Nghiên cứu thu nhận, xác định đặc tính lignin peroxydase từ chủng aspergillus flavus và ứng dụng nâng cao chất lượng bột giấy bao gói

NGUYỄN THANH HẢO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THANH HẢO CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH LIGNIN PEROXYDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ỨNG DỤNG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG BỘT GIẤY BAO GÓI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THANH HẢO NGHIÊN CỨU THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH LIGNIN PEROXYDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ỨNG DỤNG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG BỘT GIẤY BAO GÓI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS.ĐẶNG THỊ THU Hà Nội – 2011 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS ĐẶNG THỊ THU Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình định hướng, hướng dẫn, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Quang Diễn, Bộ môn công nghệ xenluloza giấy, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội_người thiết kế hướng dẫn thí nghiệm ứng dụng enzym xử lý bột giấy Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị nghiên cứu sinh, bạn học viên, sinh viên phịng thí nghiệm hóa sinh sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua khó khăn suốt q trình nghiên cứu Hà Nơi, ngày 30 tháng 09 năm 2011 Nguyễn Thanh Hảo Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 30 tháng 09 năm 2011 Nguyễn Thanh Hảo Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A0: Anxtron (1A0= 10-10m) CcP: Cytochrome c peroxydase Da : Dalton (1Da= 6,17x10-24g) kDa : kilo Dalton LiP: Lignin peroxidase MnP: Mangan Peroxydase pI: Isoelectric point FA: Ferulic Acid PDA: Potato Dextro Agar DDT: 1,1,1-trichloro-2,2-bis4-chlorophenylethane PCP: Pentachlorophenol VA: Veratryl alcohol BOD: Biochemical oxygen Demand COD: Chemical Oxygen Demand WRF: white rot fungi (Nấm mục trắng) w/v: weight/volume v/v: volume/volume       i Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1  PHẦN I: TỔNG QUAN 2  1.1.  Các Enzym Oxy hóa Lignin 4  1.1.1.  Laccase [EC 1.10.3.2] 4  1.1.2.  Manganese peroxidase (MnP) [EC 1.11.1.13] 6  1.1.3.  Lignin peroxidase (LiP) [EC 1.11.1.14] 7  1.1.3.1 Cấu tạo lignin peroxidase (LiP) [EC 1.11.1.14] 1.1.3.2 Tính chất LiP 11 1.1.3.3 Cơ chế phản ứng LiP 17 1.1.3.4 Nguồn thu LiP 18 1.1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện nuôi sinh tổng hợp LiP 20 1.1.3.6 Ứng dụng LiP 24  PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29  2.1 Vật liệu nghiên cứu 29  2.1.1 Chủng vi sinh vật 29  2.1.2 Bột giấy 29  2.1.3 Hóa chất 29  2.1.4 Thiết bị 29  2.1.5 Môi trường nghiên cứu 30  2.2 Phương pháp nghiên cứu 31  2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 31  2.2.2 Định tên chủng SBC4-5 phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 32  2.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy quy hoạch thực nghiệm 32  2.2.4 Phương pháp hóa sinh 34  2.2.4.1 Xác định hoạt độ LiP 34 2.2.4.2 Thu chế phẩm LiP kỹ thuật phương pháp lọc cut off 34 2.2.4.3 Xác định protein tổng số theo phương pháp Lowry 35 2.2.4.4 Điện di Protein gel SDS-PAGE 36 2.2.5 Phương pháp hóa học 37  ii Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 2.2.5.1 Phương pháp xử lý bột giấy enzym 37 2.2.5.2 Xác định hàm lượng lignin phương pháp Komarov, 1998 37 2.2.5.3 Xác định độ khô tuyệt đối 38 2.2.5.4 Xác định độ trắng 39 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40  3.1 Tuyển chọn nấm mốc sinh tổng hợp LiP cao 40  3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni sinh tổng hợp LiP từ Aspergillus flavus 42  3.2.1 Ảnh hưởng chế độ nuôi : tĩnh lắc 42  3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ Tween 80 42  3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ Veratryl Alcohol 43  3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ Ammonium Tartrate (nguồn N) 44  3.2.5 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 45  3.2.6 Ảnh hưởng nồng độ Glucose ( nguồn C) 46  3.2.