC trong máu trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ kép (LC MS MS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Đỗ Thị Hiếu NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 11-NOR-9-CARBOXY-THC TRONG MÁU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KÉP (LC-MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: HÓA HỌC Hà Nội, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Đỗ Thị Hiếu NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 11-NOR-9-CARBOXY-THC TRONG MÁU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KÉP (LC-MS/MS) Chun ngành: Hóa học phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN QUANG THĂNG Hà Nội, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2021 Tác giả Đỗ Thị Hiếu ii LỜI CÁM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Phan Quang Thăng, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn thầy, giáo Khoa Hóa học, Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trung tâm, Ths Hoàng Thế Thắng, anh chị Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình nhiệt tình giúp đỡ, động viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè hỗ trợ, chỗ dựa vững giúp tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2021 Học viên Đỗ Thị Hiếu iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cần sa, chế phẩm cần sa tác hại chúng 1.1.1 Giới thiệu cần sa 1.1.2 Các chế phẩm từ cần sa 1.1.3 Tác hại việc sử dụng cần sa 1.1.4 Các thành phần hóa học cần sa có ý nghĩa khoa học hình 1.1.5 Thời gian phát đối tượng phân tích người sử dụng cần sa 1.1.6 THC chuyển hóa THC máu 11 1.1.7 THC-COOH 12 1.2 Tổng quan phương pháp tách chiết THC-COOH máu 13 1.2.1 Phương pháp kết tủa protein 13 1.2.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 14 1.2.3 Phương pháp chiết pha rắn 14 1.3 Tổng quan số phương pháp phân tíchTHC-COOH máu15 1.3.1 Sắc kí khí khối phổ (GC-MS): 15 1.3.2 Sắc kí lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS) 16 1.4 Cơ chế phân mảnh THC-COOH 21 CHƯƠNG NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 22 2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu 22 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.3 Mẫu nghiên cứu 22 2.1.4 Nội dung nghiên cứu 22 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 23 iv 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 24 2.3 Phương pháp thực nghiệm: 25 2.3.1.Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 25 2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 25 2.4 Thực nghiệm: 26 2.4.1 Khảo sát điều kiện phân tích thiết bị LC-MS/MS 26 2.4.2 Khảo sát dung môi chiết 28 2.4.3 Khảo sát môi trường (pH) chiết 28 2.4.4 Khảo sát độ thu hồi phương pháp 28 2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng mẫu 29 2.5 Thẩm định phương pháp 29 2.5.1 Độ phù hợp kệ thống sắc ký 29 2.5.2 Độ chọn lọc phương pháp 30 2.5.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 30 2.5.4 Độ độ xác 30 2.5.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 31 2.6 Phân tích mẫu thực tế 31 2.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH LC-MS/MS 33 3.2 Kết khảo sát điều kiện tối ưu cho trình chiết 35 3.2.1 Kết khảo sát dung môi chiết 35 3.2.2 Kết khảo sát môi trường chiết (pH) 37 3.2.3 Đánh giá độ thu hồi phương pháp 39 3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng mẫu 40 3.3 Thẩm định phương pháp ứng dụng phân tích THC-COOH mẫu máu LC-MS/MS 41 3.3.1 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng THC-COOH máu 41 3.3.1.1 Độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS 41 v 3.3.1.2 Độ chọn lọc 42 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng 43 3.3.3 