Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn vị thuốc ba kích và khảo sát thành phần hóa học của dịch chiết ethanol ba kích

1 Đ T VẤN ĐỀ Tiêu chu ẩn hóa và kiểm tra chặt ch ẽ nguồn nguyên liệu ban đầu là yếu tố sống còn đ ể đảm bảo hiệu lực và tác dụng của thuốc th ảo mộ c. Vì vậy công tác kiểm nghiệm dược liệu để xác định rõ nguồn g ốc, tránh nhầm lẫn, giả mạo là hết sức quan trọng. Đây cũng là một hư ớng phát triển của ngành Dư ợc và là một trong những giải pháp nh ằm hiện đ ại hóa n ền ydư ợc học cổ truyền Việt Nam. Ba kích là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong và ngoài nước. Trên thế giới đã nghiên cứu v ề một số hợp chất trong rễ Ba kích có ứng dụng trong điều trị như Monotropein có tác dụng chống viêm 26, Oligosaccharid có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron 19, hay nhóm Anthraquinon và Polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương 31 . Hiện nay, chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam IV và Dược điển Trung Quốc chưa c chỉ tiêu thành ph ần hóa học. Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn vị thuốc Ba kích và khảo sát thành phần hóa học của dịch chiết ethanol a kích” được tiến hành v ới m ục tiêu: 1. Khảo sát thành phần monotropein trong dịch chiết ethanol Ba ch bằng phương pháp s c lỏng hiệu năng cao HPLC. 2. Nâng cao tiêu chuẩn h a chuyên luận Ba ch trong Dược điển Việt Nam IV.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ NGA

NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU CHUẨN VỊ THUỐC BA KÍCH VÀ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA DỊCH CHIẾT ETHANOL

BA KÍCH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

CỦA DỊCH CHIẾT ETHANOL

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Trần Việt Hùng – Phó viện trưởng, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận

DS Phạm Thái Hà Văn, TS Bùi Hồng Cường, Các thầy cô giáo và cán

bộ kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội;

TS Nguyễn Quốc Huy – Bộ môn thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội và

DS Trịnh Thị Hồng Thảo cùng các anh chị khoa Vật lý đo lường - Viện kiểm

nghiệm thuốc Trung ương đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập của mình

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Trịnh Thị Nga

Trang Danh mục các hiệu, các chữ viết t t

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Đ T VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Ba kích 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Mô tả cây 2

1.1.3 Cây dễ nhầm lẫn 3

1.1.4 Phân bố, thu hái và chế biến 3

1.1.5 Thành phần hóa học 3

1.1.6 Tác dụng dược lý 4

1.1.7 Công dụng và liều dùng 6

1.1.8 Bài thuốc có Ba kích 7

1.1.9 Một số phương pháp dùng nhận biết Ba kích 8

1.2 S c kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.2.1 Khái niệm 11

1.2.2 Detector dùng trong HPLC 12

1.2.3 Các thông số đặc trưng của HPLC 12

1.3 Monotropein 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG V PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp chiết xuất 17

2.2.3 Định tính một số nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 18

2.2.4 S c kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 19

2.2.5 Thẩm định phương pháp HPLC 20

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 21

Chương 3: THỰC NGHIỆM ẾT QUẢ V N UẬN 22

3.1 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 22

3.1.1 Bào chế cao đặc và xác định hiệu suất 22

3.1.2 Định tính một số nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 23

3.1.3 Xây dựng phương pháp định t nh, định lượng Monotropein bằng HPLC 24

3.1.3.1 Quy trình chạy s c kí 24

3.1.3.2 Thẩm định phương pháp HPLC 25

3.2 Bàn luận……… …30

3.2.1 Về đối tượng nghiên cứu 30

3.2.2 Về phương pháp nghiên cứu 31

3.2.2.1.Phương pháp chiết xuất 31

3.2.2.2 Phương pháp HPLC 31

3.2.2.3 Khảo sát điều kiện s c kí 32

3.2.2.4 Thẩm định phương pháp phân t ch 33

ẾT UẬN V IẾN NGHỊ 34

Kết luận 34

Kiến nghị 35

T I IỆU TH M HẢO

(Diod array detector) Methanol

Ethylacetat

S c kí lớp mỏng Phản ứng

Ba kích Dược điển Việt Nam IV Dược điển Trung Quốc Thuốc thử

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Khối lượng

Hàm ẩm Dung dịch

Độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation)

Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số phương pháp SKLM định t nh Ba ch 10

Bảng 3.2 Định t nh các nh m chất trong vị thuốc và cao đặc 24 Bảng 3.3 Chương trình chạy dung môi pha động 25

Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cây Ba kích (Morinda officinalis How) 2

Hình 1.5 Định t nh bằng HPLC 5 anthranoid 11

Hình 2.1 Máy HPLC Agilient Technologies 1200 16

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện t ch pic

của Monotropein

28

Đ T VẤN ĐỀ

Tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chặt chẽ nguồn nguyên liệu ban đầu là yếu tố sống còn để đảm bảo hiệu lực và tác dụng của thuốc thảo mộc Vì vậy công tác kiểm nghiệm dược liệu để xác định rõ nguồn gốc, tránh nhầm lẫn, giả mạo là hết sức quan trọng Đây cũng là một hướng phát triển của ngành Dược và là một trong những giải pháp nhằm hiện đại hóa nền y-dược học cổ truyền Việt Nam

Ba kích là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong và ngoài nước Trên thế giới đã nghiên cứu về một số hợp chất trong rễ Ba kích có ứng dụng trong điều trị như Monotropein có tác dụng chống viêm [26], Oligosaccharid có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [19], hay nhóm Anthraquinon và Polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương [31] Hiện nay, chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam IV và Dược điển Trung Quốc chưa c chỉ tiêu thành phần hóa học

Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn vị thuốc Ba kích và khảo sát thành phần hóa học của dịch chiết ethanol a kích” được tiến

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 BA KÍCH

1.1.1 Tên khoa học

Morinda officinalis How., họ Cà phê Rubiaceae

Tên gọi khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chẩu phóng xì (Hải Ninh), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, sáy cày (Thái), chày kiang dòi (Dao), liên châu ba kích, Medicinal indian mulberry (Anh) [5], [11], [13]

1.1.2 Mô tả cây

Ba ch là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét Thân non màu t m, c lông, sau nhẵn Cành non c cạnh Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2,5-6 cm, cuống ng n, lúc non c lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân và mép lá, màu xanh lục, sau già lá t lông hơn và c màu tr ng mốc; lá èm mỏng, ôm sát vào thân Hoa nhỏ, màu tr ng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành, dài 0,8-1,5cm; đài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển hông đều; tràng hoa hàn liền ở ph a dưới thành ống ng n, nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời nhau hoặc

d nh liền thành hối, hi ch n màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh Mùa hoa: tháng 5-6 Mùa quả: tháng 7-10 [5], [11]

Trong thiên nhiên và trồng trọt hiện nay còn c loài Ba ch mà hoa và quả tụ

lại (Morinda sp.) Cụm hoa dài 0,5-2 cm Lá đài ém phát triển Lá dày hơn loài

trên, c lông ng n [11]

Hình 1.1 Cây Ba kích (Morinda officinalis How.)

1.1.3 Cây dễ nhầm lẫn

Nhầm lẫn c thể do những nguyên nhân:

- Nhầm lẫn do hình dáng của cây:

+ Ba kích lông - Morinda cochinchinensis Lour: Cây c rễ gầy và t thịt Lá to Quả

chín màu vàng Toàn cây nhất là thân và lá phủ lông rất dày

+ Mặt quỷ - Morinda villosa Hoo : Cây c rễ nhỏ, cứng Thân, lá nhẵn Hoa và quả

tụ Cây này rất dễ nhầm với loài Ba ch quả tụ (Morinda sp.)