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 47  3.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi Aspergillus flavus sinh tổng hợp LiP theo chương trình phần mềm Design Expert (DX7) 48  3.3.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm 48  3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp LiP 52  3.3.3 Kiểm tra tính xác phương trình tối ưu 53  3.4 Khảo sát động thái trình lên men sinh tổng hợp LiP từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus 54  3.5 Thu chế phẩm enzym kỹ thuật phương pháp lọc cut off 10kDa 55  3.6 Một số đặc tính LiP kỹ thuật 56  3.6.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính LiP 56  3.6.1.1 pH tối ưu LiP 56 3.6.1.2 Khảo sát tính bền pH LiP 57 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính LiP 58  3.6.2.1 Nhiệt độ tối ưu LiP 58 3.6.2.2 Khảo sát tính bền nhiệt độ LiP 58 3.7 Ứng dụng LiP xử lý bột giấy: 59  3.7.1 Ảnh hưởng nồng độ LiP tới hiệu giảm Lignin bột giấy 59  iii Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 3.7.2 Ảnh hưởng nồng độ bột giấy tới hiệu giảm Lignin xử lý bột giấy 61  3.7.3 Ảnh hưởng thời gian xử lý LiP tới hiệu giảm Lignin 62  3.7.4 Tính chất lý bột giấy sau xử lý LiP 62  3.7.5 Xác định mức giảm hóa chất trình tẩy trắng sử dụng LiP 64  PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65  4.1 KẾT LUẬN 65  4.2. KIẾN NGHỊ 65  PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 66  TÀI LIỆU TIẾNG ANH 66  TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 72  PHỤ LỤC 73  iv Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Trang BẢNG 1.1 Khối lượng phân tử số lượng isozym LiP từ số chủng nấm mốc 9  BẢNG 1.2 Nhiệt độ pH tối ưu số chủng nấm bậc cao 15  BẢNG 1.3 pI số chủng nấm bậc cao 16  BẢNG 1.4 Km Vmax LiP từ chủng Phanerochaete chrysosporium 16  BẢNG 2.1.Các biến số khoảng chạy chúng 33  BẢNG 2.2 Ma trận thực nghiệm 33  BẢNG 3.1 Tuyển chọn nấm mốc sinh tổng hợp LiP cao 40  BẢNG 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng nghiên cứu 48  BẢNG 3.3 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken 49  BẢNG 3.4 Phân tích phương sai ANOVA mơ hình 50  BẢNG 3.5 Kết kiểm chứng 53  BẢNG 3.6 Tinh chế LiP từ Aspergillus flavus 55  BẢNG 3.7 Tính chất lý học bột giấy (Độ nghiền 500SR, định lượng 110g/m2) 63  BẢNG 3.8 Độ trắng mẫu bột thân ngơ giảm hóa chất 64  v Luận văn thạc sỹ khoa học Cơng nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Trang HÌNH 1.1 Thành phần vật liệu Lignocellulose 2  HÌNH 1.2 Cấu trúc hóa học lignin 3  HÌNH 1.3 Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin 3  HÌNH 1.4 Cơ chế oxy hóa tiểu phần phenol lignin laccase 5  HÌNH 1.5 Cơ chế oxy hóa tiểu phần (non-phenolic)của lignin laccase 6  HÌNH 1.6 Chu trình xúc tác manganese peroxidase 7  HÌNH 1.7 Cấu trúc 3-D LiP 8  HÌNH 1.8 Phân bố điện tích bề mặt phân tử LiP415 13  HÌNH 1.9 Chu kỳ xúc tác LiP từ Phanerochaete chrysosporium 17  HÌNH 1.10 Chu trình oxy hóa hợp chất vịng thơm LiP 18  HÌNH 1.11 Chu trình oxy hóa liên kết aryl (Ar) LiP 18  HÌNH 2.1 Đường chuẩn Lowry 36  HÌNH 3.1 Đặc điểm hình thái chủng SBC4-5 (Aspergillus flavus Link) 41  HÌNH 3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi đến khả sinh tổng hợp LiP 42  HÌNH 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Tween80 đến khả sinh tổng hợp LiP 43  HÌNH 3.4 Ảnh hưởng nồng độ V.A đến khả sinh tổng hợp LiP 44  HÌNH 3.5 Ảnh hưởng nồng độ Ammonium