Các hoạt chất trong nấm Hoàng chi (Ganoderma colosum Donk) của Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu, đặc biệt là loại protein điều chỉnh miễn dịch – FIP – đang được giới khoa học hết sức chú ý trong việc nghiên cứu sử dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo. Mục tiêu: Thu nhận FIP từ nuôi cấy sợi nấm Hoàng chi, xác định khối lượng phân tử và đánh giá khả năng chống ngưng kết máu của FIP.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Nghiên cứu Y học THU NHẬN PROTEIN ĐIỀU CHỈNH MIỄN DỊCH FIP TỪ HỆ SỢI NẤM GANODERMA COLOSSUM DONK Lê Nguyễn Uyên Chi* TĨM TẮT Mở đầu: Các hoạt chất nấm Hồng chi (Ganoderma colosum Donk) Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu, đặc biệt loại protein điều chỉnh miễn dịch – FIP – giới khoa học ý việc nghiên cứu sử dụng điều trị bệnh hiểm nghèo Mục tiêu: Thu nhận FIP từ ni cấy sợi nấm Hồng chi, xác định khối lượng phân tử đánh giá khả chống ngưng kết máu FIP Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Sinh khối hệ sợi nấm Hồng chi thu từ việc ni cấy dịch thể FIP thu nhận tinh sắc ký lọc gel Protein định khối lượng phân tử điện di SDSPAGE Hoạt tính chống ngưng kết máu FIP tách chiết chứng minh máu người máu cừu Kết quả: Mẫu protein thu từ sợi ni cấy nấm Hồng chi có khối lượng 13,114 kiloDalton (kDa) mang hoạt tính họ FIP gây ngưng kết máu cừu, hoàn toàn làm tan nhóm máu người Kết luận: Nghiên cứu lần xác định diện dòng protein điều chỉnh miễn dịch ly trích từ hệ sợi ni cấy nấm Hồng chi Việt Nam Kết sở để thực nghiên cứu tìm hiểu trình tự gen mã hóa cho FIP, ứng dụng công nghệ sản xuất FIP tái tổ hợp để bào chế dược liệu từ thảo mộc, giúp phòng hỗ trợ điều trị bệnh Từ khóa: Ganoderma colossum, ni cấy hệ sợi, FIPs ABSTRACT AN IMMUNOMODULATORY PROTEIN EXTRACTED FROM THE MYCELIUM OF GANODERMA COLOSSUM DONK Le Nguyen Uyen Chi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - Supplement of No - 2016: - 14 Background – Objectives: Active elements of the Ganoderma colossum – one type of lingzhi mushroom found in Vietnam – have not been much studied till now One of them was the immunomodulatory protein - FIP, which was promised as an efficient medical herbal drug for treatment of diseases Methods: FIP was isolated from the cultured mycelium of G colossum Its molecular weight was measured by SDS-PAGE electrophoresis The ability of hemaglutination of FIP was tested with human and sheep red blood cells Results: FIP’s molecular weight was 13.114 kDa Aggregation was observed from sheep red blood cells in the presence of purified FIP of G colossum However, no aggregation was seen for any type of human red blood cells Conclusions: This research was firstly determined the presence of an immunomodulatory protein isolated from cultured mycelia of G colossum in Vietnam This finding served as a foundation for further experiments of FIP gene, as well as the production of recombinant FIP in herbal drugs to prevent and support the treatment for diseases Keywords: Ganoderma colossum, mycelium, FIPs *Khoa Khoa học bản, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Địa liên hệ : TS Lê Nguyễn Uyên Chi ĐT: 012-1639-5936 Khoa học Cơ Email: uyenchile@hotmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Hoàng chi (Ganoderma colosum Donk) loài nấm quý Việt Nam chứng minh có thành phần hoạt chất đa dạng với hoạt tính sinh học cao kháng khuẩn(5,13), kháng HIV type I(2), ức chế tế bào ung thư gan(17) Mặc dù với thành