4.2.1. Dung môi chiết:
Qua thực nghiệm cho thấy chiết mẫu bằng MeOH là phù hợp nhất v chiết được nhiều rutin nhất trong các dung môi đã khảo sát CN, MeOH,Etyl acetat và Ethanol . Nên chọn MeOH làm dung môi chiết mẫu.
4.2.2. Nhiệt độ chiết:
Sau khi khảo sát với phương pháp: siêu âm 1 phút sau đó cách thủy ở nhiệt độ ph ng, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 °C trong 15 phút. Dựa vào tín hiệu diện tích pic rutin thu được cho thấy chiết ở nhiệt độ 8 o
C cho hiệu suất chiết > nhiệt độ 7 oC > nhiệt độ 6 o
C > nhiệt độ 5 oC > nhiệt độ 4 oC > nhiệt độ ph ng. Nên chọn nhiệt độ 80oC để chiết mẫu h nh 3.7 .
4.2.3. Số ần chiết:
Do hàm lượng Rutin trong dược liệu cao việc cân mẫu được điều ch nh từ 1 gram xuống c n . 1 gram giảm 1 lần và giảm lượng dung môi chiết MeOH) xuống 1/2 (10ml) nhằm giảm lượng dung môi sử dung đồng thời tăng t lệ dược liệu dung môi từ 1 6 lên 1 3000 khả năng chiết kiệt Rutin trong dược liệu qua 3 lần chiết), dung dịch h a tan cắn có độ pha loãng 5 lần, lọc qua màng lọc .45m trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Bã dược liệu c n lại được chiết tiếp với 1 ml
MeOH, lọc và bổ xung vừa đủ 5 ml bằng pha động lọc qua màng lọc .45m trước khi tiêm vào hệ thống HPLC h nh 3.8).
Nhận xét: qua khảo sát cho thấy dùng MeOH chiết xuất rutin là phù hợp nhất, thu được nhiều Rutin do đó chọn MeOH làm dung môi chiết. Đồng thời đề xuất: Giảm lượng dược liệu xuống c n . 1gram, t lệ MeOH 1 1 x 3 lần . 1gram dược liệu 3 ml MeOH tương đương1 ml DM cho 1 lần chiết , nhiệt độ chiết 8 o
C.
t quả: Tại lần chiết thứ 4, lượng rutin còn lại trong mẫu là không đáng kể, nằm dưới ngưỡng phát hiện của thiết bị không xác định được đ nh pic, píc h nh răng cưa, chiều cao của pic thấp < .1m U , chứng tỏ phương pháp đã chiết kiệt hoạt chất rutin sau 3 lần chiết
Để giảm số lần chiết, gộp lượng dung môi của 3 lần chiết ở t lệ 1/1000 là 1/3000 nhằm rút ngắn thời gian phân tích mẫu). Quy tr nh được rút gọn như sau:
Cân 0.01 g bột hoa hòe thêm 30ml MeOH Cách thủy siêu âm trong 1 phút sau đó đun cách thủy ở 80°C trong 15 phút, lọc và rửa bã dược liệu bằng 5ml MeOH. Dịch chiết đem cô đến cắn, cắn thu được h a tan trong pha động vừa đủ 50ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m vào vial Tiến hành phân tích bằng UHPLC/UV (hình 3.9).
Kết quả khảo sát cho thấy chiết một lần ở t lệ 1 3 . 1g 3 ml và chiết 3 lần chiết ở t lệ 1 1 . 1g 1 ml x 3 lần cho hiệu xuất tương đương (h nh 3.10).
4.3. Thẩm định phƣơng pháp:
ươ t í t Qua 6 lần tiêm liên tiếp cho mẫu chuẩn và 6 lần tiêm liên tiếp cho mẫu thử cho thấy quy tr nh đạt tính tương thích hệ thống trên cả mẫu chuẩn và mẫu thử h nh 3.11 và h nh 3.12). Các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu:
• RSD của thời gian lưu và diện tích đ nh của rutin sau 6 lần tiêm < 2,0%. • Hệ số đối xứng ,8 ≤ s ≤ 1,5.
• Độ phân giải (Rs) > 1,5. • Số đĩa lý thuyết N > 2000.
í đặ u: Trên sắc ký đồ dung môi pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của Rutin trên sắc ký đồ
mẫu chuẩn và trên sắc ký đồ mẫu thử có xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của Rutin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, đồng thời trên sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tín hiệu pic rutin tăng lên rõ rệt. Cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu đạt yêu cầu h nh 3.13 ..
í tuy tí Trong khoảng nồng độ 1ppm - 1 ppm, đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của Rutin: Y = 0.5546X + 0.1186, có hệ số tương quan R2 = .9998 nên đạt yêu cầu về tính tuyến tính. Tuy nhiên ở những nồng độ thấp hơn 1ppm đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của Rutin vẫn có hệ số tương quan R2 > 0.99, cụ thể khi đưa các giá trị của diện tích pic các dung dịch chuẩn trong phần t m giới hạn phát hiện LOD ở các nồng độ : .5ppm, .25ppm, .125ppm th đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của Rutin là: Y = 0.5557X + 0.0045, có hệ số tương quan R2 = 0.9999. Cho thấy phương pháp có khoảng tuyến tính rộng.