Kết xác định giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp 45 3.4 Quy trình giám định THC-COOH thiết bị LC-MS/MS 45 3.5 Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế 46 3.6 Đánh giá đối tượng mẫu phân tích, phương pháp phân tích LC-MS/MS đóng góp đề tài 48 3.6.1 Đánh giá đối tượng mẫu phân tích phương pháp phân tích LCMS/MS 48 3.6.2 Đóng góp đề tài 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 Kết luận 51 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích THC-COOH 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocacnnabinol GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography – Mass Spectroscopy) LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ kép (Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectroscopy ACN Acetonitrile TCA Axit trichloroacetic (Acid trichloroacetic) LLE Chiết lỏng – lỏng (Liquid–liquid extraction) SPE Chiết pha rắn (solid phase extraction) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) ESI Ion hóa tia điện (electrospray ionization) MRM Multiple Reaction Monitoring IS Nội chuẩn (Internal standard) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) UNODC United Nations Office on Drugs and Crime vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các thành phần hóa học cần sa có ý nghĩa khoa học hình Bảng Hàm lượng THC thay đổi tùy vào phận cần sa Bảng Thời gian phát đối tượng mẫu Bảng Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH máu sắc ký khí 16 Bảng Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH máu sắc ký lỏng 18 Bảng Chương trình pha động gradient: 27 Bảng Các phân mảnh, thời gian lưu bắn phá THC-COOH THC-COOH-d3 33 Bảng Độ thu hồi chất phân tích máu tỉ lệ dung môi khác 36 Bảng 3 Độ thu hồi chất phân tích máu pH khác 38 Bảng Độ thu hồi chất phân tích máu 40 Bảng Ảnh hưởng mẫu 41 Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 42 Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính THC-COOH 44 Bảng Kết định lượng thu từ số mẫu thực 47 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cần sa trồng nhà Hình Hình ảnh cần sa cần sa thường dùng thực tế Hình Sơ đồ q trình chuyển hóa THC máu 12 Hình Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 20 Hình Cấu trúc phân mảnh THC-COOH 21 Hình Phân mảnh m/z (a) THC-COOH (b) TCH-COOH-d3 34 Hình So sánh Peak THC-COOH nồng độ Amoniacetat khác (a) mM, (b) mM (c) 10 mM 34 Hình 3.3 So sánh độ thu hồi tỉ lệ dung mơi khác 37 Hình 3.4 So sánh độ thu hồi pH khác 39 Hình 3.6 Peak mẫu khảo sát độ chọn lọc 43 Hình 3.7 Đường chuẩn xác định THC-COOH 44 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình phân tích THC-COOH máu 46 Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH-d3 dung môi hexanee/ethylacetate (9/1) lần Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH, THC-COOH-d3 pH = lần Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH, THC-COOH-d3 pH = lần Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH, THC-COOH-d3 pH = lần Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH, THC-COOH-d3 LOD Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH, THC-COOH-d3 LOQ Sắc ký đồ phổ khối THC-COOH, THC-COOH-d3 09 mẫu thực tế Sắc ký đồi phổ khối mẫu thực tế M1 Sắc ký đồi phổ khối mẫu thực tế M2 PHỤ LỤC BÀI BÁO ĐƯỢC CHẤP NHẬN ĐĂNG TRÊN TẠP CHÍ PHÂN TÍCH HĨA LÝ VÀ SINH HỌC T12/2021 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẦN SA (11-NOR-9-CARBOXY-THC) TRONG MÁU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KÉP (LC-MS/MS) Ngày đến Tòa soạn: 20/10/2021 STUDY ON QUANTIFICATION OF CANNABINOIDS (11-NOR-9CARBOXY-THC) IN HUMAN BLOOD BY USING LIQUID CHROMATOGRAPHY-TENDEM MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS) Đỗ Thị Hiếu, Phan Quang Thăng Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Phan Quang Thăng, Vương Trần Quang Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Đỗ Thị Hiếu, Hồng Thế Thắng Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An SUMMARY The liquid-liquid extraction method combined with liquid chromatography–tandem mass spectrometry has been applied to analyze the concentrations of 11-nor-9-carboxy (THC-COOH) in human blood This method allows the determination of THC-COOH in human blood with a small sample amount (1 ml of biosample) without derivatization of THC-COOH to volatile compounds as analyzed on a GC-MS/MS Using the centrifugation technique with the solvent mixture ratio of hexane/ethylacetate (9:1, v/v) for the optimum condition, the extraction efficiency reached up to 82.8% The optimum pH condition was The analytical recovery of blood samples was 78 and 82% at the THC-COOH concentrations of 25 and 100 ng/ml, respectively The linearity of the calibration curve for quantification ranged from to 400 ng/ml with R2 = 0.997 The THC-COOH-free plasma samples were added to determine the influence of the sample matrix, and the results showed that the effect of the sample matrix at different concentrations from to 100 ng/ml was less than 15% After optimization of the pre-treatment and analytical conditions, a standard analytical procedure was proposed This method was first investigated under laboratory conditions in Vietnam Therefore, the analytical method developed in this study can be applied in other laboratory equiped with required instruments Furthermore, this method also helps to reduce extraction time and analysis costs with high analytical accuracy and reliability, and to determine the usage dose of THC-COOH following a positive rapid test result for cannabis MỞ ĐẦU Theo báo cáo ma túy giới Liên hợp quốc năm 2014 có tới 5,2% dân số giới độ tuổi từ 15-64 sử dụng trái phép chất ma túy Trong số đó, cần sa loại ma túy sử dụng tiêu thụ rộng rãi [1] Ma túy chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý sinh lý người sử dụng, có khả bị lạm dụng gây phụ thuộc tâm, sinh lý vào việc sử dụng chất Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm sốt hành vi mình, tìm cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn Người sử dụng cần sa bị rối loạn thần kinh, gây thăng bằng, chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả sinh sản, làm trụy thai, chết thai chí gây rối loạn nhiễm sắc thể sử dụng lâu dài Từ cần sa người ta phân lập khoảng 61 chất kích thích khác nhau, với thành phần chủ yếu THC (delta –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol), CBD (cannabidiol) Trong THC hoạt chất gây tác dụng tâm lý tới người sử dụng cần sa Trong xét nghiệm cần sa nước chưa thể cung cấp đầy đủ lâm sàng pháp y kết mẫu máu trả lời thời gian sử dụng trình chuyển hóa Tuy nhiên với mẫu máu, việc xử lý mẫu mẫu nhiều protein chất béo khó khăn Yêu cầu giới hạn định lượng mẫu máu thấp [2] Có vài phương pháp giúp xác định THC mẫu máu: 1) phương pháp sàng lọc ELISA: phương pháp dựa chế miễn dịch, phương pháp áp dụng nhằm sàng lọc đối tượng nghi ngờ sử dụng ma túy Có thể áp dụng nhanh lái xe, đối tượng bị bắt giữ vụ án [3]; 2) THC phân tích phổ biến GCMS, nhiên việc phân tích GC cần nhiều thời gian để tách chiết mẫu yêu cầu kỹ thuật dẫn xuất hóa chuyển từ pha lỏng sang chất dễ bay cho pha khí [4, 5]; 3) Xác định THC LC-MS/MS cho phép xác định trực tiếp, phương pháp có tính chọn lọc, độ nhạy cao phù hợp với đối tượng phân tích lượng mẫu Trên giới có số nghiên cứu phân tích THC