Nghiên Cứu Chuyển Hóa Pectin Tạo Pectic Oligosaccharide Bằng Endo Polygalacturonase Và Khảo Sát Hoạt Tính Sinh Học

NGUYỄN HOOFNGF LY BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN HỒNG LY CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA PECTIN TẠO PECTIC OLIGOSACCHARIDE BẰNG ENDO POLYGALACTURONASE VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA 2012B Hà Nội – Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG LY NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA PECTIN TẠO PECTIC OLIGOSACCHARIDE BẰNG ENDO POLYGALACTURONASE VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chun ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS TS ĐẶNG THỊ THU Hà Nội – Năm 2014 Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS ĐẶNG THỊ THU PGS.TS NGUYỄN THỊ XN SÂM - Phịng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình định hướng, hướng dẫn, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học – Đại học Lâm nghiệp, người thiết kế hướng dẫn tơi suốt q trình thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên phịng thí nghiệm hóa sinh – vi sinh - sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua khó khăn suốt q trình nghiên cứu Hà Nôi, ngày 29 tháng năm 2014 Nguyễn Hồng Ly Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2014 Nguyễn Hồng Ly Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 Pectic oligosaccharide (POS) 1.1.1 Khái niệm Prebiotic 1.1.2 Một số prebiotic thường gặp .6 1.1.3 Pectic oligosaccharide (POS) 1.1.3.1 Cấu tạo Pectic oligosaccharide 1.1.3.2 Tính chất chung Pectic oligosaccharide 1.1.3.3 Hoạt tính sinh học Pectic oligosaccharide 1.1.3.4 Phương pháp sản xuất Pectic oligosaccharide 11 1.2 Khái quát nguồn chất pectin 13 1.2.1 Pectin 13 1.2.2 Cấu tạo pectin 14 1.2.3 Phân loại pectin 16 1.2.4 Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh dây cho sản xuất POS 18 1.3 Giới thiệu chung enzym thủy phân tạo POS 20 1.3.1 Sơ lược hệ enzym pectinase 20 1.3.2 Giới thiệu Endo- polygalacturonase (EC 3.2.1.15) 23 1.3.2.1 Cấu tạo Endo-polygalacturonase 23 1.3.2.2 Tính chất chế tác dụng Endo- polygalacturonase 24 1.3.2.3 Ứng dụng Endo polygalacturonase 25 1.4 Các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS 25 Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học 2.1 VẬT LIỆU 28 2.1.1 Vật liệu 28 2.1.2 Hóa chất enzyme 28 2.1.3 Môi trường dung dịch sử dụng 28 2.1.4 Thiết bị 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Phương pháp hóa học 30 2.2.1.1 Tách chiết pectin từ chanh leo axit citric 30 2.2.1.2 Xác định số este hóa (DE) pectin 30 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 31 2.2.2.1 Xác định pectin phương pháp canxi pectat 31 2.2.2.2 Xác định đường khử phương pháp DNS (Miller-1959) 32 2.2.2.3 Xác định hoạt độ Endo- polygalacturonase 33 2.2.2.4 Định tính POS phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 34 2.2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện tạo POS theo phương pháp quy hoạch bậc BoxBehnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 34 2.2.3 Phương pháp vi sinh 37 2.2.3.1 Xác định hoạt tính prebiotic POS invitro 37 2.2.3.2 Xác định Lactobacillus 38 2.2.3.3 Xác định Salmonella 38 2.2.3.4 Xác định E.coli 38 2.2.3.5 Xác định Staphylococcus 38 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Hồn thiện quy trình tách chiết pectin từ chanh dây 39 3.