+ Cây giang mủ - Zygostelma benthami Baillon var lineare Cost Họ Thiên lý

Asclepiadaceae: Dây leo Rễ c vỏ mỏng và cứng, lõi gỗ to Lá hông c lá èm, c

nhựa mủ tr ng Quả thuôn dài Năm 1980 rễ Cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var lineare Cost Họ Thiên lý Asclepiadaceae) đã được thu mua ở một địa

phương miền núi Tây B c với tên “ba ch” với hối lượng là 2 tấn

- Nhầm lẫn do tên gọi:

Dây ruột gà còn dùng chỉ Sam tr ng – Bacopa monnieri (L.) Pennell (Herpestis

monnieri (L.) Rothm.) Rau đ ng biển, thyme- leaved gratiola (Anh), họ Hoa mõm

chó Scrophulariaceae hoặc Mộc thông – Clematis chinensis Osbeck(C.minor L.),

họ Mao lương Ranunculaceae [11],[13]

1.1.4 Phân bố thu hái và chế biến

Ở Việt Nam: Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh ph a B c: Quảng Ninh, Vĩnh Phú, Hà Tây, Phú Thọ, B c Ninh, B c Giang Ba ch cũng mọc nhiều ở Trung Quốc: Quảng Đông, Quảng Tây… Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng c thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay

Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae)

Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi hô tới hi hông

d nh tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến hô hoặc sấy nhẹ đến hô [5], [11], [13]

1.1.5 Thành phần hóa học

Một số nh m chất trong rễ Ba ch gồm:

- Anthraquinone: 2,4-dimethoxyanthraquinone,

1,6-dihydroxy-2-methoxyanthraquinone, methylisoalizarin, methylisoalizarin-methyl ether, hydroxy-2-methoxyanthraquinone, 1-hydroxy-2-methylanthraquinone, physcion, 1-hydroxy-anthraquinone, 2-methylanthraquinone, lucidin-ω-methyl ether, 2-

1-hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone, rubiadin và rubiadin-1-methyl ether, tectoquinon, alizarin-1-methylether, 1-hydroxy-2,3dimethylanthraquinon, 1-

hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinon [25]

- Iridoid: monotropein, morindolid, morofficinalosid, asperulosid, acid

asperulosidic, acid desacetyl asperulosidic [13],[25]

- Glucoside: nystose, 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharide

and heptasaccharide, l-borneol-6-o-β-D-apiosyl- β-D-glucosid [13]

- 2 hợp chất sterol: β-sitosterol, oxositosterol.1 hợp chất saponintriterpen iểu ursan: acid rotungenic 1 hợp chất lacton: (4R,5S)-5-hydroxyhexan-4-olid 24-

ethylcholesterol, 1 ceton (officinalisin), 1 vài acid amin [11], [13]

- Vitamin C chỉ c trong Ba ch tươi [5], [11]

1.1.6 Tác dụng dƣợc lý

a) Tác dụng tăng lực

٭ Với nghiệm pháp chuột bơi, dịch chiết nước Ba ch với liều 5-10g/ g cơ

thể, dùng liên tiếp 7 ngày, c tác dụng tăng sức dẻo dai cho súc vật th nghiệm

٭ Dùng phương pháp gây nhiễm độc cấp bằng amoni clorua (NH4Cl) trên chuột nh t tr ng, với liều 15-20g/ g cơ thể bằng đường uống trước hi tiêm NH4Cl

Ba ch c tác dụng tăng sức đề háng chung của cơ thể với các yếu tố độc hại

→ Từ ết quả của 2 th nghiệm trên chứng tỏ inh nghiệm nhân dân dùng Ba

ch làm thuốc bổ là c căn cứ hoa học [11],[13]

b) Tác dụng chống viêm

٭ Th nghiệm được tiến hành trên chuột cống tr ng với mô hình gây phù bàn

chân chuột bằng nhũ dịch aolin 10%, Ba ch được dùng với các liều lượng 5g, 10g và 20g/ g cơ thể tiêm dưới da trước hi gây phù Kết quả cho thấy Ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt [5], [10]

c) Nghiên cứu một số tác dụng nội tiết

٭ Với hệ thống nội tiết, th nghiệm trên chuột cống đực thấy Ba ch hông c

tác dụng iểu androgen, nhưng c thể c hả năng tăng cường hiệu lực của androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hocmon androgen Ba ch làm tăng trọng lượng tinh hoàn, cơ nâng hậu môn và túi tinh còn trọng lượng tuyến tiền liệt hông thay đổi đáng ể