tartrate đến khả sinh tổng hợp LiP 44  HÌNH 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả sinh tổng hợp LiP 45  HÌNH 3.7 Ảnh hưởng nồng độ Glucose đến khả sinh tổng hợp LiP 46  HÌNH 3.8 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp LiP 47  HÌNH 3.9 Bề mặt đáp ứng hoạt độ LiP 52  HÌNH 3.10 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để biểu LiP 52  HÌNH 3.11 Động thái trình lên men sinh tổng hợp LiP 54  HÌNH 3.12 Điện di LiP 56  HÌNH 3.13 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ LiP 57  HÌNH 3.14 Khảo sát tính bền pH LiP 57  HÌNH 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ LiP 58  HÌNH 3.16 Khảo sát tính bền nhiệt LiP 59  HÌNH 3.17 Ảnh hưởng nồng độ LiP tới hiệu giảm Lignin bột giấy 60  HÌNH 3.18 Ảnh hưởng nồng độ bột giấy tới hiệu giảm Lignin 61  vi Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 3.7.3 Ảnh hưởng thời gian xử lý LiP tới hiệu giảm Lignin Thời gian yếu tố ảnh hưởng tới trình thủy phân kết trình tách loại lignin Từ đó, chúng tơi tiến hành khảo sát thời gian thích hợp để đem lại hiệu cao trình tách loại lignin Cố định nồng độ enzym 10U/g bột giấy, nồng độ bột giấy 10%, điều kiện phản ứng nhiệt độ 35oC, pH =3 Tiến hành xử lý enzym thời gian 1, 3, 4, 5, lấy bột giấy đem xác định hàm lượng lignin Kết thu được biểu diễn hình 3.19: Lignin cịn lại Sự giảm Lignin so với lượng ban đầu % 40 36.81 41.3 39.46 41.74 31.1 30 25.8 18.53 20 10 17.09 16.45 15.8 15.68 Trước xử lý Giờ HÌNH 3.19 Ảnh hưởng thời gian xử lý tới hiệu giảm Lignin Từ kết thu nhận thấy, thời gian đầu từ 1- sau xử lý, hiệu giảm lượng lignin tương đối rõ rệt Có thể khoảng thời gian enzym tác dụng hiệu lên lignin bề mặt bột giấy Khi tăng thời gian xử lý lên 5h, hiệu giảm lượng lignin đáng kể Nếu để tiếp đến 7h, giảm lignin ít, hiệu giảm lignin chậm do: thời gian lâu nhiệt độ 350C enzym giảm dần hoạt tính, mặt khác lignin cịn lại chủ yếu nằm sâu bó sợi, khó tiếp xúc với enzym Do thời gian xử lý 5h hiệu sử dụng cho nghiên cứu 3.7.4 Tính chất lý bột giấy sau xử lý LiP Tiến hành làm tiêu mẫu bột giấy qua tẩy trắng hóa học - Mẫu : Khơng xử lý enzym LiP - Mẫu 2: Xử lý enzym LiP với điều kiện tối ưu trên: nồng độ enzym 10U/g bột, nồng độ bột 10%, pH=3, nhiệt độ: 350C, thời gian xử lý enzym 5giờ Nguyễn Thanh Hảo 62 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Đem tiêu quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM), điều chỉnh cho tập trung quan sát đến bề mặt cấu trúc sợi riêng biệt Đồng thời tiến hành lấy hai mẫu bột giấy đem phân tích độ trắng tính chất lý Kết thu thể bảng 3.7 hình 3.20 sau: BẢNG 3.7 Tính chất lý học bột giấy (Độ nghiền 500SR, định lượng 110g/m2) Chỉ số Độ trắng ( % ISO) Độ dài đứt (m) Chỉ số xé (mN.m2/g) Chỉ số bục (kPa.m2/g) Bột giấy không sử dụng enzyme (Xử lý hóa học) 34,25 4106 3,81 1,61 Bột giấy sử dụng LiP 10U/g 36,6 4410 4,26 1,71 (Kết phân tích hệ thống thiết bị Viện giấy cellulose) c) Độ phóng đại 1000X d) Độ phóng đại 10 000X HÌNH 3.20 Cấu trúc xơ sợi bột gỗ quan sát kính hiển vi điện tử quét (bên trái: chưa xử lý enzym, bên phải: sau xử lý enzym) Quan sát ảnh SEM mẫu bột giấy hiệu suất cao tẩy trắng không sử dụng LiP sử dụng LiP với mức dùng 10U/g bột thấy khác biệt rõ rệt cấu trúc xơ sợi (chứa lignin) Kết phân tích tính chất mẫu bột giấy Nguyễn Thanh Hảo 63 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học cho thấy số độ bền cơ-lý học bột giấy có sử dụng LiP cao so với khơng sử dụng enzym (bảng 3.7) Tác dụng phân hủy lignin enzym làm cho xơ sợi tơi hơn, mềm mảnh hơn, phân bố xơ sợi đồng hơn, khoảng chúng gần hơn, nhờ mà liên kết trở nên bền chặt, làm bộc lộ bề mặt cấu trúc bột giấy, cấu trúc xơ sợi trở lên trương nở Cải thiện khả tiếp xúc với hóa chất nên hóa chất dễ dàng thấm sâu vào bên sơ sợi, làm lượng lignin hịa tan nhiều giúp loại bỏ đáng kể lượng lignin so với không xử lý enzym LiP (hình 3.20) 3.7.5 Xác định mức giảm hóa chất trình tẩy trắng sử dụng LiP Mục tiêu việc áp dụng enzym để tẩy trắng bột giấy giảm lượng hóa chất để giảm nhiễm mơi trường Hơn nữa, việc sử dụng enzym cịn làm tăng độ sáng chất lượng giấy Dựa sở kết thu hiệu enzym trình tách loại lignin, chúng tơi tiến hành khảo sát mức giảm hóa chất q trình tẩy trắng bột giấy có sử dụng enzym Khảo sát hai mức giảm lượng hóa chất tẩy trắng 5% 10%, kết thu sau: BẢNG 3.8 Độ trắng mẫu bột thân ngô giảm hóa chất Mẫu Bột gỗ + 100% hóa chất Bột gỗ + 100% hóa chất + Enzym (10U/g bột) Bột gỗ + 95% hóa chất + Enzym (10U/g bột) Bột gỗ + 90% hóa chất + Enzym (10U/g bột) Độ trắng, %ISO 34.25 36.60 34.18 33.80 Từ kết nhận thấy, bột giấy từ thân ngô giảm 5% hóa chất tẩy trắng kết hợp với enzym so với mẫu đối chứng sử dụng 100% hóa chất có độ trắng tương đương Cịn giảm 10% hóa chất tẩy trắng độ trắng có giảm không đáng kể Nhận thấy, sử dụng enzym, độ trắng bột giấy tăng 2.35% độ trắng ISO Do kết luận: việc sử dụng LiP tẩy trắng giúp giảm từ 5- 10% lượng hóa chất, giúp giảm thiểu nhiễm mơi trường Nguyễn Thanh Hảo 64 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Behnken chương trình phần mềm Design Expert, tìm điều kiện tối ưu thành phần môi trường Kirk, sinh tổng hợp LiP cho hoạt độ cao (glucose: 10g/l; veratryl alcohol: 1.0mM; ammonium tartrate: 0.2g/l, nhiệt độ nuôi cấy: 300C, pH= 5.5, thời gian nuôi: ngày) Hoạt độ LiP cao đạt : 1650U/l Bằng phương pháp lọc qua màng 0.45µm qua cột cut-off 10kDa, thu chế phẩm LiP đạt hiệu suất 82% mức độ làm 3.4 lần Xác định số đặc tính LiP: pH tối ưu 2.5, bền vùng pH 23, nhiệt độ tối ưu 25ºC, bền vùng nhiệt độ 20-300C Đã tìm số điều kiện ứng dụng LiP xử lý bột giấy hóa học từ thân ngô nhằm nâng cao chất lượng bột giấy (cải thiện độ trắng, tăng độ dài đứt, tăng số xé tăng số bục): nồng độ LiP 10U/g bột, nồng độ bột giấy 10%, thời gian xử lý giờ.                    4.2 KIẾN NGHỊ Ứng dụng LiP tẩy trắng bột giấy cao cấp quy mô lớn Nguyễn Thanh Hảo 65 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Banci, L., Bertini, I., Turano, P., Tien, M & Kirk, T K.(1991) Proton NMR investigation into the basis for the relatively high redox potential of lignin peroxidase Proc Natl Acad Sci USA, 88, 6956-6960 Falk, J E (1964) Porphyrin & Metalloporphyrins, Elsevier,New York Biswas-Hawkes, D., Dodson, A.P.J., Harvey, P.J and Palmer, J.M (1987) Ligninase from white-rot fungi In:Lignin Enzymic and Microbial Degradation (Odier, E., Ed.) pp 171-176 INRA Publications, Paris Blodig, W., Doyle, W A., Smith, A T., Winterhalter, K., Choinowski, T & Piontek, K (1998) Autocatalytic formation of a hydroxy group at Cb of Trp171 in lignin peroxidase Biochemistry, 37, 8832-8838 Daljit Singh Arora, Mukesh Chander, Paramjit Kaur Gill (2002) Involvement of lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase in degradation and selective ligninolyis of wheat straw International Bioderterioration & Biodegradation, p 115 – 120 Dass, S.B and Reddy, C.A, (1990) Characterization of extracellular peroxidases produced by acetate-buffered cultures of the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporiurn FEMS Microbiol Lett 69, 221224 Dennis C Yee and Thomas K (1997) Wood 2,4-Dichlorophenol Degradation Using Streptomyces viridosporus T7A Lignin Peroxidase Biotechnol Prog, 13, 53-59 Dhanaraj, V., Ye, Q.