Nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp sắc kí hấp phụ và khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết mangiferin từ bột lá xoài

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA Nghiên cứu tinh phương pháp sắc kí hấp phụ khảo sát hoạt tính sinh học dịch chiết mangiferin từ bột xoài Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Phương Số thẻ SV: 107140143 Lớp: 14H2B Đà Nẵng – Năm 2019 TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu tinh phương pháp sắc kí hấp phụ khảo sát hoạt tính sinh học dịch chiết mangiferin từ bột xoài Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Phương Số thẻ SV: 107140143 Lớp: 14H2B Trong báo cáo này, nhựa macroporous D101 sử dụng để tinh cao chiết mangiferin thô từ bột xoài Kết cho thấy điều kiện tối ưu để tinh mangiferin nhựa macroporous D101 sau: chọn tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 6, thể tích dịch nạp cột hấp phụ BV với tốc độ hấp phụ BV/h Giải hấp phụ dung mơi nước ethanol 60% với thể tích giải hấp BV nước 1,5 BV ethanol 60% Phương pháp tinh nhựa thu hàm lượng mangiferin 13,615 mg/g, hiệu suất thu hồi đạt 6,72% Mangiferin tinh có khả kháng oxy hóa (IC50 = 38,5 µg/ml) thấp cao thô (IC50 = 17,67 µg/ml) khoảng 2,2 lần thấp so với vitamin C (IC50 = 2,3 µg/ml) 17 lần Mangiferin tinh có khả kháng vi khuẩn E.coli (MIC = 50 mg/ml), vi khuẩn Salmonella (MIC = 50 mg/ml) gấp lần so với cao thô vi khuẩn Vibrio (MIC = 10 mg/ml) cao gấp 2,5 lần so với cao thô ban đầu (MIC = 25 mg/ml) Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Mỹ Phương Lớp: 14H2B Khoa: Hóa Số thẻ sinh viên: 107140143 Ngành: Công nghệ thực phẩm Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu tinh phương pháp đại khảo sát hoạt tính sinh học dịch chiết mangiferin từ bột xoài Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ kết thực Các số liệu liệu ban đầu: Nội dung phần thuyết minh tính tốn: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Các vẽ, đồ thị ( ghi rõ loại kích thước vẽ ): Khơng Họ tên người hướng dẫn: Nguyễn Thị Trúc Loan Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 29/12/2019 Ngày hoàn thành đồ án: 30/05/2019 Trưởng Bộ môn PGS.TS Đặng Minh Nhật Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2019 Người hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trúc Loan LỜI CẢM ƠN Trải qua năm học Trường Đại học Bách khoa-Đại học Đà Nẵng, em tích lũy tri thức, kinh nghiệm phương pháp nghiên cứu hành trang hỗ trợ cho em tương lai Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy cô công tác Trường Đại học Bách khoa, thầy cô Khoa Hóa, thầy Bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm đặc biệt TS Nguyễn Thị Trúc Loan nhiệt tình truyền đạt kiến thức cho thân em Em xin chân thành cảm ơn cô TS Nguyễn Thị Trúc Loan tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Nếu khơng có lời khun cho em giai đoạn khó khăn em khó hoàn thành tốt đề tài Trong thời gian thực đề tài cô truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, ln định hướng góp ý sửa chữa phương pháp, nội dung vấn đề liên quan đến đề tài để em hoàn thành tốt Đồng thời, em xin gởi lời cảm ơn đến Th.S Đặng Thanh Long (Cán Viện Sinh học - Đại học Huế) tạo điều kiện phịng thí nghiệm, trang thiết bị để em hoàn thành đề tài cách thuận lợi Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn gia đình hỗ trợ tài động viên, giúp đỡ nguồn động lực giúp đỡ em thời điểm khó khăn học tập để hồn thành tốt đề tài giao Và giúp đỡ, hỗ trợ bạn lớp 14H2B, bạn thực đề tài phịng thí nghiệm qng thời gian học tập làm thí nghiệm Bước đầu vào làm nghiên cứu khoa học, không tránh khỏi bỡ ngỡ thiếu sót, em mong nhận thơng cảm đóng góp ý kiến quý báu thầy để đề tài em hồn thiện Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành giáo viên phản biện thầy cô Hội đồng Bảo vệ dành thời gian để xem xét đánh giá góp ý Đồ án em Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2019 Nguyễn Thị Mỹ Phương i LỜI CAM ĐOAN LIÊM CHÍNH HỌC THUẬT Tơi xin cam đoan số liệu kết tính tốn đồ án tốt nghiệp trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực đồ án cảm ơn thông tin trích dẫn đồ án rõ nguồn gốc rõ ràng phép công bố Đà Nẵng, ngày 30 tháng 05 năm 2019 