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin chanh dây 41 3.2.1 Khảo sát lựa chọn chế phẩm enzym 41 3.2.2 Lựa chọn nồng độ pectin 44 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ enzym đến khả tạo POS 45 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến khả tạo POS 47 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học 3.2.5 Ảnh hưởng pH đến khả tạo POS 49 3.2.6 Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến khả tạo POS 51 3.2.7 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến khả tạo POS 53 3.2.8 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân tạo POS 54 3.3 Thu nhận chế phẩm POS kỹ thuật 58 3.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học POS điều kiện invitro 60 3.4.1 Khả làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi POS 60 3.4.2 Khả làm giảm số lượng vi khuẩn có hại POS 63 3.4.3 Điểm hoạt tính prebiotic 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 77 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DE Degree of esterication DP Mức độ trùng hợp ĐC Đối chứng EPG Endo-polygalacturonase FOS Fructo oligosaccharide GOS Galacto oligosaccharide HMP High methyl pectin IMO Isomalto-oligosaccharides LMP Low methyl pectin PG Polygalacturonase POS Pectic oligosaccharide TLC Sắc kí mỏng XOS Xylo – oligosaccharide Cơng nghệ sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số nghiên cứu sản xuất POS từ nguồn pectin 12 Bảng 1.2 Đặc tính EPG 24 Bảng 2.1 Các biến số khoảng chạy chúng 35 Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm 36 Bảng 3.1 Thành phần pectin tách chiết từ chanh leo 41 Bảng 3.2 Hoạt độ đặc tính chế phẩm pectinase thương mại 42 Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố hàm lượng POS thu điều kiện thủy phân khác 55 Bảng 3.4 Bảng kết phân tích phương sai mơ hình tối ưu phần mềm DX 7.1.5 56 Bảng 3.5 Ảnh hưởng POS tới phát triển vi khuẩn có lợi 60 Bảng 3.6 Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn có hại (107cfu/ml) sau 24 ni môi trường MR bổ sung glucose POS 63 Bảng 3.7 Ảnh hưởng POS tới phát triển đồng thời vi khuẩn có lợi vi khuẩn có hại 65 Luận văn thạc sĩ khoa học Cơng nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Mô tả gắn vi sinh vật bệnh vào thành ruột Hình 1.2 Mô tả tác dụng prebiotic Hình 1.3 Đường prebiotic thể người Hình 1.4 Mơ hình biểu diễn thành phần FOS Hình 1.5 Cấu tạo D-galacturonic acid Pectic oligosaccharide Hình 1.6 Pectin cấu tạo thành tế bào thực vật 13 Hình 1.7 Thành phần cấu trúc pectin 14 Hình 1.8 Công thức Homogalacturonan 15 Hình 1.9 Mơ hình cấu trúc Rhamnogalacturonan I II 16 Hình 1.10 Công thức HM pectin 17 Hình 1.11 Cơng thức LM pectin 17 Hình 1.12 Cơng thức pectin amin hóa 17 Hình 1.13 Quả chanh dây tím chanh dây vàng 19 Hình 1.14 Sơ đồ phân loại enzym pectinase 21 Hình 1.15 Cấu trúc Endo-polygalacturonase từ A.niger 24 Hình 1.16 Cơ chế hoạt động Endo-polygalacturonase 25 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan 33 Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Hình 3.22 S.typhil sau 24h ni glucose, POS, MOS, FOS, Inulin Kết hình 3.18 cho thấy chế phẩm BioMOS POS có khả ức chế mạnh chủng vi khuẩn gây hại FOS Inulin có khả ức chế S aureus mạnh chủng E coli S typhil Thực tế hệ vi sinh vật đường ruột bao gồm loại có hại, có lợi chúng có tác động qua lại với Với mục tiêu nghiên cứu ứng dụng POS làm thực phẩm bổ sung hệ vi sinh vật đường ruột bao gồm loại có hại, có lợi Do đó, nghiên cứu tác động POS tới loại cách đồng ni cấy loại có lợi có hại mơi trường có glucose POS Tiến hành cấy 1% (v/v) canh trường chứa hỗn hợp chủng vi khuẩn bao gồm: L acidophilus, E coli, S typhi S aureus vào ống nghiệm chứa môi trường MRS bổ sung 1% (w/v) POS Các