dạng chuyển hóa thiết bị sắc ký lỏng khối phổ, kể đến phân tích THC dịch miệng kỹ thuật dòng thấp LC-MS phân giải cao [6], khoảng tuyến tính cho phương pháp từ 15 đến 500 ng/ml Phương pháp chiết lỏng lỏng áp dụng để tách chiết THC máu, sau phân tích thiết bị LC-MS/MS Khoảng phát phương pháp từ 0.5 đến 40 ng/ml [2] Ứng dụng phương pháp chiết lỏng lỏng với tỷ lệ hexane/ethylacetateee (8:2, v/v) thiết bị LC-MS/MS có dải đo nồng độ 5-200 ng/ml [7] Do yêu cầu thực tiễn, tính pháp lý phương pháp mà nghiên cứu thực Kết nghiên cứu giúp phương pháp giám định, xét nghiệm nhanh xác đối tượng sử dụng cần sa Qua giúp quan chức năng, quan bảo vệ pháp luật thực thi nhiệm vụ THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất Dung dịch chuẩn THC-COOH 0,1 mg/ml nội chuẩn THC-COOH-d3 mg/ml Arlesheim Thụy Sỹ liên hợp quốc cấp với lượng xác 0,1 mg Cấu trúc chất chuẩn nội chuẩn thể hình THC-COOH – d3 THC-COOH (a) (b) Hình 1: Cấu trúc chất chuẩn THC-COOH (a) THC-COOH-d3 (b) Các hóa chất axít trichloroacetic (TCA), muối pha dung dịch đệm amoniacetate, muối Na2SO4 khan dung môi tách chiết hexane, acetone hóa chất tính khiết mức độ cho phân tích LC-MS Khí N2 99 dùng làm thổi khơ, cô đặc mẫu Mẫu nghiên cứu mẫu huyết tương, thành phần mơ máu có chưa nhiều protein, hormone chất khác Mẫu máu thực tế lấy từ đối tượng nghi sử dụng cần sa đơn vị bắt được, sau kiểm tra sơ que thử, mẫu dương tính với cần sa dùng để tiến hành phân tích 2.2 Quy trình, điều kiện thí nghiệm Từ dung dịch chuẩn gốc µg/ml, khoảng nồng độ 5; 10; 25; 50; 100; 400 ng/ml pha từ dung dịch gốc dung môi methanol Dung dịch nội chuẩn (IS) gốc từ µg/ml pha xuống dung dịch làm việc 100 ng/ml methanol Các dung dịch tiến hành dựng đường chuẩn thiết bị LC-MS/MS Mẫu trắng mẫu huyết tương lấy từ người khỏe mạnh, không sử dụng loại ma túy Đối với mẫu máu, thể tích mẫu bị hạn chế, kết thử nghiệm liên quan đến tích pháp lý vụ án quy định pháp luật nên quy trình chuẩn bị mẫu phải tuân thủ điều kiện khắt khe Từng bước tiến hành thí nghiệm cần cẩn thận, tỉ mỉ trình tách chiết cần loại bỏ protein, lipit, chất mang màu cùng chất hữu gây cản trở khác Quy trình xử lý mẫu tóm tắt sau: Bước 1: Kết tủa protein, lấy ml máu vào ống nhựa, thêm ml dung dịch TCA (kết tủa protein điều chỉnh độ pH chiết) IS, đậy kín lắc, sau ly tâm, thu lớp trên, cho ml dung môi hexane/ethylacetate vào để tiến hành chiết lỏng lỏng Bước 2: Mẫu sau chiết, ly tâm, tách phần dung dịch hữu cơ, loại nước Na2SO4 khan, đem cô khô đèn hồng ngoại, hịa tan mẫu 20 µl CH3OH vào ampul Sau bơm µl để phân tích sắc kí lỏng khối phổ kép Khảo sát mảnh phổ đặc trưng, lựa chọn mảnh ion định lượng THC-COOH, THC-COOH-d3 điều kiện khối phổ cách bơm trực tiếp 200 μl dung dịch chuẩn đơn chất THC-COOH THC-COOH-d3 nồng độ 100 ng/ml vào buồng MS Cột C18 sử dụng làm cột tách, nhiệt độ lị cột trì khơng thay đổi 40 °C, nhiệt độ mẫu 10 °C, tốc độ dòng pha động 0,4 ml/phút thể tích bơm mẫu µl Hệ dung môi pha động gồm A) nồng độ amoniacetate mM, B) gồm hỗn hợp ACN MeOH (85:15, v/v) Tốc độ pha động không đổi 500 l/phút Chương trình gradient pha động thể bảng Bảng 1: Chương trình gradient pha động phân tích THC-COOH thiết bị LC-MS/MS TT Thời gian (phút) 0.00 0.50 1.00 8.33 9.00 12.00 12.10 13.90 A (%) B (%) 70 70 50 30 2 70 70 30 30 50 70 98 98 30 30 mảnh phổ đặc trưng, mảnh phổ định lượng, thời gian lưu cùng điều kiện phân tích máy bắn phá cần khảo sát Chất chuẩn THCCOOH với thể tích 200 µl, cùng nội chuẩn THCCOOH-d3 với nồng độ 100 ng/ml trực tiếp bơm vào buồng MS Kết phổ khối MS cùng điều kiện phân tích thể bảng sau Bảng 2: Phân mảnh, thời gian lưu bắn phá THC-COOH THC-COOH-d3 Chất phân tích Mảnh