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mỹ Phương ii MỤC LỤC TÓM TẮT i NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP iii LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN LIÊM CHÍNH HỌC THUẬT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VẼ vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tìm hiểu xồi mangiferin 1.1.1 Tổng quan xoài 1.1.2 Thành phần hóa học cấu trúc mangiferin 1.1.3 Tính chất mangiferin 1.1.4 Tác dụng dược lí mangiferin 1.2 Phương pháp tinh đại sắc kí hấp phụ 1.2.1 Kỹ thuật sắc kí 1.2.2 Cơ sở lý thuyết hấp phụ 1.2.3 Hạt nhựa macroporous 1.2.4 Sắc kí cột hở cổ điển 12 1.2.5 Sắc kí lớp mỏng 12 1.3 Tổng quan kháng oxy hóa kháng khuẩn mangiferin 14 1.3.1 Kháng oxy hóa 14 1.3.2 Kháng khuẩn 15 1.4 Tình hình nghiên cứu tinh hoạt tính sinh học mangiferin giới nước 16 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 iii 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ dùng nghiên cứu 20 2.2.1 Hóa chất sử dụng 20 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm định tính, định lượng mangiferin cao chiết từ xoài 21 2.3.2 Tinh mangiferin phương pháp sắc kí cột 22 2.3.3 Đánh giá khả kháng oxy hóa kháng khuẩn 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp chiết mangiferin dung môi nước ethanol 600 22 2.4.2 Định tính định lượng mangiferin cao xoài 23 2.4.3 Nghiên cứu tinh mangiferin phương pháp đại sắc kí cột 26 2.4.4 Đánh giá khả kháng oxy hóa kháng khuẩn 30 2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu 32 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Đường chuẩn dung dịch mangiferin chuẩn 33 3.1.1 Bước sóng hấp thu cực đại dung dịch mangiferin chuẩn 33 3.1.2 Bước sóng hấp thu cực đại dịch chiết xoài 33 3.1.3 Đường chuẩn mangiferin 34 3.1.4 Kết so sánh hàm lượng mangiferin cao chiết khác 34 3.2 Tinh mangiferin phương pháp đại sắc kí cột 35 3.2.1 Kết khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 35 3.2.2 Kết xác định thể tích dịch nạp cột 35 3.2.3 Kết khảo sát trình giải hấp phụ 36 3.3 Kết định danh xác định độ tinh khiết mangiferin sau tinh 40 3.3.1 Kết định tính mangiferin 40 3.3.2 Kết định lượng mangiferin 41 iv 3.4 Kết khả kháng oxy hóa cao siêu âm – methanol mangiferin sau tinh 42 3.4.1 Kết phương trình tương quan tuyến tính % hoạt tính bắt gốc tự với nồng độ cao thô mangiferin tinh 42 3.4.2 Kết khả kháng oxy hóa cao thơ mangiferin tinh 44 3.5 Kết đánh giá khả kháng khuẩn cao siêu âm – ethanol mangiferin tinh 44 3.5.1 Kết khả kháng khuẩn cao chiết siêu âm - ethanol 44 3.5.2 Kết khả kháng khuẩn mangiferin tinh 45 3.6 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 49 3.7 Đề xuất quy trình cơng nghệ 49 3.7.1.Quy trình cơng nghệ 49 3.7.2 Thuyết minh quy trình cơng nghệ 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 522 PHỤ LỤC 566 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loại pha tĩnh pha động sử dụng kĩ thuật sắc kí Bảng 1.2 Phân loại sắc kí theo chất tượng xảy trình tách chất Bảng 1.3 Đặc tính vật lí số hạt nhựa macroporous Bảng 1.4 Thông số vật lí hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất 10 Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang cao chiết 35 Bảng 3.2 Dung lượng hấp phụ mangiferin (Qe) hiệu suất rửa giải hấp phụ (Hghp) 35 Bảng 3.3 Nồng độ mangiferin khối lượng cắn rửa giải sau thể tích nước 37 Bảng 3.4 Hàm lượng mangiferin sau tinh 42 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa IC50 cao thơ, mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn vitamin C 44 Bảng 3.6 Đường kính vịng kháng khuẩn cao siêu âm – ethanol vi khuẩn E.coli, Salmonella, Vibrio (mm) 44 Bảng 3.7 Đường kính vịng kháng khuẩn mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn, kháng sinh ampicillin vi khuẩn E.coli (mm) 46 Bảng 3.8 Đường kính vịng kháng khuẩn mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn, kháng sinh ampicillin vi khuẩn Salmonella (mm) 47 Bảng 3.9 Đường kính vịng kháng khuẩn mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn, kháng sinh ampicillin vi khuẩn Vibrio (mm) 48 Bảng 3.10 Tác động gây độc tế bào ung thư mangiferin ellipticine 49 vi DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc mangiferin Hình 1.2 Than hoạt tính silicagel Hình 1.3 Cấu tạo zeolit Hình 1.4 Hạt