-Z., Johnson, L L., Hupe, D J., Ortwine, D F., Dunbar, J B., Jr, Rubin, J R.,Pavlovsky, A., Humblet, C & Blundell, T L (1996) X-ray structure of a hydroxamate inhibitor of stromelysin catalytic domain and its comparison with members of the zinc metalloproteinase superfamily Structure, 4, 375-386 Nguyễn Thanh Hảo 66 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Dilip K.Arora (1986) Fungal Degradation of lignin Soil and plants, p 449 – 451 Donald L, Crawford, Muralidhara, Ramachandra (1993) Bacterial extracellular lignin peroxidase Incorporation, Moscow,Id 10 Doyle, W A., Blodig, W., Veitch, N C., Piontek, K & Smith, A T (1998) Two substrate interaction sites in lignin peroxidase revealed by site-directed mutagenesis Biochemistry, 37, 15097-15105 11 Eleni Gomes; Ana Paula Aguiar; Caio César Carvalho; Maricy Raquel B Bonfá; Roberto da Silva;Mauricio Boscolo (2009) Ligninases production by Basidiomycetes strains on Lignocellulosic agricultural residues and their application in the decolorization of synthetic dyes Brazilian Journal of Microbiology 40:31-39 12 Enrico Baciocchi, Massimo Bietti, Maria Francesca Gerini, Osvaldo Lanzalunga and Simona Mancinelli (2001) Oxidation of non-phenolic β -O -aryllignin model dimers catalysed by lignin peroxidase Comparison with the oxidation induced by potassium 12-tungstocobalt(III)ate J Chem Soc., Perkin Trans pp 1506–1511 13 E McCrady (1991) The nature of lignin Alkaline Paper Advocate, vol 4, No Source: http://palimpsest.stanford.edu/byorg/abbey/ap/ 14 Ferret, I., Esposito, E and Durfin, N (1992) Lignin peroxidase from Ch~sonilia sitophila: Heat-denaturation kinetics and pH stability Enz Microb Technol 14, 402-406 15 Finzel, B C., Poulos, T L & Kraut, J (1984) Crystal structure of yeast cytochrome c peroxidase refined at 1.7-A0 resolution J Biol Chem 259, 1302713036 16 Frank Tonon and Etienne Odier (1988) Influence of Veratryl Alcohol and Hydrogen Peroxidase on Ligninase activity and Ligninase Production by Phanerchaete chrysosporium Applied and environmental microbiology, Feb., p 466-472 Nguyễn Thanh Hảo 67 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 17 Fulop, V., Phizackerley, R P., Soltis, S M., Clifton, I J., Wakatsuki, S., Erman, J., Hajdu, J & Edwards, S L (1994) Laue diffraction study on the structure of cytochrome c peroxidase compound I Structure, 2, 201-208 18 Gary Ward, Yitzhak Hadar, Itzhak Bilkis, Leonid Konstantinovskyi,and Carlos G Dosoretz (2001) Initial Steps of Ferulic Acid Polymerization by Lignin Peroxidase Vol 276, No 22, Issue of June 1, pp 18734–18741 19 Gold, M.H., Kuwahara M., Chiu, A.A and Glenn, J.K (1984) Purification and characterization of an extracellular H2O2 -requiring diarylpropane oxygenase from the whiterot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium Arch Biochem Biophys 234, 353-362 20 Hans E Schoemaker, Klaus Piontek (1996), “On the interaction of lignin peroxidase with lignin”, Pure & Appl Chem, 68(11), pp.2089-2096 21 Heinfling, A., Ruiz-Duenas, F J., Martinez, M J., Bergbauer, M., Szewzyk, U & Martinez, A T (1998) A study on reducing substrates of manganese-oxidizing peroxidases from Pleurotus eryngii and Bjerkandera adusta FEBS Letters, 428, 141-146 22 JinShui Yang, HongLi Yuan, HeXiang Wang and WenXin Chen(2005) Purification and characterization of lignin peroxidases from Penicillium decumbens P6 World Journal of Microbiology & Biotechnology 21:435–440 23 Johansson, T and Nyman, P.O (1993) Isozymes of lignin peroxidase and manganese(ll) peroxidase from the whiterot basidiomycete Trametes versicolor I Isolation of enzyme forms and characterization of physical and catalytic properties Arch Biochem Biophys 300, 49-56 24 Johansson, T., Welinder, K.G and Nyman, P.O (1993) lsozymes of lignin peroxidase and manganese(ll) peroxidase from the white-rot basidiomycete Trametes t:ersicolor I1 Partial sequences, peptide maps, and amino acid and carbohydrate compositions Arch Biochem Biophys 