Prodigiosin là một hợp chất thứ cấp vi khuẩn. Prodigiosin thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u. Nghiên cứu này bao gồm SH1 phân lập tuyến trùng EPN H. indica CP16 và tìm hiểu khả năng sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu từ hợp chất này.
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 57 THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS (PRODUCTION AND STUDY ON BIOLOGICAL ACTIVITIES OF RED PIGMENT PRODIGIOSIN FROM SERRATIA MARCESCENS) Đinh Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương, Nguyễn Hồng Anh Kha, Trần Lâm Tú Quyên Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh SUMMARY Bacterial strain SH1 was isolated from entomopathogenic nematodes (EPN) Heterorhabditis indica CP 16 Their identification by API 20E Kit as well as by 16S rDNA sequencing showed that it belongs to the species Serratia marcescens The red pigment produced by the isolate SH1 was confirmed to be its secondary metabolite prodigiosin Prodigiosin displayed its antibacterial activity against both Gram positive and Gram negative bacteria, as well as its insecticidal activity against Spodoptera litura and S exigua at a dose of 27,66 ng/cm2 and24, 40 ng/cm2 respectively,killingapproximately 80 - 90 % insects after 120 h of treatment Keywords: bioefficacy, bioinsecticides, entomopathogenic nematodes (EPN), ESI-MS, insecticidal activity, prodigiosin, Serratia marcescens ĐẶT VẤN ĐỀ Prodigiosin hợp chất thứ cấp vi khuẩn Prodigiosin thu hút nhiều quan tâm khả sử dụng làm màu tự nhiên, khả kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt chất kháng ức chế miễn dịch chống khối u (Tsuji et al., 1990) Nghiên cứu bao gồm SH1 phân lập tuyến trùng EPN H indica CP16 tìm hiểu khả sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu từ hợp chất VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 TS Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Việt Nam cung cấp Vi khuẩn thị Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella sp., sâu khoang Spodoptera litura sâu xanh da láng Spodoptera exiguado Phịng thí nghiệm Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp Phương pháp nghiên cứu Phân lập định danh Phân lập vi khuẩntừ tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16được tiến hành dựa vào phương pháp Akhurst (1980) môi trường MacConkey NBTA Chủng phân lập khảo sát hình thái, sinh lý sinh hóa phương pháp vi sinh thông thường sử dụng Kit API 20E (Biomerieux), giải trình tự gene 16S rRNA (Cơng ty Namkhoa Biotek) Kết giải trình tự tra cứu ngân hàng Gene sử dụng phần Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 mềm BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Trích ly phân tích sắc tố Tăng sinh vi khuẩn phân lập tổng hợp sắc tố mơi trường NB 24 giờ, lắc 150 vịng/phút nhiệt độ phịng Thử nghiệm trích ly sắc tố từ tế bào canh trường hệ dung môi: chloroform 100% ether dầu hỏa 100%, choloroform 100% ether dầu hỏa:nước muối bão hoà (1:1; v/v), methanol:HCl 1N (95:5; v/v) ether dầu hỏa 100% (1:1, v/v), methanol: HCl 1N (95:5; v/v) Ether dầu hỏa : nước muối bão hoà (1:1; v/v) Quan sát tách pha để lựa chọn hệ dung mơi trích ly sắc tố Phân tích sắc tố phương pháp quét phổ hấp thụ khoảng 400 – 700 nm để xác định λmax, sắc ký mỏng TLC ethyl acetate 100%; ether dầu hỏa : acetone (7:3; v:v), khối lượng phân tử phương pháp khối phổ ion hoá phun điện tử (ESI – MS) Khảo sát ảnh hưởng pH khoảng 114 đến phổ hấp thụ sắc tố độ bền nhiệt sắc tố nhiệt độ phòng, 37 oC, 50 oC, 65 oC, 85 oC 100 oC 15 phút Khảo sát trình tổng hợp sinh