Với cùng lượng dung môi hòa tan là methanol và số lần chiết, mẫu được chiết với phương pháp: siêu âm 10 phút sau cách thủy ở nhiệt độ ph ng, 4 , 5 , 6 , 7 , 80°C trong 15 phút. Dựa vào tín hiệu diện tích pic rutin thu được giữa các mẫu thử ứng mỗi điều kiện chiết. Kết quả thu được:
Bảng 2.3. T lệ dung môi và số lần chiết Rutin ST
T
Phương pháp chiết
T lệ nguyên
liệu dung môi Nhiệt độ oC)
Số lần chiết
Diện tích đ nh
1 Siêu âm 1/200 Nhiệt độ
ph ng 3 14.3960 2 Siêu âm kết hợp cách thủy 1/200 40 3 16.4855 50 16.8973 60 16.9716 70 18.8887 80 27.6755
Nhận xét: Phương pháp chiết ở nhiệt độ 8 oC cho hiệu suất chiết cao hơn các nhiệt độ khác lần lượt là : - 1.92 lần nhiệt độ ph ng ; - 1.68 lần nhiệt độ 40oC); - 1.64 lần nhiệt độ 50oC); - 1.63 lần nhiệt độ 60oC); - 1.46 lần nhiệt độ 70oC); Do đó chọn nhiệt độ 8 oC cho quy tr nh chiết tối ưu.
3.2.3. Khảo sát số ần chiết
Hình 3.8. Sắc ký đồ dịch chiết gộp sau 3 lần chiết và lần chiết thứ 4
Nhận xét: khi giảm lượng dược liệu xuống c n .01gram, t lệ MeOH 1 10 x 3 lần .01gram dược liệu 3 ml MeOH – 1 ml DM cho 1 lần chiết lượng Rutin trong dược liệu hầu như đã được chiết kiệt qua 3 lần chiết.
Tại lần chiết thứ 4, lượng rutin còn lại trong mẫu là không đáng kể, nằm dưới ngưỡng phát hiện của thiết bị không xác định được đ nh pic, píc h nh răng cưa, chiều cao của pic thấp < .1m U), chứng tỏ phương pháp đã chiết kiệt hoạt chất rutin sau 3 lần chiết. Do đó, chọn số lần chiết là 3 lần.
Kết luận: Để rút ngắn số lần chiết, gộp lượng dung môi của 3 lần chiết ở t lệ 1/1000 thành 1/3000 và chiết một lần. Quy tr nh được rút gọn như sau:
Cân 0.01 g bột hoa hòe thêm 30ml MeOH Cách thủy siêu âm trong 1 phút sau đó đun cách thủy ở 80°C trong 15 phút, lọc và rửa bã dược liệu bằng 5ml MeOH. Dịch chiết đem cô đến cắn, cắn thu được h a tan trong pha động vừa đủ
50ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m vào vial Tiến hành phân tích bằng UHPLC/UV
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình chiết Rutin tối ưu định lượng bằng UHPC/UV Kết quả khảo sát cho thấy chiết một lần ở t lệ 1/3000 (0.01g/30ml) và chiết 3 lần chiết ở t lệ 1 1 . 1g 1 ml x 3 lần cho hiệu xuất tương đương. H nh 3.1
H nh 3.1 Kết quả khảo sát một lần ở t lệ 1/3000 (0.01g/30ml) và chiết 3 lần chiết ở t lệ 1 1 . 1g 1 ml x 3 lần .
3.3. Kết quả thẩm định quy trình định ƣợng Rutin bằng phƣơng pháp UHPLC/UV UHPLC/UV
3.3.1. Tính tƣơng thích hệ thống
Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp cho lần lượt dung dịch chuẩn và thử
3.3.1.1. í tươ t í th đ v ẫu u
Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn Rutin
Hình 3.11. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký dung dịch chuẩn Rutin Nhận xét: Từ bảng kết quả cho thấy:
- RSD% của thông số thời gian lưu < 2%. (0.28%). - RSD% của diện tích đ nh < 2%. (0.62%).
- Hệ số bất đối 1.1 (TB = 1.09) - Độ phân giải Rs > 1.5 (TB = 4.57) - Số đĩa lý thuyết N> 2000 (TB = 2742).
Kết luận: Quy tr nh đạt tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn.
3.3.1.2. í tươ t í th đ v ẫu t
Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp cho dung dịch mẫu thử
Hình 3.12. Sắc ký đồ và kết quả sắc ký mẫu thử hoa h e Nhận xét: Từ bảng kết quả cho thấy:
- RSD% của thông số thời gian lưu < 2%. (0.22%). - RSD% của diện tích đ nh < 2%. (0.17%).
- Hệ số bất đối 1.2 (TB = 1.18) - Độ phân giải Rs > 1.5 (TB = 2.4)
- Số đĩa lý thuyết N > 2000 (TB = 3190).
3.3.2. Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký các mẫu đã chuẩn bị theo điều kiện sắc ký tối ưu đã khảo sát. Kết quả thu được như sau:
Hình 3.13. Sắc ký đồ tính đặc hiệu của rutin Nhận xét :
- Trên sắc ký đồ dung môi pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của Rutin trên sắc ký đồ mẫu chuẩn.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử, do trong mẫu thử có Rutin nên có xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của rutin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tín hiệu pic rutin tăng lên rõ rệt. Kết luận : Phương pháp có tính đặc hiệu đạt yêu cầu .
3.3.3. Tính tuyến tính
Đường chuẩn được xây dựng với 6 nồng độ các dung dịch chuẩn Rutin lần lượt là: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm và 100 ppm.
Hình 3.14 . Sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn Rutin: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm và 100 ppm.
Bảng 2.3. Kết quả sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn Rutin: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm và 100 ppm. STT Nồng độ (ppm) tR ph t S (mAU) h (mAU) 1 1 4.916 0.4052 1.81 2 10 4.875 5.4220 23.81 3 20 4.866 11.3762 49.70 4 30 4.841 17.0920 73.67 5 50 4.816 28.1573 120.16 6 75 4.866 41.5763 180.43 7 100 4.866 55.4282 240.15
Hình 3.15 . Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của rutin Bảng 3.3 Bảng phân tích tuyến tính của Rutin
Ftn = 29608 > F (0.05,1,5) = 230.16 ta = 172.06 > t (0.05,3) = 2.57 tb = 0.69 < t (0.05,3) = 2.57 Phương tr nh tuyến tính y = 0.5546x + 0.1186 R2 0.9998
N ận ét : Sử dụng test F và T để kiểm tra cho thấy phương tr nh tuyến tính của rutin có tính tương quan, hệ số a của phương tr nh có ý nghĩa và hệ số b của phương tr nh không có ý nghĩa.
t luận :
- Trong khoảng nồng độ 1- 100ppm th diện tích pic và nồng độ của rutin phụ thuộc tuyến tính với hệ số tương quan R2 lần là .9998
3.3.4. Độ chính xác trong ngày
• Tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập trong ngày.
Hình 3.16 . Sắc ký đồ và kết quả sắc ký của các dung dịch Mẫu thử
Nhận xét: Phương pháp có độ chính xác (theo O C-mức hàm lượng 10 – 100PPM), độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tich pic Rutin có giá trị không quá < 7.3% (0.88%).
H nh 3.17. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 40ppm (80%)
H nh 3.18. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 5 ppm 1
H nh 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử đánh giá độ đúng Bảng 3.6 . Kết quả thẩm định độ đúng Ho t chất ƣợng thêm vào (ppm) Diện tích píc ƣợng tìm thấy (ppm) T lệ thu hồi ( % ) Yêu cầu Kết luận M u th 27.9366 Rutin 40 50.4445 40.37 100.93 80% – 110% Đ t 50.6800 41.79 101.99 50.6722 41.78 101.95 RSD% (n = 3) 0.26% < 7.3% Đ t 50 55.9599 50.32 100.63 80% – 110% Đ t 55.7104 49.87 99.73 55.6193 49.70 99.40 RSD% (n = 3) 0.32% < 7.3% Đ t 60 61.8433 60.92 101.54 80% – 110% Đ t 61.7616 60.78 101.29 61.4573 60.23 100.38 RSD% (n = 3) 0.33% < 7.3% Đ t RSD% (n = 9) 0.91% < 7.3% Đ t
Nhận xét: Phương pháp có đạt độ đúng theo O C-mức hàm lượng 10 – 100PPM , độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tich pic Rutin n = 9 có giá trị không quá < 7.3% .88 . Lượng chất phân tích t m thấy nằm trong khoảng 80% – 110% (99.4% - 101.99%).