Hình 4.2. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tich pic của rutin ở các nồng độ nhỏ hơn 1ppm
đú : Lượng Rutin t m lại được từ các mẫu thử thêm chuẩn ở các mức chất chuẩn thêm vào lần lượt là: 4 ppm nồng độ 8 , 5 ppm nồng độ 1 , 6 ppm nồng độ 12 đêu nằm trong phoảng 95% - 105 , với độ lệch chuẩn tương đối RSD n = 9 là: .91
ạ át (L ) Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nồng độ . 625ppm có xuất hiện pic của Rutin cao hơn nhiễu đường nền nhiều lần > 3 lần , tuy nhiên h nh dạng pic răng cưa, không c n cân đối và nằm ngoài ngưỡng
xác định của thiết bị cho giá trị: n.a. . Do đó có giới hạn phát hiện của phương
pháp LOD = 0.125ppm. Từ đây tính được giới hạn định lượng LOQ của phương pháp là:
LOQ = LOD x 3.3 => LOQ = 0.4525ppm (0.125ppm x3.3)
ựa v o đường c u n
Như vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng rutin của phương pháp phù hợp là : LOD = 0.125ppm; LOD = 0.45ppm đị dị t ẫu Qua thực nghiệm cho thấy độ ổn định của dịch chiết hoa hòe là 48 giờ ở nhiệt độ phòng h nh 3.21 . í á tro y Sau khi tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập trong ngày hàm ẩm trong mẫu là 9.12 , cho thấy phương pháp có độ chính xác, độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tich pic Rutin có giá trị không quá 3.7% (0.88%) h nh 3.16 . Công thức tính hàm lượng rutin :
Trong đó:
St là diện tích đ nh của mẫu thử
Sc là diện tích đ nh của mẫu chuẩn
Mc là lượng cân chất chuẩn
Mt là lượng cân mẫu thử
C% là hàm lượng chất chuẩn
b là độ ẩm của mẫu thử
Dt là độ pha loãng của mẫu thử
Bảng 4.1 . Kết quả hàm lượng rutin trong mẫu thực nghiệm h nh 3.22 M u th ƣợng cân (g) Diện tích đ nh S (mAU) Độ ph o ng ần Độ ẩm (%) Hàn ƣợng rutin trong m u (%) Chuẩn 0.01009 30.2992 200 1 0.01007 27.1609 50 9.12 23.35 2 0.01007 27.2017 50 9.12 23.38 3 0.00994 26.8941 50 9.12 23.42 4 0.01011 27.5695 50 9.12 23.61 5 0.00999 26.9327 50 9.12 23.34 6 0.01010 27.1393 50 9.12 23.26 Trung ình 23.39
Yêu cầu: Hàm ƣợng rutin trong dƣợc liệu h ng ít hơn 20,0
K T UẬN
Qua quá tr nh thực nghiệm nhóm đã xây dựng được quy tr nh định lượng Rutin trong dược liệu hoa h e bằng phương pháp UPLC UV đạt các yêu cẩu thẩm định theo O OC như sau:
P ươ á sắc ký lỏng (theo V V - Phụ lục 5.3).
P a động: MeOH - A.cid formic 0,1% pH 3.0 (48 : 52). Dung dịch A.cid formic 0,1% pH 3.0 : Hút 1 ml .cid formic cho vào b nh định mức 1 ml, thêm nước cất vừa đủ đến vạch. Điều ch nh đến pH 3,0 bằng A.cid formic 1%(TT).
Dung dịch th : Cân 0.01 g bột hoa hòe thêm 30ml MeOH Cách thủy siêu âm trong 1 phút sau đó đun cách thủy ở 8 °C trong 15 phút, lọc và rửa bã dược liệu bằng 5ml MeOH. Dịch chiết đem cô đến cắn, cắn thu được h a tan trong pha động vừa đủ 5 ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m vào vial trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.
ung dịc c u n gốc rutin nồng độ ppm: Cân chính xác 10mg chất chuẩn rutin cho vào b nh định mức 1 ml, thêm khoảng 7 ml methanol, siêu âm 15 phút, bổ sung vừa đủ methanol đến vạch.
ung dịc c u n l m việc 5 ppm: Hút chính xác 0,5mL dung dịch chuẩn gốc Rutin 1000 ppm cho vào b nh định mức 1 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng ,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.
Điều kiện sắc ký:
• Hệ thống sắc ký UHPLC/UV Thermo
• Cột sắc ký Phenomenex Gemini RP-C18 (200 mm x 4,6 mm; 5 m). • Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
• Thể tích tiêm mẫu: 20 ul.
• Detector quang phổ tử ngoại đặt tại bước sóng 360 nm. • Pha động: MeOH và acid formic 0,1% pH 3.0 (48 : 52). • Thời gian phân tích 3 lần thời gian lưu của rutin.