٭ Nước s c Ba ch c tác dụng làm tăng sự co b p của ruột và giảm huyết áp

[5], [10]

d) Hạ đường huyết và giảm stress

* Dịch chiết cồn Ba ch c tác dụng hạ đường huyết và giảm stress oxy h a trên chuột cống đái tháo đường giúp ngăn ngừa các biến chứng của đái tháo đường

Ba ch c tác dụng bảo vệ tế bào chống lại stress oxy h a trên tế bào Leydig TM3 gây bởi hydrogen peroxide [7]

Oligosaccharid: có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần

kinh do corticosteron, có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng chứng minh viên nang oligosaccharid từ Ba kích có thể chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa, hiệu quả chữa trị tương đương với fluoxetin hydrochlorid, phản ứng phụ rất ít và nhẹ, có thể áp dụng trong chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa [15], [19], [21] Năm hợp chất c tác dụng chống trầm uất: acid succinic, nystose, 1-F-fructose-furanosylnystose, hexasaccarid iểu inulin và heptasaccarid [12]

e) Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ

Quan sát ảnh hưởng của Ba ch đối với tổn thương thiếu máu cục bộ - tái tưới máu cơ tim chuột cống tr ng, Ba ch c tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ, cơ chế chủ yếu liên quan tới việc ngăn chặn quá trình tăng calci quá mức và các gốc oxy tự do [15]

f) Tác dụng trên xương

Anthraquinon và Polysaccharid c liên quan đến việc điều chỉnh cũng như

tăng cường sự hình thành xương, tăng sinh tế bào tạo xương in vivo, và có tác dụng

trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương Các polisaccharid: c

tác dụng bảo vệ, chống mất xương và c t nh chống oxy h a do tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa của cơ thể, làm giảm lượng MDA (Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm So sánh với chuột được kiểm soát bình thường, Polysaccharid làm tăng sự xuất hiện của các gen như BMP-2, Cbfal, Rrankl, rOPG, rPPARγ2 mARN trên chuột được điều trị bằng Polysaccharid Các gen này đều

đ ng vai trò quan trọng trong sự phát triển, trao đổi chất của xương và sụn [15], [31]

Như vậy, rễ Ba ch vừa c hả năng ức chế sự tiêu xương, vừa c thể tăng cường sự tái tạo và hình thành xương

Anthraquinon: đã được báo cáo có tác dụng giảm đau, chống viêm, kháng

khuẩn, chống oxy hóa, chống HIV [17], [31]

Ba hợp chất anthraquinon: 1, 3, 8-trihydroxy-methoxy-anthraquinone, hydroxy-1-methoxy-anthraquinone và rubiadin được chứng minh là có tác dụng bảo

2-vệ chống lại sự tiêu xương hi thực hiện c t bỏ buồng trứng ở chuột Ở nồng độ 0,1

- 10µmol/l chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương theo cách điều trị liều độc lập, làm giảm lượng tế bào hủy xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid phosphates (TRAP), enzim cathepsin K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic anhydrase II (CA II) là những thành phần đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy xương Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác dụng chặn sự báo hiệu cho tế bào hủy xương của NK-ҡB (nuclear factor kappa B ) và JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng thời điều chỉnh tỉ

lệ OPG/RANKL (Osteopro-tegerin / receptor activator of NF-ҡB ligand ) của tế bào tạo xương [17], [31]

g) Độc tính cấp

LD50 xác định trên chuột nh t tr ng bằng đường uống của Ba kích là 193g/kg Chứng tỏ Ba ch c độ độc t nh rất thấp [10]

1.1.7 Công dụng và liều dùng

Theo Đông y, Ba ch là vị thuốc c t nh ôn, vị ngọt hơi cay, quy inh thận

C tác dụng ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp [5],[10], [11], [13]