3.4. Giới h n phát hiện OD và giới h n định ƣợng (LOQ) 3.4.1. Giới h n phát hiện OD
H nh 3.21. Sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ .5ppm, .25ppm, .125ppm và 0.0625ppm
Nhận xét: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nồng độ . 625ppm có xuất hiện pic của Rutin cao hơn nhiễu đường nền nhiều lần > 3 lần , tuy nhiên h nh dạng pic răng cưa, không c n cân đối và nằm ngoài ngưỡng xác định của thiết bị cho giá trị: n.a.). Do đó có giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0.125ppm
3.4.2. Giới h n định ƣợng OQ
LOQ = LOD x 3.3 => LOQ = 0.125ppm x 3.3 = 0.4525ppm
3.4.3. Tính OD, LOQ dự vào đƣờng chuẩn
Như vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng rutin của phương pháp phù hợp là : LOD = .125ppm; LOD = 0.45ppm
3.5. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dich m u th
H nh 3.22 Sắc ký đồ và kết quả độ ổn định mẫu thử theo thời gian Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ ổn định dịch chiết
Thời gian (giờ) Diện tích píc Diện tích píc n đầu
% so với ban đầu 1 26.3366 26.3366 100.00% 2 26.2606 99.71% 4 26.2738 99.76% 8 26.4989 100.62% 16 26.3049 99.88% 24 26.2778 99.78% 48 26.0558 98.93% êu u 98% - 102% ạt
Nhận xét: Kết quả cho thấy dịch chiết Rutin ổn định trong 48 giờ.
Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Sau khi tham khảo các tài liệu , nhóm tiến hành khảo sát điều kiện pha động với các thành phần như sau:
- MeOH : Nước (50:50): Xuất hiện pic rutin, tuy nhiên pic rutin chưa tách tạp - CN : Nước (50:50): Pic rutin không tách được tạp, kéo chân, Pic không cân đối
- MeOH : A.Formic 1% pH 2.5 (50:50): Pic rutin tách khỏi tạp, thời gian rửa giải ngắn tR = 2.290 phút)
- MeOH : A.Formic 1% pH 2.65 (50:50): Pic rutin tách khỏi tạp, thời gian rửa giải có tăng lên so với điều kiện 3 tR = 2.907 phút)
- MeOH : A.Formic 1% pH 3.0 (50:50): Pic rutin tách xa khỏi tạp, thời gian rửa giải có tăng lên thêm thời gian rửa giải có tăng lên so với điều kiện 4 tR = 3.599 phút).
Từ kết quả trên, nhóm đã chọn hệ pha động MeOH : .formic .1 pH 3. làm điều kiện sắc ký ban đầu để tiếp tục khảo sát thêm nhằm làm tăng thời gian rửa giải và điều ch nh các thông số sắc ký. Các t lệ khảo sát như sau: MeOH : A.formic 0.1% pH 3.0 (45 : 55, 48 : 52, 52 : 48, 55 : 45…).
Hình 4.1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : .formic .1 pH 3. , t lệ 48 : 52
Kết quả: Ở hệ pha động MeOH : .formic .1 pH 3. t lệ 48 : 52 là tối ưu nhất, thời gian rửa giải tăng lên 4,891 phút , chân pic gọn hơn và h nh dạng pic cân đối, các thông số sắc ký đều đạt.
Dựa trên sắc ký đồ mẫu chuẩn cho thấy tại bước sóng 36 nm, pic của Rutin cho tin hiệu cao ở bước sóng 255nm. Qua đó chọn bước sóng 36 nm là bước sóng định lượng cho rutin. Qua thực nghiệm lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu khảo sát mẫu như sau:
• Cột sắc ký Phenomenex Gemini RP-C18 (200 mm x 4,6 mm; 5 m). • Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
• Thể tích tiêm mẫu: 20 l. • Bước sóng định lượng: 360 nm.
• Pha động: MeOH và acid formic 0,1% pH 3.0 (48 : 52). • Thời gian phân tích 15 phút.
4.2. Quy trình chiết kiệt Rutin 4.2.1. Dung môi chiết: 4.2.1. Dung môi chiết:
Qua thực nghiệm cho thấy chiết mẫu bằng MeOH là phù hợp nhất v chiết được nhiều rutin nhất trong các dung môi đã khảo sát CN, MeOH,Etyl acetat và Ethanol . Nên chọn MeOH làm dung môi chiết mẫu.
4.2.2. Nhiệt độ chiết:
Sau khi khảo sát với phương pháp: siêu âm 1 phút sau đó cách thủy ở nhiệt độ ph ng, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 °C trong 15 phút. Dựa vào tín hiệu diện tích pic rutin thu được cho thấy chiết ở nhiệt độ 8 o
C cho hiệu suất chiết > nhiệt độ 7 oC > nhiệt độ 6 o
C > nhiệt độ 5 oC > nhiệt độ 4 oC > nhiệt độ ph ng. Nên chọn nhiệt độ 80oC để chiết mẫu h nh 3.7 .