phần hoạt chất biết đa dạng, song nghiên cứu chủ yếu tập trung vào triterpenoid colossolactones (A-G)(2,5), phenolic(3) thành phần khác vốn biết có vai trò quan trọng họ Ganodermataceae polysaccharide hay protein thông tin đề cập, chẳng hạn nấm Ganoderma colossum đặc thù Việt Nam Hiện nay, người ta xác định nấm Linh chi có khoảng 119 loại triterpens nhiều loại polysaccharide có giá trị Đặc biệt họ protein điều chỉnh miễn dịch FIPs giới khoa học ý việc nghiên cứu sử dụng điều trị bệnh hiểm nghèo FIP phát lần năm 1989 loài Linh chi chuẩn G lucidum(6) với tên gọi LZ-8 (FIP-glu) FIP nghiên cứu kỹ với vai trò loại protein chống dị ứng phổ rộng điều hoà miễn dịch Cho đến có tất protein họ FIPs tìm thấy lồi nấm khác bao gồm FIP-glu G lucidum(6), FIP-gts G tsugae(11), FIP-fve Flammulina velutipes(7), FIP-vvo Volvariella volvacea(4), FIP-gja G japonicum, FIP-gmi G microsporum(18), FIP-gsi G sinensis(20) Bảng 1: Điểm tương đồng protein họ FIPs Loại FIP FIP-glu FIP-gts FIP-fve FIP-vvo FIP-gsi Độ trùng lặp Khối Số lượng Hàm lượng amino acid so lượng amino đường (%) với FIP-glu (kDa) acid (%) 12,420 1,3 110 13,000 110 12,704 114 63,6 12,667 112 59,1 111 88,6 Các protein họ FIPs có tương đồng cao mặt cấu trúc tính năng(1,16), số 10 lượng, thành phần amino acid có khối lượng trung bình từ 11 – 15 kDa(18) (bảng 1) Các thử nghiệm lâm sàng chứng minh tất protein FIP có hoạt tính tương tự nhau: không làm ngưng kết máu người(4,7,8); khả điều chỉnh đáp ứng miễn dịch thể thông qua số chế quan trọng tăng sinh tế bào lách, ức chế phản ứng mẫn thể, kích thích thể sản sinh interleukin(4,7,9,14) Các khám phá gần cho thấy vai trò quan trọng họ FIPs chống tăng sinh gây apoptosis tế bào ung thư bạch cầu(12), ung thư phổi(10,15) Hoạt tính protein có mạnh yếu khác nhau, chẳng hạn LZ-8 có khả điều chỉnh tương tác tế bào thông qua hệ phân tử bề mặt giúp thể chống lại bệnh tự miễn q mẫn mạnh FIP-vvo có hoạt tính hơn(4) Mặt khác, việc chiếm ưu FIPs phát họ Ganodermataceae (5/7 FIPs) so với họ nấm khác cho phép thực bước khảo sát nhằm tìm kiếm protein FIP loài Linh chi thuộc họ Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu thu nhận FIP từ hệ sợi nấm Hồng chi qua ni cấy dịch thể khảo sát hoạt tính chống ngưng kết máu sản phẩm ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nuôi cấy hệ sợi nấm(20) Chủng nấm Hoàng chi (G colossum) hệ sợi cung cấp phòng thí nghiệm ni trồng nấm, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế Hệ sợi nấm nuôi cấy môi trường PDA (200 g/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l dextrose, 1,5 g/l MgSO4.7H2O, 2,5 g/l KH2PO4, 10 mg/l vitamin B1, 20 g/l agar; pH 7,0) ống thạch nghiêng sau chuyển sang ni cấy đĩa petri có môi trường PDA 28oC ngày Hai khối agar (ϕ mm) cắt chuyển vào erlen 250 ml chứa môi trường dịch thể (35 g/l sucrose, g/l peptone, 2,5 g/l dịch chiết nấm Chuyên Đề Khoa học Cơ – Y tế Công cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 men, 0,5 g/l MgSO4, g/l KH2PO4, 0,05 g/l vitamin B1; pH 6,8) Điều kiện ni cấy có lắc 120 vòng/phút, nhiệt độ 28oC 14 ngày Thu nhận protein thô Hệ sợi thu nhận từ môi trường sau nuôi cấy ly tâm 5000xg 15 phút, nghiền nhỏ Nitơ lỏng, rửa nhiều lần với đệm PBS 10mM Thu mẫu ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút đông cô điều kiện lạnh thăng hoa làm giàu protein Tinh FIP sắc ký lọc gel Chạy sắc ký lọc gel xác định phân đoạn khoảng 11 – 15 kDa Mỗi phân đoạn lấy ml, - 10 phút Đo OD 280nm phân