mẹ (m/z) Mảnh (m/z) Thời gian lưu (phút) Thế bắn phá (V) THCCOOH-d3 346,5 302,2 248,1 194,1 3,390 15.0 25.0 28.0 THCCOOH 343,5 299,2 245,1 191,1 3,399 16.0 24.0 27.0 Với điều kiện phân mảnh bảng trên, để chọn mảnh định lượng ta chọn mảnh cho đỉnh lớn rõ ràng đỉnh Dựa vào kết chế phân mảnh THC-COOH mặc dù mảnh 299,2 lớn máu người dùng cần sa tồn lượng nhỏ THC chưa chuyển hóa, mà phân mảnh THC có mảnh m/z = 299,2 trùng với phân mảnh m/z THC-COOH làm ảnh hưởng kết định lượng Vì vậy, chọn mảnh 245,1 mảnh định lượng THC-COOH Đối với THC-COOH-d3 chọn m/z = 302,2 làm mảnh phân tích định lượng Sắc đồ phân mảnh Kết tối ưu hóa phân mảnh tương tự cơng trình cơng bố trước [8, 9] (a) 299.2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu điều kiện phân tích Để định lượng THC-COOH mẫu máu, yếu tố điều kiện phân tích khảo (b) 248.1 245.1 Để nghiên cứu đánh giá phương pháp yếu tố ảnh hưởng khảo sát tối ưu hóa bao gồm: dung mơi chiết, pH mẫu, hiệu suất thu hồi cuối cùng thẩm định đánh giá độ độ phù hợp phương pháp Quy trình phân tích chuẩn sau nghiên cứu tối ưu hóa áp dụng để phân tích xác định hàm lượng cần sa mẫu máu 302.1 191.1 194.1 Hình Phân mảnh m/z (a) THC-COOH (b) TCH-COOH-d3 3.2 Khảo sát dung môi tách chiết Để khảo sát dung môi tối ưu cho trình tách chiết, ml huyết tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH 200 ng/ml, dùng axit TCA vừa kết tủa protein vừa để điều chỉnh pH, thay đổi tỷ lệ dung môi gồm 100% hexane hỗn hợp hexane/etylaxetate với tỷ lệ thể tích: 9:1, 8:2; 7:3; 6:4 5:5 Chiết mẫu theo quy trình giá trị Hiệu suất thu hồi H (%) 100 80 60 40 tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH nồng độ 200 g/ml, thêm ml dung dịch axit TCA pH khác từ đến Sau tiến hành chiết mẫu theo quy trình xử lý mẫu hệ dung mơi hexane/etylaxetate (9:1, v/v), thêm 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết Làm khơ hồn tồn hịa tan lại cặn 20 μl dung mơi Tiến hành phân tích thiết bị so sánh trực tiếp với hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml không xử lý Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần lấy kết trung bình Độ thu hồi giá trị pH khác thể hình Kết cho thấy pH = cho hiệu suất thu hồi đạt giá trị cao Nhìn chung, pH thấp cho phép tách THC-COOH khỏi mẫu máu vào pha dung môi hexane, 10% ethylacetateee giúp tạo lức chuyển pha phân cực sang không phân cực tốt Kết nghiên cứu tương tự kết phân tích hàm lượng THC-COOH móng tay Kim cộng [11, 12] 81.1 80 Hiệu suất thu hồi H (%) pH tối ưu 4, thêm 10 μl dung dịch THC-COOHd3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết Làm khơ hồn tồn mẫu hịa tan lại cặn 20 μl dung mơi methanol Hiệu suất chuẩn thu hồi mẫu sau trình tách chiết thể hình Kết cho thấy tỷ lệ hexane/etylaxetate 9:1 theo thể tích cho kết tối ưu Hexane dung môi không phân cực cịn etylaxetate có độ phân cực thấp làm cho khả tách THC-COOH dễ nhất, đồng thời chúng dung môi phổ biến thường sử dụng phịng thí nghiệm phân tích ma túy địa phương, độc hại so với dung môi khác Phương pháp chiết lỏng lỏng áp dụng nhiều nghiên cứu trước đây, tỷ lệ dung môi tối ưu áp dụng để tách chiết THC dạng chuyển hóa chúng mẫu máu [2] Tương tự vậy, tỷ lệ hexane/etylaxetate (9:1, v/v) sử dụng để tách chiết THC cùng dạng chuyển hóa thiết bị GC-MS/MS [10] Vì vậy, để tối ưu q trình phân tích, hỗn hợp dung môi hexane/ethylaxetate (9:1, v/v) lựa chọn để tách THC-COOH khỏi mẫu máu đối tượng sử dụng cần sa 74.4 65.7 64.9 2.0 3.0 60 51.5 40 20 1.0 20 4.0 5.0 pH Hình 4: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất tách chiết 0 3.4 Thẩm định ứng dựng phương pháp vào mẫu thực tế Hình So sánh độ thu hồi với tỉ lệ dung môi khác