khối sắc tố vi khuẩn Tăng sinh chủng vi khuẩn chọn môi trường NB, cấy giống %, lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng 72 Theo dõi mật độ tế bào nồng độ sắc tố tổng hợp 58 Để khảo sát ảnh hưởng oxy lên tổng hợp sắc tố, thực điều kiện kỵ khí, khơng lắc, lắc 150 vịng/phút lắc 180 vịng/phút 48 Để khảo sát ảnh hưởng pH dùng NaOH HCl điều chỉnh pH môi trường ban đầu Để chọn môi trường tổng hợp prodigiosin cao môi trường môi trường NB, PG, môi trường dịch chiết protein hạt đậu phộng môi trường dịch chiết protein hạt mè sử dụng Xác định hàm lượng sắc tố vi khuẩn tổng hợp nghiệm thức thí nghiệm Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn sắc tố Vi khuẩn thị tăng sinh môi trường NB, lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng, 24 giờ, điều chỉnh mật mật độ tế bào x 107 cfu/ml Khảo sát hoạt tính diệt sâu sắc tố Sâu khoang Spodoptera litura vàSpodoptera exigua đưa vào thí nghiệm Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu tuổi thầu dầu, quét lên bề mặt 200 μl sắc tố nồng độ pha loãng Mẫu đối chứng thay prodigiosin 200 μl dung dịch pha lỗng PBS Mỗi thí nghiệm lặp lại lần theo dõi sâu chết theo thời gian đến hộp đối chứng chuyển sang nhộng Xử lý số liệu Phân tích ANOVA phần mềm Statgraphics Centurion XV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập, định danh vi khuẩn từ tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 Sau phân lập môi trường NBTA MacConkey, chủng vi khuẩn phân lập đặt tên chủng SH1 Quan sát hình thái, sinh lý, sinh hóa cho phép nghi ngờ Serratia marcescens Kết thử nghiệm API 20E Kit cho kết định danh Serratia marcescens với tỉ lệ tương đồng 97,4 % Giải trình tự gene 16S rRNA chủng vi khuẩn phân lập so sánh với trình tự Genbank NCBI cho thấy tỷ lệ tương đồng SH1 với chủng thuộc loài Serratia marcescens 99,7 - 100% Như vậy, chủng phân lập gọi tên Serratia marcescens SH1 truy cập ngân hàng gene NCBI với mã số truy cập KF534508 Tách chiết phân tích sắc tố Dung mơi trích ly: methanol: HCl 1N (95:5; v:v) ether dầu hỏa: nước muối bão hồ (1:1; v:v) trích ly sắc tố từ tế bào vi sinh vật tỏ thích hợp cho tách pha tốt, màu nằm hoàn toàn pha hữu Phổ hấp thụ sắc tốtừ 400 nm đến 700 nm cho thấy dung môi ethanol: HCl bước sóng hấp thụ cực đại 535 nm, phù hợp báo cáo Giri đồng tác giả (2004) Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 Sắc ký mỏng sắc tố hai hệ dung môi ether dầu hỏa: acetone (7:3; v/v) ethyl acetate thu vạch sắc tố hồng với Rf 0,68 0,84 Kết phân tích khối phổ cho thấy [M + H]+ = 324,8 Da Các peak [M+2H+H]+=326,8 Da, [M+4H+H]+=328,8 Da [M+6H+H]+=330,8 Da hydro hóa 1,2 vịng pyrrole tạo thành pyrrolidine Các kết chứng minh sắc tố màu đỏ S marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin Sự bền nhiệt sắc tốthể 100 oC 15 phút sắc tố khơng đổi màu định lượng cho thấy không giảm Các yếu tố ảnh hưởng lên sinh tổng hợp sắc tố 59 Động học tổng hợp sinh khối sắc tố trình bày hình 1A Có thể thu nhận sắc tố từ 40-60 Hình 1B cho thấy vận tốc lắc tối thiểu 150 vòng/phút để bảo đảm oxy cho sinh tổng hợp prodigiosin Hình 1C cho thấy S marcescens tổng hợp sắc tố prodigiosin tốt pH 7,5 Trong số môi trường thử nghiệm, môi trường protein hạt đậu phộng hạt mè làm tăng tổng hợp prodigiosin lên thêm 68,9 % 122,0 % tương ứng so với môi trường NB, phù hợp nghiên cứu trước (Giri et al., 2004) Mơi trường peptone glycerol (PG) cho nồng độ sắc tổ tổng hợp cao nhất, vượt môi trường NB 163,0 %, cao môi trường protein đậu phộng mè tương ứng 55,7 % 18,5 % đạt nồng độ 10,575 mg/ml sắc tố (Hình 1D) Hình A) Đường cong tăng