300, 57-62 25 K Piontek, A T Smith W Blodig (2001) Lignin peroxidase structure and function Biochemical Society Nguyễn Thanh Hảo 68 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 26 Kanayama Nozomu, Suzuki Tooru, Kawai Keiichi (2002).Purification and Characterization of an Alkaline Lignin Peroxidase from Aspergillus terreus LD1 Environmental Conservation Engineering.p644-652 27 Kumar Rita ,Kumar Anil (New Delhi, IN, US) (2006), “A process for the isolation and acclimatization of bacteria for lignin degradation”, United states patent 20060121592 28 Kunishima, N., Fukuyama, K., Matsubara, H., Hatanaka, H., Shibano, Y & Amachi, T (1994) Crystal structure of the fungal peroxidase from Arthromyces ramosus at 1.9 A Ê resolution J Mol Biol 235, 331-344 29 Kuwahara, M., Glenn, J.K., Morgan, M.A and Gold, M.H (1984) Separation and characterization of two extracellular H202-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium FEBS Lett 169, 247-250 30 Leda M F Gottschalk, Ronaldo Nobrega, Elba P S Bon (2003), “Effect of aeration on lignin peroxidase production by Streptomyces viridosporus T7A” Applied Biochemistry and Biotechnology, volume 108, numbers 1-3, pp.799-808 31 Leisola, M S A., Kozulic, B., Meussdoerffer, F & Fiechter, A (1987) Homology among multiple extracellular peroxidases from Phanerochaete chrysosporium J Biol Chem 262, 419-424 32 M Enriqueta Arias, María Arenas, Juana Rodríguez, Juan Soliveri, Andrew S Ball, and Manuel Hernández (2003), “Kraft Pulp Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate from Streptomyces cyaneus CECT 3335” Appl Environ Microbiol, 69(4): 1953–1958 33 M Yadav, P Yadav, and K D S Yadav (2009) Purification, Characterization, and Coal Depolymerizing Activity of Lignin Peroxidase from Gloeophyllum sepiarium MTCC_1170 34 MA, Dengbo; GAO, Peiji; WANG, Zunong; HATTORI, Takefumi; SHIMADA, Mikio (1994) Lignin Peroxidase-Catalyzed Oxidation of Monomeric Lignin Model Substrates Nguyễn Thanh Hảo 69 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học 35 Maltseva, O.V., Công nghệ sinh học Myasoedowa, N.M., Leotievski, A.A and Golovleva, L,A (1986) Characteristics of the ligninolytic system of Panus tigrinus Proc Soy Finn Sem Micro Degradation Lignocellul Raw Matter, Tbilisi, Georgia pp 74-82 36 Ming Tien and T.Kent Kirk (1988) Lignin Peroxidase of Phanerochaete chrysosporium In: Wood, Willis A.; Kellogg, Scott T., eds Methods in enzymology-Biomass, part b, lignin, pectin, and chitin San Diego, CA: Academic Press, Inc.: 238-249 37 Nomomura, H., (1974), “Key for Classification and Identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP J Ferment”, Technol, 52(2), pp 78-92 38 Pasti, M B, Crawford, D.L (1991), “Relationships between the abilities of Streptomyces to decolourize three anthron type dyes and to degrade lignocellulose” Can J Microbiol, 37, pp 902-907 39 Pauli O., Veli L M., Tero A., Hari S.(1995) Purification of major lignin peroxidase isoenzyms from Phanerochaete chrysosporium by Chromatofocusing Protein Expression and purification 6, pp.337-342 40 Petr Baldrian (2005), Fungal laccases occurenceand properties Laboratory of Biochemistry of Wood- Rooting Fungi, Institue of Micobiology ASCR, Prague, Czech Repulic 41 Philip S., Daniel C (1999), Organization and differential regulation of a cluster of lignin peroxidase genes of Phanerochaete chrysosporium.Journal of Bacteriology 11, Vol 181, pp 3427-3432 42 Rajagopalan Venkatadri and Robert L.Irvine (Sept 1990) Effect of Agitation on Ligninase Activity and Ligninase Production by Phanerochaete chrysosporium Applied and environmental microbiology , p 2684-2691 43 Roberta L Farrell, Karen E Murtagh, Ming Tien, Michael D Mozuch, and T Kent Kirk (1989) Physical and enzymatic properties of lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium Nguyễn Thanh Hảo 70 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học 44 Stephan D Haemmerli, Matti S A Leisola, Dominique Sanglard, and Armin Fiechter (1986) Oxidation of Benzo(a)pyrene by Extracellular Ligninases of Phanerochaete chrysosporium Val 261, No 15, Isme of May 25, pp 69W-6903 45 Takayoshi (1990) Improvement of Lignin Peroxidase Production by Phanerochaete chrysosporium in Shaking Culture in the Presence of Polyurethane Foam Cubes Wood research : bulletin of the Wood Research Institute Kyoto University, 77: 35-41 46 Tien, M and Kirk T.K (1984) Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium Purification, characterization and catalytic properties of a unique H2O2 requiring oxygenase Proc Natl Acad Sci USA 81, 22802284 47 Uogu A., Shimada M and Guchi T H (1980), “Sutidies on lignin biodegradation”, Holzforchung, 34, pp 86-89 48 Vares, T., Lundell, T.K and Hatakka, A.I (1992) Novel hemecontaining enzyme possibly involved in lignin degradation by the white-rot fungus Junghuhnia separabilima FEMS Microbiol Lett 99, 53-58 49 V K Patel, R S S Yadav and K D S Yadav, 2007 Enzymatic characteristics of lignin peroxidases of indigenous lignlytic fungal strains Indian Journal of Biotechnology, pp 553-556 50 Wariishi, H., Sheng, D & Gold, M H (1994) Oxidation of ferrocytochrome c by lignin peroxidases Biochemistry, 33, 5545-5552 51 Watdner, R., Leisola, M and Fiechter, A (1987) Production of extracellular enzymes by different white-rot fungi Proc 3rd Int Conf Biotechnology in the Pulp and Paper Industry Stockholm, 1986 pp 17-19 52 Yuta Miki, Hiroo Tanaka, Masaya Nakamura Hiroyuki Wariishi (2006) Isolation and Characterization of a Novel Lignin Peroxidase from the White rot Basidiornycete Trametes cervina J Fac Agr Kyushu Univ., 51 (1), 99-104 Nguyễn Thanh Hảo 71 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 53 Hồ Xuân Các (1994) Hoá học gỗ Công nghệ chế biến gỗ Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, trang 14 – 15 54 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2009), Công nghệ sinh học tập ba: Công nghệ enzyme ứng dụng , NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội 55 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzym, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 56 Lê Quang Diễn (2011), Các thí nghiệm hóa học xenluloza, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 57 Nguyễn Lân Dũng (2001), Giáo trình Vi sinh vật học_Phần 8, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thanh Hảo 72 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Bảng 1: Kết tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp LiP Hoạt độ (U/ml) Chủng Thời gian (ngày) 11 TB2-2 TB3-2 0.12 0.18 0.24 0.37 0.46 0.21 0.37 0.89 0.72 0.83 TB3-5 SBC4-5 SBC5-5 0.26 0.76 0.41 0.71 0.7 0.58 0.98 0.78 0.65 0.72 0.11 0.77 0.67 0.96 0.39 SBC5-6 SBC5-7 0.13 0.41 0.24 0.37 0.4 0.48 0.55 0.37 0.26 0.42 Bảng 2: Ảnh hưởng chế độ nuôi Chế độ nuôi Hoạt độ ( U/L ) Tĩnh Lắc 600 700 700 1000 900 1200 750 1050 Số ngày Bảng 3: Ảnh hưởng Tween80 Tween80 (%) Hoạt độ (U/L) 0.05% 1250 1500 0.1% 1100 0.15% 950 0.2% 800 Bảng 4: Ảnh hưởng V.A Veratryl Alcohol Hoạt độ ( U/L) mM 0.5 mM 530 1300 mM 1530 1.5 mM 1150 mM 750 Bảng 5: Ảnh hưởng Amonium tartrate Ammonium Tartrate (%) ngày Hoạt độ ngày (U/L) 0% 600 700 800 400 0.01% 0.02% 0.03% 800 900 950 900 1000 1250 1600 1300 900 1000 1300 600 Bảng 6: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống Tỷ lệ giống (TB/ml) Hoạt độ (U/L) Nguyễn Thanh Hảo 105 850 5x105 1150 73 1x106 1650 5x106 1500 1x107 350 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Bảng 7: Ảnh hưởng Glucose 0% 150 250 300 200 Glucose ngày Hoạt độ ngày (U/L) 0.5% 900 1150 1200 750 1% 1100 1500 1700 1000 1.5% 850 1100 1250 900 2.0% 750 850 1150 1100 Bảng 8: Ảnh hưởng thời gian nuôi Thời gian Hoạt độ ( U/L) 550 900 ngày 1780 ngày 1350 Bảng 9: Động thái trình lên men sinh tổng hợp LiP từ chủng Aspergilluss flavus Động thái trình lên men sinh tổng hợp lignin peroxidase Chỉ tiêu ngày ngày ngày 16 14.6 13.5 12.8 11.5 Sinh khối (g/l) 7.85 12.35 15.6 16.25 5.1 5.68 5.7 5.72 5.54 5.5 5.3 5.12 pH 4.5 Hoạt độ U/L) 300 600 1000 1450 1650 1400 1250 1200 1130 Thời gian Bảng 10: Khảo sát pH tối ưu LiP từ A.flavus pH Hoạt độ (U/L) 1400 2,5 1710 1600 3,5 1350 1200 4,5 1050 Bảng 11: Ảnh hưởng pH đến độ bền LiP từ A flavus (tính theo % lượng LiP giảm theo thời gian pH khác nhau) Thời gian(h) pH = pH = 2.5 pH = pH = pH = pH = 100 100 100 100 100 100 90.25 92.77 92.5 86.5 84.5 81.55 85 89.78 89.65 73.5 71 68.24 78.68 83.4 84.66 65.06 60.8 57 72.05 78.5 77.5 58.76 54.8 50 70.32 73.88 73.45 52.5 48.56 45.68 45 1300 50 1150 Bảng 12: Khảo sát nhiệt độ tối ưu LiP từ A.flavus Nhiệt độ (0C) Hoạt độ (U/L) Nguyễn Thanh Hảo 20 1550 25 1730 30 1600 74 40 1470 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Bảng 13: Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền LiP từ A.flavus Thời gian (h) Nhiệt độ 100 93.75 90.6 84.38 81.05 75.03 20°C 100 90.63 83.25 78.5 76.65 71.88 30°C 40°C 100 84.38 75.05 69.05 62.5 59.3 50°C 100 81.25 70.65 62.55 55.01 51.2 Bảng 14 Giá trị OD 750 nm tương ứng với hàm lượng protein Hàm lượng protein 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 (mg/ml) 0.085 0.162 0.24 0.314 0.381 0.452 Giá trị OD 750 nm Bảng 15 Ảnh hưởng nồng độ enzym tới hiệu xử lý bột giấy Hoạt độ (U/gr bột) 10U 15U 25.8 23.9 19.82 16.78 Hàm lượng lignin (%) 100 95.4 95.8 Hiệu suất thu hồi bột giấy (%) 96.8 Sự giảm lignin so với nguyên 11.6 26.4 37.04 liệu (%) Bảng 16 Ảnh hưởng nồng độ bột giấy tới hiệu xử lý bột giấy 16.55 95.7 Chỉ tiêu Nồng độ bột giấy (%) Trước xử lý 38.61 10% 13.33% 25.8 15.58 16.33 Hàm lượng lignin (%) 100 96.8 94.8 Hiệu suất thu hồi bột giấy (%) Sự giảm lignin so với nguyên 41.54 39.99 liệu (%) Bảng 17 Ảnh hưởng thời gian tới hiệu xử lý bột giấy 16.86 94.5 17.01 95.3 38.24 37.17 Mẫu Chỉ tiêu Trước xử lý 25.8 100 Sau 1h 18.53 95.93 4% 5U 6.67% Chỉ tiêu Trước xử lý 0U Sau 3h 17.09 95.4 Sau 4h 16.45 94.94 Sau 5h 15.8 95.72 Sau 7h 15.68 95,68 Hàm lượng lignin (%) Hiệu suất thu hồi bột giấy (%) Sự giảm lignin so với nguyên 31.1 36.81 39.46 41.3 41.74 liệu (%) Bảng 18 Mức dùng hóa chất tẩy trắng thí nghiệm giảm lượng hóa chất Hóa chất (% v/v) H2O2 NaOH Na2SiO3 Na-EDTA MgSO4 Mức dùng (%) 100 1,1 0,5 0,5 95 0,9 0,4 0,4 90 0.7 0,3 0,3 Nguyễn Thanh Hảo 75 CB 090703 Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ sinh học Hình 1: Phương pháp chụp bột giấy SEM Phủ Platin lên mẫu Cho mẫu vào máy Hiển thị kết máy tính Hình 2: Sinh tổng hợp LiP A.flavus sau ngày nuôi cấy Sau ngày Sau ngày Nguyễn Thanh Hảo Sau ngày Sau ngày 76 Sau ngày Sau ngày CB 090703 ... VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THANH HẢO NGHIÊN CỨU THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH LIGNIN PEROXYDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ỨNG DỤNG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG... xác định đặc tính lignin peroxydase từ chủng Aspergillus flavus ứng dụng nâng cao chất lượng bột giấy bao gói? ?? Nội dung nghiên cứu gồm: - Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt độ LiP cao - Khảo sát yếu... sâu, thu? ??c diệt cỏ có họ phenol (Kroschwitz, 1993; Syracuse nghiên cứu Corp, 1992) Chính tầm quan trọng khả ứng dụng của LiP, tiến hành nghiên cứu đề tài : ? ?Nghiên cứu thu nhận, xác định đặc tính