đoạn ghi nhận peak tạo thành Các ống có diện dồn lại peak để đem xác định hàm lượng Điện di SDS-PAGE xác định trọng lượng phân tử protein 30 µl mẫu protein peak nạp vào giếng gel polyacrylamide 10%, chạy điện di 100V Sau điện di, nhuộm gel dung dịch xanh Comassive Giá trị Rf tính tỷ lệ khoảng cách di chuyển protein (từ giếng đến vạch) khoảng cách di chuyển vạch màu bromophenol (từ giếng đến vạch màu cuối) Vẽ biểu đồ log10 giá trị trọng lượng phân tử protein chuẩn giá trị Rf chúng Trọng lượng phân tử vạch protein mẫu Khoa học Cơ Nghiên cứu Y học xác định thông giá trị Rf chúng ngoại suy từ đồ thị Xác định khả ngưng kết hồng cầu FIP ml máu cừu máu người thuộc nhóm A, B, AB O ly tâm 1200xg 10 phút để loại bỏ huyết tương Thu ml dịch hồng cầu đáy ống ly tâm, rửa với đệm PBS 1X, sau tạo dịch hồng cầu với PBS (tỷ lệ 1,5% V/V) Trong giếng thử, cho vào 25 µl protein FIP peak peak 2, với 75 µl gelatin 0,2% PBS 25 µl dịch 1,5% hồng cầu Ủ mẫu 12 37oC xem kết KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nuôi cấy Mẫu sợi nấm Hoàng chi cấy từ ống thạch nghiêng sang môi trường PDA đĩa petri Sau ngày ủ 28oC, hệ sợi nấm mọc lan hình thành sắc tố màu vàng (hình 1) Sinh khối nấm tiếp tục tăng sinh bình erlen chứa mơi trường lỏng PD, điều kiện ni cấy có lắc 120 vòng/phút, 28oC, pH mơi trường ban đầu Sau 14 ngày nuôi cấy, quan sát thấy mật độ hệ sợi nấm dày làm thay đổi pH mơi trường 3,8±0,09, tơ nấm có màu vàng nhạt Tiến hành ly tâm thu sinh khối hệ sợi đạt 630±2,58 mg/100ml Sinh khối nấm dùng để ly trích protein 11 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Hoàng chi (Ganoderma colossum) loài đặc biệt quý vừa phát nuôi trồng thành công Thừa Thiên Huế Nó coi lồi đặc hữu Việt Nam(5) Đến nay, phòng thí nghiệm ni trồng nấm, môn thực vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Huế trồng thành công nhiều chủng nấm, kể Hoàng chi, phát triển tốt giá thể, nhiên, việc nghiên cứu nấm Hồng chi ni trồng môi trường dịch thể chưa đề cập tới Bằng kỹ thuật nuôi ống nghiệm, nuôi thành công sợi nấm môi trường bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp, điều kiện nhiệt độ 28oC thích hợp để tơ nấm phát triển tốt Sinh khối hệ sợi nhanh chóng thu hoạch sau 14 ngày So với chu trình sống nấm Hoàng chi loài nấm đảm khác, đảm bào tử hữu tính, nảy mầm cho hệ sợi tơ dinh dưỡng, kết thúc việc hình thành quan sinh sản tai nấm, việc ni thể (tai nấm) phổ biến kỹ thuật tương đối đơn giản, thể thu mang tính thẩm mỹ cao dễ dàng thương mại hố, yêu cầu bảo quản tương đối đơn giản, đòi hỏi thời gian thu hoạch lâu dài, việc chủ động điều chỉnh thành phần hoạt chất kỹ thuật trích ly gặp nhiều khó khăn Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy huyền phù sợi nấm cho phép chủ động điều chỉnh thành phần môi trường theo ý muốn để thu nhận hoạt chất, kỹ thuật tách chiết tương đối đơn giản Thu nhận tinh FIP Sau nuôi cấy môi trường lỏng, sinh khối sợi nấm thu hoạch, phá vỡ tế bào thu protein tổng Protein FIP phân tách, tinh phương pháp chạy sắc ký lọc gel Kết phân tách protein thu peak (hình 2) Hàm lượng protein trước sau sắc ký 1,960 mg 1,327 mg Hiệu suất tinh protein tỷ lệ phần trăm hàm lượng protein sau sắc ký tổng hàm lượng protein trước sắc ký, có giá trị 67,70% di SDS-PAGE, quan sát gel polyacrylamide có diện băng protein mức khoảng 13 kDa peak peak đối chiếu với thang protein chuẩn (hình 3) Khoảng cách di chuyển protein đo tính giá trị Rf Từ biểu đồ chuẩn log10 giá trị trọng lượng phân