nhựa macroporous Hình 1.5 Hình thái cách phân bố chuỗi polymer hạt nhựa macroporous Hình 1.6 Bình sắc kí lớp mỏng 12 Hình 1.7 Sự dịch chuyển hợp chất sắc kí lớp mỏng 13 Hình 2.1 Bột xồi 19 Hình 2.2 Hạt nhựa macroporous D101 19 Hình 2.3 Mangiferin chuẩn 19 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21 Hình 2.5 Phương pháp Soxhlet với dung môi ethanol nước 23 Hình 2.6 Phương pháp siêu âm bể với dung mơi ethanol nước 23 Hình 2.7 Bộ cô quay thu cao thô 26 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát λmax dung dịch chuẩn mangiferin 33 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn kết khảo sát λmax dịch chiết xồi 33 Hình 3.3 Đường chuẩn dung dịch mangiferin chuẩn xây dựng theo phương pháp đo quang 34 Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng thể tích dịch nạp cột đến tỉ lệ mangiferin không hấp phụ 36 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng thể tích nước khác đến hàm lượng mangiferin cắn 37 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng ethanol có nồng độ khác đến tỉ lệ giải 38 hấp phụ mangiferin 38 Hình 3.7 Sắc kí đồ dung dịch giải hấp phụ ứng với ethanol có nồng độ khác 38 Hình 3.8 Dung dịch giải hấp phụ ứng với ethanol có nồng độ khác 39 Hình 3.9 Đồ thị ảnh hưởng thể tích rửa giải đến nồng độ mangiferin dịch giải hấp phụ 40 Hình 3.10 Phản ứng màu đặc trưng mangiferin 40 Hình 3.11 Sắc kí mỏng với thuốc thử màu mangiferin tinh phương pháp sắc kí hấp phụ 41 Hình 3.12 Sản phẩm mangiferin trước sau tinh 42 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao chiết 43 vii Nghiên cứu tinh phương pháp đại khảo sát hoạt tính sinh học dịch chiết mangiferin từ bột xoài 120 y = 31.096ln(x) + 247.11 R² = 0.9743 % 100 80 60 sae 40 20 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 Tỉ lệ pha loãng Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao chiết Phương trình tương quan tuyến tính % hoạt tính bắt gốc tự với nồng độ mangiferin tinh thể hình 3.14 % Khả kháng oxi hóa mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn vitamin C 100 y = 26.678ln(x) + 212.4 R² = 0.9827 90 80 y = 21.822ln(x) + 169.36 R² = 0.9734 70 vitamin C 60 y = 23.244ln(x) + 126.88 R² = 0.946 50 40 mangiferin mangiferin chuẩn 30 20 10 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Tỉ lệ pha lỗng Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn % hoạt tính bắt gốc tự DPPH mangiferin tinh đại, mangiferin chuẩn vitamin C SVTH: Nguyên Thị Mỹ Phương GVHD: TS Nguyễn Thị Trúc Loan 43 Nghiên cứu tinh phương pháp đại khảo sát hoạt tính sinh học dịch chiết mangiferin từ bột xoài 3.4.2 Kết khả kháng oxy hóa cao thơ mangiferin tinh Giá trị IC50 cao siêu âm – ethanol mangiferin tinh thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa IC50 cao thơ, mangiferin tinh sạch, mangiferin chuẩn vitamin C Cao chiết Cao siêu âm - Mangiferin Mangiferin ethanol tinh chuẩn 17,67 ± 0,09 38,5 ± 0,37 4,2 ± 0,14 IC50 (µg/ml) Vitamin C 2,3 ± 0,16 Nhận xét: Từ bảng 3.5 ta thấy giá trị IC50 mangifein sau tinh (IC50 = 38,5 µg/ml) thấp khoảng 2,2 lần so với cao thơ (IC50= 17,67 µg/ml), thấp 9,2 lần so với mangiferin chuẩn thấp 17 lần so với vitamin C (IC50= 2,3 µg/ml) Như sau làm phương pháp đại khả kháng oxy hóa mangiferin giảm Chứng tỏ trình làm loại bỏ polyphenol khác có tính kháng oxy hóa 3.5 Kết đánh giá khả kháng khuẩn cao siêu âm – ethanol mangiferin tinh 3.5.1 Kết khả kháng khuẩn cao chiết siêu âm - ethanol Khả kháng khuẩn xác định dựa khả ức chế phát triển vi khuẩn thông qua vòng kháng khuẩn xuất đĩa Đối với vi khuẩn, khả kháng khuẩn cao thô nồng độ khác thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Đường kính vịng kháng khuẩn cao siêu âm – ethanol vi khuẩn E.coli, Salmonella, Vibrio (mm) Đường kính vịng kháng khuẩn Nồng độ cao chiết (mg/ml) E.coli Salmonella Vibrio 1000 16,7d ± 0,6 17d ± 24g ± 750 12,3bc ± 0,6 13c ± 22ef ± 500 11,6bc ± 0,6 10,3ab ± 0,6 20,6ef ± 0,6 300 8a ± 9ab ± 18,67d ± 0,6 200 ức chế ức chế 16,3c ± 0,6 100 - - 13,7b ± 0,6 50 - - 11a ± 25 - - ức chế SVTH: Nguyên Thị Mỹ Phương GVHD: TS Nguyễn Thị Trúc Loan 44 Nghiên cứu tinh phương pháp đại khảo sát hoạt tính sinh học dịch chiết mangiferin từ bột xoài Chú thích: Những giá trị mang chữ khác cột thể khác có ý nghĩa thống kê (p