Cách ti n hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống; Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, hệ số đối xứng của pic rutin nằm trong khoảng 0,8 ≤ As ≤ 1,5. Độ lệch chuẩn
tương đối RSD của thời gian lưu và diện tích đ nh của rutin sau 6 lần tiêm lặp lại < 2,0%. Độ phân giải Rs > 1,5. Số đĩa lý thuyết (N) > 2000.
Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng của rutin C27H30O16 trong chế phẩm từ diện tích pic rutin trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C27H30O16 chuẩn và hàm ẩm của dược liệu hoa h e.
Công thức tính kết quả:
Trong đó: St là diện tích đ nh của mẫu thử
Sc là diện tích đ nh của mẫu chuẩn
Mc là lượng cân chất chuẩn
Mt là lượng cân mẫu thử
C% là hàm lượng chất chuẩn
b là độ ẩm của mẫu thử
Dt là độ pha loãng của mẫu thử
Dc là độ pha loãng của mẫu chuẩn
Tuy nhiên: Do thời gian có hạn nên chưa đánh giá toàn diện được độ chính xác của phương pháp, phương pháp được xây dựng nêu trên ch mang tính thực nghiệm. V vậy, ngoài độ chính xác trong ngày độ lặp lại đã thực hiện được cần thực hiện thêm độ chính xác trung gian và cả độ sao chép lại nếu điều kiện cho phép , nhằm đánh giá toàn diện mức độ tin cậy của phương pháp trước khi có thể áp dụng kiểm tra các mẫu thực tế. .
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản học, 2004, tr 298-299
2. Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, 2017, trang 1195-1196
3. Nguyễn Tư Đạt, Nghiên cứu bào chế Phytosome Rutin, Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dưoc học - Đại học Quốc gia Hà Nội, 2017
Tiếng Anh
4. British Phamarcopoeia 2013
5. Lee SuanChua, A review on plant-based rutin extraction methods ar its pharmacological activities, Journal of Ethnopharmacology, Volum 150, Issue 3, 12 December 2013, Pages 805-817
6. AdityaGaneshpurkar, Ajay K.Saluja, The Pharmacological Potential c Rutin, Saudi Pharmaceutical Journal, Volume 25, Issue 2, Februar 2017, Pg 149-164 7. Shrestha Sharma, Asgar Ali, Javed Ali, Jasjeet K. Sahni & Sanjul Baboota,
Rutin: therapeutic potential and recent advances in dru delivery, Journal Expert Opinion on Investigational Drugs, Volume 22 Issue 8, 2013, Pages 1063-1079 8. C.F.Krewson, J.Naghski, Some Physical Properties of Rutin, Journal o the
American Pharmaceutical Association (Scientific ed.), Volume 41 Issue 11, November 1952, Pages 582-587.
9. Nuray Yildizoğlu-Ari, V. Melih Altan, Orhan Altinkurt, Yusuf Öztürk Pharmacological effects of rutin, Phytotherapy research, Volume5 Issuel, February 1991, Pages 19-23.
10. Taha I. Khalifa, Farid J. Muhtadi, and Mahrnoud M.A. Hassan, Rutin Analytical profiles of drug subtances, vol 12. 89 / 85
11. Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin Francisco Perez- Vizcaino1, Juan Duarte2, Rosario Jimenez2,Celestino Santos-Buelga3, Antonio Osuna4
12. Chuyên đề rutin từ hoa h e Meteor Nguyễn – Academia.edu
PHỤ ỤC PHỤ ỤC 1: Khảo sát điều iện sắc
Hình 1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn tại các hệ pha động khác nhau
Hình 3. Sắc ký đồ mẫu chuẩn tại bước sóng 360nm và 255nm
Hình 4. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : .formic .1 pH 3. , t lệ 48 : 52
PHỤ ỤC 2: Khảo sát dung m i chiết
Hình 5. Sắc ký đồ của dịch chiết Rutin bằng các dung môi khác nhau
Hình 7. Sắc ký đồ của dịch chiết Rutin ở các nhiệt độ khác nhau
PHỤ ỤC 3: Tính tƣơng thích hệ thống
Hình 10. Sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn hệ pha động MeOH : .formic .1 pH 3. , t lệ 48 : 52
Hình 11. Sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu thử hệ pha động MeOH : .formic .1 pH 3. , t lệ 48 : 52
PHỤ ỤC 4: Tính đặc hiệu
Hình 12 . Sắc ký đồ tính đặc hiệu của rutin
PHỤ ỤC 5: Tính tuyến tính
H nh 13 . Sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn Rutin: 1ppm, 10ppm, 20ppm, 30ppm, 50ppm, 75ppm và 100 ppm.
PHỤ ỤC 6: Độ đ ng
Hình 14. Sắc ký đồ của dung dịch Mẫu thử
H nh 16. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 5 ppm 1
PHỤ ỤC 7: OD và OQ
H nh 18. Sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ .5ppm, .25ppm, .125ppm và 0.0625ppm
PHỤ ỤC 7: Độ ổn định dung dịch m u th
H nh 19. Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát độ ổn định mẫu thử
PHỤ ỤC 8: Độ chính xác
H nh 21. Sắc ký đồ mẫu chuẩn đánh giá độ chính xác