trường tổng hợp săc tố SH1 B) Ảnh hưởng oxy đến trình tổng hợp sắc tố C) Ảnh hưởng pH mơi trường lên q trình tổng hợp sắc tố D) Ảnh hưởng môi trường lên q trình tổng hợp sắc tố Hoạt tính kháng khuẩn sắc tố Khả kháng khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella sp prodigiosin phụ thuộc vào nồng độ, kết trình bày Hình Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 60 Hình Khả kháng khuẩn prodigiosin Khả kháng khuẩn sắc tố vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis Staphylococcus aureus vi khuẩn Gram âm Escherichia coli Salmonella sp tương tự nhau, khơng hồn tồn khớp với báo cáo Chandni đồng tác giả (2012) cho prodigiosin có khả kháng vi khuẩn Gram dương mạnh so với vi khuẩn Gram âm Hiệu lực diệt sâu prodigiosin Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura Sau 120 cho ăn, liều lượng 27,66 ng/cm2 24,40 ng/cm2 gây chết gần 90 % sâu khoang S litura 80 % sâu xanh da láng S exigua, thể hiệu lực diệt sâu mạnh (Hình 3) Đặc biệt liều lượng trung bình thí nghiệm, điều liên quan đến tính kị nước prodigiosin Sâu sống sót hóa nhộng hóa bướm, nhiên 60% nhộng khơng thể hóa bướm chết giai đoạn đó, số nhộng hóa bướm bị dị tật cánh bụng bay sinh sản LC¬50 Cry 1C protein Spodoptera litura nở từ – ng/cm2, Spodoptera litura tuổi 70 ng/cm2 thử nghiệm ngày (Lereclus et al., 2005), chứng tỏ prodigiosin thí nghiệm có hiệu lực diệt sâu khoang mạnh Cry 1C protein Hình Tỷ lệ chết sâu khoang Spodoptera litura A) sâu xanh da láng Spodoptera exigua B) cho ăn thầu dầu tẩm prodigiosin Như sắc tố prodigiosin vi khuẩn việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm trừ sâu S marcescens SH1 có nhiều tiềm sinh học KẾT LUẬN Tóm lại, kết nghiên cứu cho thấy prodigiosin tổng hợp vi khuẩn SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu Heterorhabditis indica CP16 có hoạt tính kháng khuẩn Gram dương Gram âm, đặc biệt diệt sâu mạnh cho ăn Prodigiosin hứa hẹn trở thành tác nhân kiểm soát sinh học Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Akhurst R J., 1980 Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus, bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis Microbiology, 121: 303-309 Chadni G., Sourav B Arijit D., 2012 Assessment pf process parameters influencing the enhanced production of prodigiosin form Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial, antiozidant and dyeing potentials, Malaysian Journal of Microblology, vol 8: 116-122 Giri A.V., Anandkumar N., Muthukumaran G and Pennathur G., 2004 A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology, 4: 11 Bravo A., Lereclus D., Agaisse H., Salamitou S., Sanchis V (2000) Strains of Bacillus thuringiensis and pesticide composition containing them US 6096306 A Tsuji R.F., Yamamoto M., Nakamura A., Kataoka T., Magae J., Nagai K., Yamasaki M., 1990 Selective immunosuppression of prodigiosin 25-C and FK506 in the murine immune system, J Antibiot, 43: 1293-1301 ... MS) Khảo sát ảnh hưởng pH khoảng 114 đến phổ hấp thụ sắc tố độ bền nhiệt sắc tố nhiệt độ phòng, 37 oC, 50 oC, 65 oC, 85 oC 100 oC 15 phút Khảo sát trình tổng hợp sinh khối sắc tố vi khuẩn Tăng sinh. .. chiết protein hạt mè sử dụng Xác định hàm lượng sắc tố vi khuẩn tổng hợp nghiệm thức thí nghiệm Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn sắc tố Vi khuẩn thị tăng sinh môi trường NB, lắc 150 vòng/phút nhiệt... sắc tố 59 Động học tổng hợp sinh khối sắc tố trình bày hình 1A Có thể thu nhận sắc tố từ 40-60 Hình 1B cho thấy vận tốc lắc tối thiểu 150 vòng/phút để bảo đảm oxy cho sinh tổng hợp prodigiosin Hình