tử protein chuẩn giá trị Rf chúng, kết ngoại suy cho thấy mẫu protein thu peak có M = 13,114 kDa Theo Wu cộng (2007), FIPs có tương đồng cao số lượng thành phần amino acid có khối lượng trung bình từ 11kDa - 15kDa(18) Từ cho thấy sản phẩm protein tách chiết từ sợi nấm Hoàng chi với băng điện di tương ứng với FIP có khối lượng phân tử 13,114 kDa Thử nghiệm ngưng kết máu Sử dụng hồng cầu máu người (A, B, AB O) hồng cầu máu cừu để khảo sát hoạt tính ngưng kết máu protein FIP thu nhận từ hệ sợi nấm Hoàng chi Kết cho thấy khơng có ngưng kết xuất nhóm hồng cầu máu người với protein FIP peak peak Trong đó, máu cừu quan sát thấy có ngưng kết hồng cầu (hình 4) Kết hồn tồn phù hợp với cơng bố trước protein họ FIPs không làm ngưng kết máu người(4,7,8), kết luận sản phẩm protein thu từ nấm Hoàng chi thuộc họ protein điều chỉnh miễn dịch Ngồi hoạt tính ngưng kết máu, tất protein họ FIPs có hoạt tính khác làm tăng sinh tế bào lách, ức chế phản ứng mẫn thể, kích thích thể sản sinh interleukin(4,7,9,14), chống tăng sinh gây apoptosis tế bào ung thư bạch cầu(12), ung thư phổi(11,15) Các chức cần kiểm chứng thêm protein FIP thu được, nhận diện trình tự gen mã hóa FIP tương ứng Để xác định khối lượng protein FIP nấm Hoàng chi, tiến hành chạy điện 12 Chuyên Đề Khoa học Cơ – Y tế Công cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 KẾT LUẬN Protein điều chỉnh miễn dịch FIP lần thu nhận tinh từ hệ sợi ni cấy nấm Hồng chi Trọng lượng phân tử 13,114 kDa Hoạt tính khơng gây ngưng kết hồng cầu người chứng minh với protein thu nhận Những nghiên cứu sâu cần thiết để cải tiến thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy dịch thể, nhằm thu nhận nhanh nhiều sinh khối sợi nấm; đồng thời cần phân tích thành phần amino acid, cấu trúc FIP; đánh giá khả điều chỉnh miễn dịch FIP, v.v… để dụng tốt nguồn dược liệu quý giá Việt Nam Cảm ơn: Trân trọng cảm ơn GS Ngô Anh, khoa Sinh học, đại học Khoa học Huế cung cấp giống nấm Hoàng chi; ThS Ngô Bá Tư, đại học Thủ Dầu Một; ThS Tăng Cơng Trường, Sở Khoa Học Cơng nghệ Bình Dương giúp đỡ thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bai YJ, Zeng L, Liu Y, Li YF, Lin ZP, Hu YL (2006) Expression of LZ-8 from Garnodum lucidum in transgenic tobacco and primary study on characteristic of recombinant LZ-8 Mol Plant Breeding, 4: 645–649 Dine RSE, Halawany AME, Nakamura N, Ma CM, Hattori M (2008) New lanostane triterpene lactones from the Vietnamese Khoa học Cơ Nghiên cứu Y học mushroom Ganoderma colossum (FR.) C.F.BAKER Chem Pharm Bull., 56(5): 642-646 Dine RSE, Halawany AME, Ma CM, and Hattori M (2009) Inhibition of the dimerization and active site of HIV-1 protease by secondary metabolites from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum J Nat Prod., 72: 2019-2023 Hsu HC, Hsu CI, Lin RH, Kao CL, Lin JY (1997) Fip-vvo, a New Fungal Immunomodulatory Protein Isolated from Volvariella volvacea J Biol Chem., 323: 557-565 Kleinwachter P, Anh N, Kiet TT, Schlegel B, Dahse HM, Hartl A, Grafe U (2001) Colossolactones, New triterpenoid metabolites from a Vietnamese muhsrooms Ganoderma colossum J Nat Prod, 64(2): 236-239 Kino K, Yamashita A, Yamaoka K, Watanabe J, Tanaka S, KerKry O, Shimizu K, Tsunoo H (1989) Isolated and characterization of a new immunomodlatory protein lingzhi-8 (LZ-8) from Ganoderma lucidum J Biol Chem, 264: 472-478 Ko JL, Hsu CI, Lin RH, Kao CL, Lin JY (1995) A new fungal immunomodulatory protein FIP-fve isolated from the edible