* Đối với bệnh nhân nam giới c hoạt động sinh dục hông bình thường, Ba

ch c tác dụng làm tăng hả năng giao hợp, đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu và thưa Ba ch c tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù n hông làm tăng đòi hỏi tình dục, hông thấy c tác dụng iểu androgen C tác dụng hỗ trợ

và cải thiện hoạt động sinh dục cũng nhưng như điều trị vô sinh cho những nam giới

c trạng thái vô sinh tương đối và suy nhược thể lực

* Đối với người tuổi già, bệnh nhân c biểu hiện mệt mỏi, ém ăn t ngủ, người gầy yếu, Ba ch c tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm giác chủ quan như đỡ mệt mỏi, ngủ ngon, ăn ngon miệng và những dấu hiệu hách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực Đối với bệnh nhân đau mỏi các hớp thì sau hi dùng

Ba ch dài ngày các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt Nh m bệnh nhân dùng phối hợp Ba kích và vitamin B1 c ết quả tốt hơn nh m dùng Ba ch đơn thuần

* Trong nhân dân, Ba kích là một vị thuốc bổ trí não và tinh khí, dùng chữa các bệnh liệt dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, phụ nữ kinh nguyệt hông đều phong thấp cước khí, gân cốt yếu mềm, lưng gối đau mỏi

* Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc hác Liều dùng: 5-12g/ngày dưới dạng thuốc s c hoặc cao lỏng

* Kiêng kị: Người âm hư hỏa vượng, đại tiện táo ết hông nên dùng

1.1.8 ài thuốc có a kích

* Huyết áp cao: Ba ch, Tiên mao, Dâm dương ho c, Tri mẫu, Hoàng bá,

Đương quy; mỗi vị 12g, nước 600ml, s c còn 200ml, chia 3 lần uống trong ngày, thời gian điều trị 3 tháng (Nhị tiên thang của Trung Quốc)

* Lưng gối đau mỏi, mặt trắng nhợt nhạt, chân tay lạnh: Ba kích, Tục đoạn,

Bổ cốt chi; mỗi vị 12g Hồ đào nhục 5 quả s c uống hoặc tán bột uống

* Thận hư, dương ủy, di tinh: Ba ch, Thục địa; mỗi vị 15g Sơn thù du, Kim

anh; mỗi vị 12g s c uống

* Dùng chữa người già yếu, chân gối tê mỏi: Ba ch nhục 10g, Thục địa 10g,

Nhân sâm (hoặc Đảng sâm) 4g, Thỏ ty tử 6g, Bổ cốt toái 5g, Tiểu hồi hương 2g [4],[5],[11], [13]

1.1.9 Một số phương pháp dùng nhận biết a kích

1.1.9.1 Đặc điểm đại thể

Hình trụ tròn hoặc dẹt, cong queo, nhiều đoạn nứt sâu để lộ lõi gỗ bên trong Mặt ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, c nhiều vân dọc Bên trong là thịt màu hồng hay t m, vị hơi ngọt [11], [13] (Hình 1.2)

1.1.9.2 Phương pháp hiển vi

Vi phẫu rễ: Lớp bần gồm 3-4 hàng tế bào hình chữ nhật nằm ngang, xếp đều

Sát lớp bần c một lớp tế bào mô cứng dày Xen giữa lớp bần và lớp mô cứng rải rác c các b tinh thể calcioxalat hình im nằm ngang Mô mềm vỏ gồm nhiều hàng

tế bào hình nhiều cạnh, tròn hoặc dẹt Rải rác trong mô mềm c những tế bào chứa tinh thể calcioxalat hình im ng n chụm thành b Libe tạo thành một lớp uốn lượn bao quanh gỗ Ở gần libe c những tế bào mô cứng riêng lẻ hoặc từng đám Gỗ chiếm toàn bộ phần giữa rễ [2] (Hình 1.4)

Soi bột:Bột có màu nâu nhạt, vị hơi chát, mùi thơm dịu Soi kính hiển vi thấy:

Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật, mảnh mô mềm cấu tạo bởi các tế bào hình nhiều cạnh thành mỏng, một số tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim, dài khoảng 0,1 mm và các đoạn gãy của chúng Rải rác có các hạt tinh bột và nhiều mạch điểm [2] (Hình 1.3)

ether dầu hỏa (300C đến

400C)- EtOAc -CH3COOH

băng (7,5:2,5:0,25)

Bản mỏng silicagel G Thể tích chấm mẫu: 10µl

TT hiện màu: dd kali hydroxyd 10% trong ethanol

CH3COOH (4:3:2:1)