khảo sát 3.3 Khảo sát môi trường chiết (pH) Môi trường chiết yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất trình chiết Các mẫu tiến hành chiết pH khác cho hiệu suất chiết khác Để đánh giá độ thu hồi chất phân tích pH khác ta tiến hành xử lý mẫu chọn axit TCA vừa kết tủa protein vừa tạo môi trường pH chiết Tương tự khảo sát dung môi chiết, sau chọn hệ dung môi tối ưu cho trình chiết, tiến hành khảo sát mơi trường chiết Q trình lấy mẫu huyết tương, mẫu chuẩn nội chuẩn thêm vào cùng thể tích khảo sát dung môi tách chiết Tiến hành cân gam axit TCA pha thành 100 ml dung dịch axit TCA nồng độ 1% để đạt pH = 1, sau pha lỗng dung dịch dùng máy đo pH để có dung dịch pH = 2, 3, Lấy ml huyết Sau khảo sát tìm điều kiện tối ưu, phương pháp thẩm định qua sai số, độ lặp lại (3,7% nồng độ 100 ng/ml), độ thu hồi từ 78 đến 82% tương ứng với nồng độ chuẩn thêm vào 25 400 ng/ml Khoảng tuyến tích đường chuẩn định lượng từ đến 400 ng/ml với R2 = 0,9974 Mẫu huyết tương không chứa THC-COOH thêm chuẩn để xác định độ ảnh hưởng nên mẫu, kết cho thấy ảnh hưởng mẫu khoảng nồng độ thử nghiệm từ đến 100 ng/ml nhỏ 15% Quy trình phân tích THC-COOH mẫu máu với bước thực đưa hình Bảng 3: Kết định lượng hàm lượng THCCOOH mẫu thực ml máu Lắc xoáy mẫu 10 phút, sau ly tâm Thêm 1ml TCA, pH=4, 10 μl IS 200 ng/ml Thu lớp dung dịch bên Thêm 3ml hexan/etylaxetate (9:1, v/v) Lắc 10 phút, ly tâm phân lớp Thu dịch chiết, loại nước Na2SO4 khan Cô chân không, thu cặn chiết TT M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 STHC-COOH/ Hàm lượng THCSTHC-COOH-d3 COOH (ng/ml) 0.088 25,61 0.136 40,15 0.147 43,48 0.164 48,64 0.083 24,09 0.144 42,58 0.152 45,00 0.148 43,79 0.082 23,79 Kết phân tích mẫu dương tính que thử miễn dịch cần sa cho thấy tất mẫu máu kiểm tra có ma túy Đối tượng có tiền sử sử dụng cần sa đối tượng sử dụng cần sa có hàm lượng THC-COOH phát với hàm lượng cao đối tượng sử dụng thời điểm lấy mẫu Hòa tan cặn chiết 20 µl CH3OH Bơm µl vào LC-MS/MS Hình Quy trình phân tích THC-COOH máu KẾT LUẬN Độ tuyến tính đường chuẩn thể hình Khoảng tuyến tính đường chuẩn tương tự với kết nghiên cứu Concheiro cộng [6] Nghiên cứu tập trung vào THC-COOH, chất chuyển hóa máu người sử dụng cần sa, xây dụng quy trình tách chiết, phân tích thiết bị LC-MS/MS Đây nghiên cứu phân tích THC-COOH máu Việt Nam Điều kiện phân tích máy, yếu tố ảnh hưởng dung môi tách chiết môi trường pH khảo sát Dung môi tách chiết hexane/etylaxetate (9:1, v/v) pH = điều kiện tối ưu phương pháp phân tích THCCOOH LC-MS/MS Các yếu tố ảnh hưởng mẫu, độ chọn lọc độ thu hồi nghiên cứu Kết thể phương pháp quy trình phân tích phù hợp đáp ứng yêu cầu độ độ xác Từ nhu cầu thực tiễn, quy trình áp dụng để phân tích mẫu thực tế từ vụ án Cụ thể, mẫu máu khẳng định dương tính với ma túy Bên cạnh đó, kết hàm lượng THC-COOH thu mẫu máu đánh giá tiền sử mức độ sử dụng cần sa Phương pháp chiết lỏng lỏng phân tích trực tiếp LC-MS/MS không qua dẫn xuất giúp rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu chi phí phân tích Khơng thế, quy trình phân tích ứng dụng cho sở địa phương đáp ứng đủ trang thiết bị phịng thí nghiệm 1.4 y = 0.0033x - 0.0057 R² = 0.9974 1.2 Hệ số f 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 100 200 300 Nồng độ THC-COOH (ng/ml) 400 Hình Đường chuẩn xác định THC-COOH thiết bị LC-MS/MS Sau xây dựng thẩm định phương pháp, quy trình áp dụng để phân tích với mẫu máu dương tính với que thử miễn dịch cần sa thu từ vụ án mà quan Điều tra gửi đến Viện Khoa học hình Các thơng tin mẫu mã hóa từ M1-M9 để đảm bảo tính bảo mật thơng tin Kết thu thể bảng TÀI LIỆU THAM KHẢO United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC), 