ống ni 370C tủ ấm Sau đó, cấy trang mẫu canh trường chứa vi sinh vật thời điểm ban đầu sau 24 môi trường TGA đĩa thạch để xác định số lượng vi khuẩn tổng số; cấy trang môi trường đặc hiệu VRBL, BSA, HSAB, MRS để xác định số lượng vi khuẩn E coli, S typhi, S aureus L acidophilus Bảng 3.7 Ảnh hưởng POS tới phát triển đồng thời vi khuẩn có lợi có hại Chủng thử nghiệm Số lượng khuẩn lạc sau 24 nuôi (x107 cfu/ml) (tỉ lệ 1:1) Vi khuẩn tổng số L1 Vi khuẩn có hại L1 + S enterica Typhi 672,75 ± 7,50 658,25 ± 7,25 14,50 ± 0,01 L1+ E coli0157:H7 616,00 ± 5,85 605,00 ± 6,10 11,00 ± 0,02 619,95 ± 6,05 591,45 ± 6,05 28,50 ± 0,02 L1+ S aureus ATCC 25923 65 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Kết thử nghiệm ảnh hưởng POS tới phát triển hai loại vi khuẩn có lợi có hại chúng ni kết hợp môi trường bảng cho thấy mật độ vi khuẩn tổng số cải thiện có mặt POS so với có glucose, nhiên lượng tăng chủ yếu L acidophilus cịn vi khuẩn có hại sinh trưởng chậm Báo cáo Chen (2013) chứng minh Lactobacillus Bifidobacterium tạo 31,64mM acid acetic, 12,57mM acid lactic, 7,89mM acid propionic 7,75mM acid butyric nuôi cấy 24 mơi trường bổ sung POS Đây ngun nhân dẫn đến tượng làm giảm pH môi trường, ức chế sinh trưởng vi khuẩn gây hại Một giả thuyết cho việc gây giảm số lượng vi khuẩn gây hại nuôi cấy với L acidophilus chúng sinh bacteriocin làm ức chế phát triển loại vi khuẩn gây hại 3.4.3 Điểm hoạt tính prebiotic Điểm hoạt tính prebiotic (điểm prebiotic) khái niệm sử dụng nhằm định lượng hiệu prebiotic thuận lợi Theo Huebner cộng (2007) điểm prebiotic phản ánh khả tăng sinh hợp chất kiểm tra chủng vi sinh vật định so với chủng vi sinh vật khác so với khả tăng sinh chúng hợp chất prebiotic glucose Theo đó, điểm prebiotic tác giả xác định qua mức độ thay đổi sinh khối probiotic sau 24 nuôi môi trường có chứa 1% prebiotic 1% glucose so với mức độ thay đổi số lượng vi khuẩn đường ruột có hại điều kiện nuôi cấy tương tự Sự thay đổi sinh khối xác định theo phương pháp đếm môi trường thạch đĩa đo OD600 Điểm hoạt tính POS chủng vi khuẩn probiotic thuộc Lactobacillus thể đồ thị hình 3.22 66 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Cơng nghệ sinh học Hình 3.23 Điểm hoạt tính loại prebiotic chủng Lactobacillus Kết cho thấy, chế phẩm POS kết hợp với L acidophilus cho điểm prebiotic cao (0,597) thấp L fermentum (0,525) Điều L acidophilus sử dụng POS sinh trưởng, phát triển nhanh so với L fermentum Với MOS, điểm prebiotic cao đạt kết hợp với L amylovorus, FOS L bulgaricus Inulin L reuteri Như vậy, tạo chế phẩm sinh học kết hợp vi khuẩn có lợi POS kết hợp POS với vi khuẩn L acidophilus để tạo chế phẩm có hoạt tính sinh học cao cách kết hợp khác để ứng dụng thực phẩm chức bổ sung vào thức ăn chăn ni thức ăn thủy hải sản Ngồi ra, ủ POS1% (w/v) đệm PBS chứa α-amylase (100 U/ml) pancreatin (0,2% w/v) nhận thấy nồng độ thành phần POS khơng thay đổi, POS bền mơi trường đường tiêu hóa người vật nuôi Như vậy, POS sản xuất từ vỏ chanh leo Pectinex Ultra SP-L có số hoạt tính sinh học như: có khả tăng sinh vi khuẩn có lợi Lactobacillus ức chế vi khuẩn gây hại (E coli, S typhi S aureus) điều kiện in vitro Điểm hoạt tính prebiotic POS L acidophilus cao so với vi khuẩn probiotics 67 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học prebiotic khác Do đó, sử dụng POS làm thực phẩm chức bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thức ăn thủy hải sản 68 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu, đưa số kết luận sau: Đã hoàn thiện quy trình tách chiết pectin