mushroom, Flammulian velutlpes and its complete amino acid sequence Eur J Biochem., 228: 244–249 Li SL, Hu YP, Su JC, Song J, Guo YW, Qi ZG (2009) Cloning and expression of LZ-8 gene from Ganoderma lucidum, an immunomodulatory protein Journal of Hebei Normal University (Natural Science Edition), 33:677–681 Li QZ, Wang XF, Chen YY, Lin J, Zhou XW (2010) Cytokines expression induced by Ganoderma sinensis fungal immunomodulatory proteins (FIP-gsi) in mouse spleen cells Appl Biochem Biotech., 162: 1403-1413 10 Liao CH, Hsiao YM, Lin CH (2008) Induction of premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugae Food Chem Toxicol., 46: 1851– 1859 11 Lin WH, Hung CH, Hsu CI, Lin JY (1997) Dimerization of the N-terminal Amphipathic a-Helix Domain of the Fungal 13 Nghiên cứu Y học 12 13 14 15 16 14 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Immunomodulatory Protein from Ganoderma tsugae (Fip-gts) Defined by a Yeast Two-hybrid System and Site-directed Mutagenesis J Biol Chem, 272: 20044-20048 Lin JW, Hao LX, Xu GX, Sun F, Gao F, Zhang R, Liu LX (2008) Molecular cloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris World J Microbiol Biotechnol., 25: 383–390 Ofodile LN, Kokubum NU, Grayer ORJ, Ogundipe OT, Simmonds MSJ (2005) Antimicrobial Activity of Some Ganoderma Species from Nigeria Phytotherapia Research, 19: 210-213 Paaventhan P, Joseph JS, Seow SV, Vaday S, Robinson H, Chua KY, Kolatkar PR (2003) 1.7 Å structure of Fve, a member of the new fungal immunomodulatory protein family J Mol Biol., 332: 461–471 Sun YF, Chang SQ, Yu DS (2006) The study progress on functional proteins of Flammulina velutipes J Microbiol., 26: 50–54 Tanaka S, Ko K, Kino K, Tsuchiya K, Yamashita A, Murasugi A, Sakuma S, Hajime T (1989) Complete amino acid sequence of 17 18 19 20 an immunomodulatory protein, lingzhi-8 (LZ-8) J Biol Chem., 264: 16372-16377 Weng CJ, Fang PS, Chen DH, Chen KD, and Yen GC (2010) Anti-invasive effect of a rare mushroom, Ganoderma colossum on human hepatoma cells J Agric Food Chem., 58: 7657-7663 Wu MY, Hsu MF, Huang CS, Fu HY, Huang CT, Yang CS (2007) A 2.0 Å structure of GMI, a member of the fungal immunomodulatory protein family from Ganoderma microsporum Protein Crystallography, 2:132 Zhou XW, Li QH, Zhao JY, Tang KX, Lin JA, YinYZ (2007) Comparison of Rapid DNA Extraction Methods Applied to PCR Identification of Medicinal Mushroom Ganoderma spp Preparative Biochemistry and Biotechnology, 37: 369-380 Zhou XW, Xie MQ, Hong F, Li QZ, Lin J (2009) Genomic cloning and characterization of a FIP-gsi gene encoding a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma sinensis zhao et al (Aphyllophoromycetideae) Int J Med Mushroom, 11: 77–86 Ngày nhận báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 26/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ – Y tế Công cộng ... LUẬN Protein điều chỉnh miễn dịch FIP lần thu nhận tinh từ hệ sợi ni cấy nấm Hồng chi Trọng lượng phân tử 13,114 kDa Hoạt tính khơng gây ngưng kết hồng cầu người chứng minh với protein thu nhận. .. trước protein họ FIPs khơng làm ngưng kết máu người(4,7,8), kết luận sản phẩm protein thu từ nấm Hoàng chi thu c họ protein điều chỉnh miễn dịch Ngoài hoạt tính ngưng kết máu, tất protein họ FIPs... muốn để thu nhận hoạt chất, kỹ thu t tách chiết tương đối đơn giản Thu nhận tinh FIP Sau nuôi cấy môi trường lỏng, sinh khối sợi nấm thu hoạch, phá vỡ tế bào thu protein tổng Protein FIP phân