TT: valilin/acid phosphoric 50%

Các vết màu xanh tím đậm [14]

- Pha động: Dung môi A: MeOH

Dung môi B: Acid acetic 1%

- Nhiệt độ cột: 300C

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Detector: 280nm [22]

Gradient:

Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)

Kết quả: Trên s c đồ có các pic đặc trưng của 5 anthranoid: alizarin-1-methylether,

1,2-dimethoxy-3-hydroxyanthraquinone,1-hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone, rubiadin-1-methylether and anthragallol-2-methylether (Hình 1.5)

1.2 SẮC Í ỎNG HIỆU NĂNG C O (HPLC)

1.2.1 hái niệm

HPLC là một ỹ thuật tách trong đ các chất phân t ch di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển hác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra hỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đ Thành phần pha động đưa chất phân t ch di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân t ch với thời gian hợp lý [3], [1]

Pha động: Là dung môi để rửa giải chất tan ra hỏi cột tách để thực hiện một

quá trình s c ý Người ta c thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi thành phần pha động, tỷ lệ của các thành phần dung môi trong hỗn hợp

Kỹ thuật này được gọi là rửa giải gradient hay chương trình h a dung môi [1]

Hình 1.5 Định tính bằng HPLC 5 anthranoid

Pha tĩnh: Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn

hợp chất phân tích Nó là những chất r n, xốp, ch thước hạt rất nhỏ, đường kính từ 3 –

10 μm, diện tích bề mặt hạt thường từ 50 – 500 m2/g [1], [16]

1.2.2 Detector dùng trong HPLC

* Phát hiện chất phân tích có thể dựa vào:

- Đáp ứng chọn lọc với chất phân t ch hi detector hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang

- T nh chất chung của chất phân t ch trong pha động: detector, chỉ số húc xạ

- Khoảng hoạt động tuyến t nh rộng

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Detector sử dụng trong h a luận này là Detector dãy diod (DAD) c tỷ lệ

t n hiệu nhiễu thấp hơn so với detector UV-VIS bình thường DAD: là detector có một hoặc hai mảng diod để nhận bức xạ đã tán s c từ một cách tử ẻ vạch bằng laser Quang phổ và s c ý đồ c thể được hiển thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý t n hiệu bằng máy t nh C thể gọi DAD là detector quét s ng bên cạnh detector đo ở bước s ng cố định hoặc thay đổi Mặt hác, hệ thống này

c thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước s ng và thời gian [3],[1],[16]

1.2.3 Các thông số đặc trƣng của HP C

* Hệ số phân bố K (Partition coefficient) [1]

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K

K=Cs/CM

Cs, CM: lần lượt là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Ái lực tương đối của chất tan với 2 pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp

có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

* Thời gian lưu t R (Retention time): là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến

hi pic đến detector Tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển của các phân

tử pha động [1]

* Thời gian chết t 0: là thời gian của các chất hông lưu giữ [1]

* Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’ = tR – t0

* Hệ số dung lượng k’ (Capacity factor) [1]

Biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong pha động với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

* Độ phân giải R s (resolving power)

Biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện s c ký đã cho

 

2

RB RA s

R= 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn Yêu cầu R > 1, tối ưu R=1

1.3 Monotropein

Hình 1.6 Công thức của Monotropein

Tên khoa học:

[1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)-1,4a,7,7a-tetrahydro-7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid

* Tác dụng dược lý: c tác dụng chống viêm Monotropein được phát hiện ức chế biểu hiện của nitric oxid synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), yếu tố hoại tử α (TNF-α), và interleu in-1β (IL-1β) mRNA trong các đại thực bào RAW 264.7 gây bởi lipopolysaccharide (LPS) Việc xử lý bằng monotropein đã làm giảm tác dụng ết d nh ADN của nhân κB (NF-κB) Monotropein cũng ngăn chặn sự phosphoryl h a và suy giảm ức chế κB-α (IκB-α), và do đ hoán vị NF-κB Trong

mô hình viêm ruột ết gây bởi dextran sulfate sodium (DSS), monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh (DAI), hoạt động myeloperoxidase (MPO), và các biểu