từ vỏ chanh leo, đạt hàm lượng pectin tinh khiết 95%, số DE 38% đáp ứng yêu cầu nguyên liệu nghiên cứu cho đề tài Bằng phương pháp quy hoạch bậc Box-Behnken tìm điều kiện tối ưu thủy phân pectin nồng độ 3% (w/v) endo-polygalacturonase tạo Pectic oligosaccharide: - Nhiệt độ: 51.60C - Nồng độ enzym: 42.6 U/g - Tốc độ khuấy: 263.8 vòng/phút - pH 4.0 - Thời gian thủy phân Bước đầu xác định số hoạt tính sinh học quan trọng chế phẩm POS: - Làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi như: L acidophilus NCFM (193.37%), L bulgaricus CH-3 (187.27%), Lactobacillus rhamnosus GG (175.46%), L plantarum 299V (164.5%), L amylovorus DSM16698 (154.39%), , L reuteri DSM 17938 (152.81%), L casei Shirota (140.24%), , L fermentum PCC (137.71%), , L johnsonii La1 (137.41%) -Làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại như: Escherichia coli 0157:H7 (68.59%), Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi ATCC 19430 - S typhi ATCC (87.26%) Staphylococcus aureus ATCC 25923 (88.08%) - Điểm hoạt tính prebiotic POS chủng Lactobacillus nghiên cứu cho kết cao, cao L.acidophilus đạt 0.597 thấp L fermentum đạt 0.525 69 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học II KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu hoàn thiện nâng cao hiệu suất trình thủy phân pectin tạo POS - Chứng minh hoạt tính sinh học POS số loại vi khuẩn probiotics khác - Nghiên cứu thêm số hoạt tính sinh học khác POS: hoạt tính chống oxi hóa, khả ức chế 70 Nguyễn Hồng Ly tế bào ung thư Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đặng Thị Thu (2011) Bài giảng cao học ngành công nghệ sinh học trường đại học Bách Khoa Hà Nội, môn học Prebiotics Probiotics MT Đensikov, Tận dụng phế liệu công nghiệp thực phẩm, NXB học vàKỹ thuật, 1977 TIẾNG ANH A Chaudhri,V Suneetha (2012) Microbially derived Pectinase: A review IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 2(2), pp.1-5 A.M.M Combo, M Aguedo, N Quiévyb, S Danthinec, D Goffina, N Jacquet, C Blecker, J Devauxb, M Paquot (2013) Characterization of sugar beet pectic-derived oligosaccharides obtained by enzymatic hydrolysis International Journal of Biological Macromolecules, 52, pp 148156 A.P Vos, B.C van Esch, B Stahl, L M’Rabet, G Folkerts, F.P Nijkamp (2007) Dietary supplementation with specific oligosaccharide mixtures decreases parameters of allergic asthma in mice International Immunopharmacology, 7(12), pp 1582-1587 Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo, Dorothée Goffin Bernard Wathelet, Michel Paquot (2012), Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations, Food and Bioproducts Processing, Vol 90(3), pp 588-596 Arland T., Hotchkiss Jr., Estibaliz Olano Martin, Grace W.E., Gibson G.R, Rastall R.A (2003), Pectic oligosaccharides and Prebiotics, ACS Symposium Series, Vol 849, pp.54-62 Chen J., Liang R., Wei Liu, Li T., Liu C., Wu S., Wang Z Pecticoligosaccharides prepared by dynamic high-pressure microfluidization and 71 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học their in vitro fermentation properties Carbohydrate Polymers 91(1) (2013) 175-182 Combo A M M., Aguedo M., Goffin D., Wathelet B., Paquot M Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations Food and bioproducts processing 90 (2012) 588–596 10 Courtois J (2009), Oligosaccharides from land plants and algae: production and applications in therapeutics and biotechnology Curr Opin Microbiol 12, pp.261-273 11 De Vries, J A.; Rombouts, F M.; Voragen, A G J.; Pilnik, W Comparison of the structural