2014, World Drug Report 2014 United Nations Publication Del Mar Ramirez Fernandez, M., et al., 2008, Simultaneous analysis of THC and its metabolites in blood using liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 875(2): p 465-70 Teixeira, H., et al., 2007, Validated method for the simultaneous determination of Δ9THC and Δ9-THC-COOH in oral fluid, urine and whole blood using solid-phase extraction and liquid chromatography–mass spectrometry with electrospray ionization Forensic Science International 170(2): p 148-155 Gustafson, R.A., et al., 2003, Validated method for the simultaneous determination of Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC), 11hydroxy-THC and 11-nor-9-carboxy- THC in human plasma using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry with positive chemical ionization Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 798(1): p 145-154 Thomas, A., et al., 2007, Fast gas chromatography and negative-ion chemical ionization tandem mass spectrometry for forensic analysis of cannabinoids in whole blood Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 45(3): p 495-503 Concheiro, M., et al., 2013, Simultaneous quantification of Δ9-tetrahydrocannabinol, 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and cannabinol in oral fluid by microflow-liquid chromatography–high resolution mass spectrometry Journal of Chromatography A 1297: p 123-130 Tiscione, N.B., et al., 2016, An Efficient, Robust Method for the Determination of Cannabinoids in Whole Blood by LC-MSMS J Anal Toxicol 40(8): p 639-648 Stephanson, N., et al., 2008, Accurate identification and quantification of 11-nordelta(9)-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine drug testing: evaluation of a direct high efficiency liquid chromatographic-mass spectrometric method J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 871(1): p 101-8 Stefanelli, F., et al., 2018, A novel fast method for aqueous derivatization of THC, OH-THC and THC-COOH in human whole blood and urine samples for routine forensic analyses Biomed Chromatogr 32(4) 10 Han, E., et al., 2011, Simultaneous analysis of Δ(9)-tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol in hair without different sample preparation and derivatization by gas chromatographytandem mass spectrometry J Pharm Biomed Anal 55(5): p 1096-103 11 Kim, J.Y., et al., 2008, Simultaneous determination of amphetamine-type stimulants and cannabinoids in fingernails by gas chromatography-mass spectrometry Arch Pharm Res 31(6): p 805-13 12 Lemos, N.P., R.A Anderson, and J.R Robertson, 1999, Nail Analysis for Drugs of Abuse: Extraction and Determination of Cannabis in Fingernails by RIA and GC-MS Journal of Analytical Toxicology 23(3): p 147-152 Tác giả liên hệ: Phan Quang Thăng, Viện Công Nghệ Môi Trường, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Nhà A30, số 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Email: thangpq@ietvn.vn ... NGHỆ Đỗ Thị Hiếu NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 11- NOR- 9- CARBOXY- THC TRONG MÁU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KÉP (LC- MS/ MS) Chuyên ngành: Hóa học phân tích Mã số: 844 0118 LUẬN VĂN... định ma túy, đề tài tập trung ? ?Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích 11- nor- 9cacboxyl-delta -9- tetrahydrocannabinol máu thiết bị sắc ký lỏng khối phổ kép LC -MS/ MS” nhằm kiểm tra phát đối tượng... (GC -MS) : Việc phân tích THC- COOH máu phù hợp với khả thiết bị sắc ký khí (GC) kết nối detector khối phổ (MS) , kết phân tích có độ xác cao Ngun tắc hoạt động sắc ký khí: Sắc ký trình tách dựa phân