4.2.3. Số ần chiết:
Do hàm lượng Rutin trong dược liệu cao việc cân mẫu được điều ch nh từ 1 gram xuống c n . 1 gram giảm 1 lần và giảm lượng dung môi chiết MeOH) xuống 1/2 (10ml) nhằm giảm lượng dung môi sử dung đồng thời tăng t lệ dược liệu dung môi từ 1 6 lên 1 3000 khả năng chiết kiệt Rutin trong dược liệu qua 3 lần chiết), dung dịch h a tan cắn có độ pha loãng 5 lần, lọc qua màng lọc .45m trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Bã dược liệu c n lại được chiết tiếp với 1 ml
MeOH, lọc và bổ xung vừa đủ 5 ml bằng pha động lọc qua màng lọc .45m trước khi tiêm vào hệ thống HPLC h nh 3.8).
Nhận xét: qua khảo sát cho thấy dùng MeOH chiết xuất rutin là phù hợp nhất, thu được nhiều Rutin do đó chọn MeOH làm dung môi chiết. Đồng thời đề xuất: Giảm lượng dược liệu xuống c n . 1gram, t lệ MeOH 1 1 x 3 lần . 1gram dược liệu 3 ml MeOH tương đương1 ml DM cho 1 lần chiết , nhiệt độ chiết 8 o
C.
t quả: Tại lần chiết thứ 4, lượng rutin còn lại trong mẫu là không đáng kể, nằm dưới ngưỡng phát hiện của thiết bị không xác định được đ nh pic, píc h nh răng cưa, chiều cao của pic thấp < .1m U , chứng tỏ phương pháp đã chiết kiệt hoạt chất rutin sau 3 lần chiết
Để giảm số lần chiết, gộp lượng dung môi của 3 lần chiết ở t lệ 1/1000 là 1/3000 nhằm rút ngắn thời gian phân tích mẫu). Quy tr nh được rút gọn như sau:
Cân 0.01 g bột hoa hòe thêm 30ml MeOH Cách thủy siêu âm trong 1 phút sau đó đun cách thủy ở 80°C trong 15 phút, lọc và rửa bã dược liệu bằng 5ml MeOH. Dịch chiết đem cô đến cắn, cắn thu được h a tan trong pha động vừa đủ 50ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m vào vial Tiến hành phân tích bằng UHPLC/UV (hình 3.9).
Kết quả khảo sát cho thấy chiết một lần ở t lệ 1 3 . 1g 3 ml và chiết 3 lần chiết ở t lệ 1 1 . 1g 1 ml x 3 lần cho hiệu xuất tương đương (h nh 3.10).
4.3. Thẩm định phƣơng pháp:
ươ t í t Qua 6 lần tiêm liên tiếp cho mẫu chuẩn và 6 lần tiêm liên tiếp cho mẫu thử cho thấy quy tr nh đạt tính tương thích hệ thống trên cả mẫu chuẩn và mẫu thử h nh 3.11 và h nh 3.12). Các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu:
• RSD của thời gian lưu và diện tích đ nh của rutin sau 6 lần tiêm < 2,0%. • Hệ số đối xứng ,8 ≤ s ≤ 1,5.
• Độ phân giải (Rs) > 1,5. • Số đĩa lý thuyết N > 2000.
í đặ u: Trên sắc ký đồ dung môi pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của Rutin trên sắc ký đồ
mẫu chuẩn và trên sắc ký đồ mẫu thử có xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của Rutin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, đồng thời trên sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tín hiệu pic rutin tăng lên rõ rệt. Cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu đạt yêu cầu h nh 3.13 ..
í tuy tí Trong khoảng nồng độ 1ppm - 1 ppm, đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của Rutin: Y = 0.5546X + 0.1186, có hệ số tương quan R2 = .9998 nên đạt yêu cầu về tính tuyến tính. Tuy nhiên ở những nồng độ thấp hơn 1ppm đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của Rutin vẫn có hệ số tương quan R2 > 0.99, cụ thể khi đưa các giá trị của diện tích pic các dung dịch chuẩn trong phần t m giới hạn phát hiện LOD ở các nồng độ : .5ppm, .25ppm, .125ppm th đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của Rutin là: Y = 0.5557X + 0.0045, có hệ số tương quan R2 = 0.9999. Cho thấy phương pháp có khoảng tuyến tính rộng.
Hình 4.2. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tich pic của rutin ở các nồng độ