features of apple and citrus pectic substances Carbohydr Polym 1984, 4, 89-101 12 Donal J Huber, Yasar Karakurt, Jinwon Jeong (2001), Pectin degradation in ripening and wounded fruits, R Bras Fisiol Veg.13(2), pp.224-241 13 Dongwski G., Lorenz A., Proll J., (2002), The degree of methylation influences the degradation of pectin in the intestinal tract of rats and in vitro J Nutr., 132, pp.1935-1944 14 E Olano-Martin, et al., Continuous Production of Pectic Oligosaccharides in an Enzyme Membrane Reactor Food Engineering and Physical Properties., 2001 66(7): p pp 966 – 971 15 E Olano-Martin, G.H Rimbach, G.R Gibson, R.A Rastall (2003) Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in vitro human colonic adenocarcinoma cells Anticancer Research, 23(1A), 341-346 16 E Olano-Martin, M.R Williams, G.R Gibson, R.A Rastall (2003) Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29 FEMS Microbiology Letters, 218(1), 101-105 72 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học 17 E.A.M Westerbeek, J.P Berg, H.N Lafeber, W.P.F Fetter, G Boehm, J.W.R Twisk, R.M Elburg (2010) Neutral and acidic oligosaccharides in preterm infants: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial1–4 Am J Clin Nutr 91, pp 679-686 18 European patent EP 868 854 A2 Low-molecular pectin, and food and drink which contain low-molecular pectin Bulletin 1998/41 19 Guillotin, Stéphanie E Studies on the intra- and intermolecular distributions of substituents in commercial pectins Ph.D thesis Wageningen University, The Netherlands, 2005 with summaries in Dutch and in French ISBN 90-8504-265-8 20 Gullon B., Gomez B., Martınez-Sabajanes M., Yanez R., Parajo J.C., Alonso J.L - Pectic oligosaccharides: Manufacture and functional properties Trends in Food Science & Technology 30 (2013) 153-161 21 H.A Murad, H.H Azzaz (2011) Microbial pectinase and ruminant nutrion Research Journal of Microbiology, 6(3), 246-269 22 Hotchkiss A.T., Manderson K., Olano Martin E., Grace W.E., Gibson G.R., Rastall R.A (2004), Orange peel pectic oligosaccharide prebiotics with food and feed applications Agricultural Research Service, http://www.ars.usda.gov 23 Ilse Fraeye, Thomas Duvetter, Isabel Verlent, Daniel Ndaka Sila, Marc Hendrickx, Ann Van Loey Laboratory of Food Technology, Centre for Food and Microbial Technology, Department of Microbial and Molecular Systems,Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 22, B-3001 Leuven, BelgiumComparison of enzymatic de-esterification of strawberry and apple pectin atelevated pressure by fungal pectinmethylesterase 24 J Concha, M.E Zúñiga (2012) Enzymatic depolymerization of sugar beet pulp: Production and characterization of pectin and pectic-oligosaccharides 73 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học as a potential source for functional carbohydrates Chemical Engineering Journal 192, pp 29-36 25 J.C Dumville, S.C Fry (2000), Uronic acid-containing oligosaccharins: Their biosynthesis, degradation and signalling roles in non-diseased plant tissues, Plant Physiol Biochem., Vol 38(1/2), pp.125-140 26 L GOMEZ-RUIZ, M GARCIA-GARIBAY, and E BARZANA (1988) Utilization of Endo-Polygalacturonase from Kluyveromyces fragilis in the Clarification of Apple Juice, Journal of Food Science, volume 53, pp 1236-1237 27 M.E.David, C.V.Maxwell, D.C.Brown, B.Z.de Rodaz, Z.B.Johnson, E.B.Kegley, D.H.Hellwig and R.A.Dvorak 2002 Effect of dietary manna oligosaccharides and(or) pharmacological additions of copper salfate on growth performance and immunocompetence of weanling and growing/finishing pigs.J.Anim.Sci.2002 80:2887-2894 28 M.M Sabajanes, R đez, J.L Alonso, J.C Parajó (2012) Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis International Journal of Food Science & Technology, 47(4), pp 747–754 29 Mandalari G., Nueno Palop C., Tuohy K., Gibson G.R., Bennett R.N., Waldron K.W., Bisgnano G., Narbad A., Faulds C.B (2007), In vitro evaluation of the prebiotic activity of a POS- rich extract enzymatically derived from bergamot peel, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol 73(5), pp.1173-1179 30 Mandalari G., Palop C.N., Tuohy K., Gibson G.R., Bennett R.N., Waldron K.W., Bisignano G., Narbad A., Faulds C.B - In vitro evaluation of the prebiotic activity of a pectic oligosaccharide-rich extract enzymatically 74 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học derived from bergamot peel Applied Microbiology and Biotechnology 73 (2007) 1173–1179 31 Manderson K., Pinart M., Tuohy K M., Grace W E., Hotchkiss A T., Widmer W., YadhavM P., Gibson G R., Rastall R A (2005), In vitro determination of prebiotics properties of oligosaccharides delived from an orange juice manufacturing by - product stream Applied and environmental microbiology, Vol 71(12), pp 8383-8389 32 Martina Martínez Sabajanes, Remedios Yánez, Jose L.Alonso, Juan C.Parajó.2012 Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis, International Journal of Food Science & Technology, Vol 47(4), pp.747-754 33 Olano-Martin E., G R Gibson and R A Rastall (2002), Comparison of the in vitro bifidogenic properties of pectins and pectic-oligosaccharides, J Appl Microbiol Vol 93, pp 505-511 34 Olano-Martin E., Mountzouris K C., Gibson G R., Rastall R A Continuous Production of Pectic Oligosaccharides in an Enzyme Membrane Reactor Food Engineering and Physical Properties 66 (7) (2001) 966 – 971 35 Onumpai C., Kolida S., Bonnin E., Rastall R A – Microbial utilization and selectivity fractions varying structures, Applied and Environmental Microbiology (2011), doi:10.1128/AEM.00179-11 36 Pilnik, W.; Voragen, A G J Gelling agents (pectins) from plants for food industry AdV Plant Cell Biochem Biotechnol 1992, 1, 219-270 37 Qiang X., Yonglie C., Qianbing W (2009), Health benefit application of functional oligosaccharides, Carbohydr Polym., 77, pp.435-441 38 Rhoades J., Manderson K., Wells A., Hotchkiss A T., Gibson G R., Formentin K., Beer M., Rastall R A – Oligosaccharide-mediated inhibition 75 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học of the adhesion of pathogenic Escherichia coli strains to human gut epithelial cells in vitro Journal of food protection (11) (2008) 2272 – 2277 39 S Ishii, K Kiho, S Sugiyama and H Sugimoto – Low methoxyl pectin prepared by pectinesterase from Aspergillus japonicus Vol.44, No.2 (1979) Journal of Food Science – 611 40 T Li, S Li, L Du, N Wang, M Guo, J Zhang (2010) Effects of haw pectic oligosaccharide on lipid metabolism and oxidative stress in experimental hyperlipidemia mice induced by high-fat diet Food Chemistry, 121(4), pp 1010-1013 TRANG WEB 41 Fructo oligosaccharide (FOS) and other oligosaccharides http://www.truestarhealth.com/Notes/1226001.html 42 Gibson and M B Roberfroid (1995), Prebiotics, PDR health 12, pp 1401 1412 (Web: http://www.nutritionreview.co.uk/Content/Features/default.asp) 43 Glem R Gibson ,2004 Prebiotic and their effect in the diet Nutrition Review report (http://www.nutritionreview.co.uk/content/features/default.asp) 44 Hotchkiss A.T., Manderson K., Olano Martin E., Grace W.E., Gibson G.R., Rastall R.A (2004), Orange peel pectic oligosaccharide prebiotics with food and feed applications Agricultural Research Service, http://www.ars.usda.gov 45 http://goldenlab.vn/mach-ban-prebiotic-la-gi-tac-dung-cua-prebiotic/ 46 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.1988.tb13575.x/abstract 47 http://vegeplus.vn/fructose-oligosaccharide 48 http://www.answers.com/topic/oligosaccharides 49 http://www.foodnk.com/phu-gia-lam-day-lam-dac-pectin.html 50 http://www.foodnk.com/phu-gia-pectin-protopectin-enzyme-pectinase-va-ung-dung.html 51 http://www.nutritionreview.co.uk/Content/Features/default.asp 76 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học PHỤ LỤC PL1 Lựa chọn nồng độ chất pectin Nồng độ pectin (w/v) giờ giờ Lượng 1% 4.43 5.12 5.25 5.45 đường khử 2% 5.87 6.45 6.68 6.82 3% 2.3 3.92 5.78 6.07 4% 2.15 3.05 3.66 4.26 5% 1.78 2.45 2.95 3.27 tạo thành (mg/ml) PL2: Ảnh hường nồng độ enzym đến hàm lượng đường khử Nồng độ Lượng giờ giờ 20 3.06 4.89 7.43 9.65 30 4.22 7.89 10.78 13.95 40 5.05 9.76 14.8 17.65 50 5.68 10.64 11.89 12.64 60 5.98 11.47 11.6 10.57 enzym (U/g) đường khử tạo thành (mg/ml) PL3: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng đường khử Lượng đường khử tạo thành (mg/ml) Nhiệt độ giờ giờ 40 5.34 9.13 12.76 15.34 50 6.91 10.58 15.69 18.13 60 4.63 7.63 8.41 9.06 (°C) 77 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học PL4: Ảnh hường pH đến hàm lượng đường khử Lượng pH giờ giờ đường khử 3.28 5.17 6.21 8.07 tạo thành 5.78 9.42 12.73 15.63 (mg/ml) 3.94 6.06 8.74 10.05 PL5: Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến hàm lượng đường khử Tốc độ khuấy giờ giờ 200 3.55 5.64 7.76 9.97 250 4.91 8.71 13.43 16.43 300 4.27 7.61 10.06 11.84 350 5.81 8.83 9.56 9.04 Lượng (vòng/ đường khử phút) tạo thành (mg/ml) PL6: Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử Thời 30 60 90 120 180 240 300 360 390 420 gian phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút 5.91 7.02 8.47 9.98 11.58 13.79 15.34 18.76 18.45 17.03 Hàm lượng đường khử (mg/ml) 78 Nguyễn Hồng Ly Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học PL7 Kết đếm khuẩn lạc chủng Lactobacillus môi trường có chứa loại prebiotic khác Prebiotic L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 Glucose 333.968 330.95 307.951 338.97 337.974 326.952 372.966 337.951 393.687 POS 585.968 510.958 613.951 517.971 473.975 595.948 494.968 555.946 540.968 MOS 443.964 596.95 438.948 512.974 400.973 434.949 455.966 391.946 399.969 FOS 417.969 356.036 369.952 361.97 390.973 462.954 480.57 366.54 543.09 Inulin 485.968 393.954 368.958 525.971 500.971 489.87 456.961 501.95 566.965 PL8 Xác định điểm hoạt tính prebiotic L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 POS 0.574 0.552 0.597 0.550 0.535 0.581 0.525 0.562 0.530 MOS 0.526 0.579 0.539 0.548 0.506 0.526 0.511 0.502 0.480 FOS 0.516 0.490 0.509 0.488 0.502 0.537 0.520 0.491 0.531 Inulin 0.542 0.507 0.509 0.552 0.545 0.547 0.511 0.545 0.538 79 Nguyễn Hồng Ly ... ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS TS ĐẶNG THỊ THU Hà Nội – Năm 2014 Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Để... ĐẶNG THỊ THU PGS.TS NGUYỄN THỊ XN SÂM - Phịng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình định hướng, hướng... polygalacturonase khảo sát số hoạt tính sinh học? ?? -1- Nguyễn Hồng Ly (POS) Endo- Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học Nội dung nghiên cứu luận văn bao gồm: - Hoàn thiện công nghệ tách chiết pectin từ