* Thiết bị dụng cụ
Hình 2.1. Máy HPLC Agilient Technologies 1200
- Máy HPLC Agilient Technologies 1200. - Nồi cách thủy, nồi cất quay.
- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45μm.
- Pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác. - Máy l c siêu âm.
- Cân phân tích. - Tủ sấy, tủ hốt. - Bình nón 500 ml. - Bộ dụng cụ sinh hàn.
* Hóa chất, thuốc thử:
Đạt tiêu chuẩn phân t ch, được cung cấp bởi VKNTTW: - Ethanol tuyệt đối.
- Ether dầu hỏa. - Ethyl acetat - n-butanol. - Methanol.
- Acid acetic băng. - Kali hydroxyd. - Đồng sulfat. - Acid chlohydric. - Kali dihydrophostphat. - Natri hydroxyd.
* Chất chuẩn: Monotropein chuẩn, do VKNTTW cung cấp.
2.2. PHƢƠNG PH P NGHI N CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất
* Phương pháp:
- Sử dụng kỹ thuật chiết n ng dưới hồi lưu. - Hỗn hợp dung môi: Nước: EtOH (1:1).
- Dịch chiết thu được đem cô đặc đến tỷ lệ 1:1 so với dược liệu (1g dược liệu : 1ml dược liệu). Cô tiếp đến thể chất cao đặc (độ ẩm dưới 20%) thu được cao đặc toàn phần.
2.2.2. Phƣơng pháp xác định hiệu suất chiết
* Mất khối lượng do làm khô
Cân nhanh 0,5 g mẫu thử đem trải đều lên 1 cốc đáy bằng, c đường kính khoảng 50 mm, chiều cao 30mm. Sấy 1000C – 1050C trong 3 giờ, lấy ra và để trong bình hút ẩm. Sau đ đem cân lại và xác định khối lượng bị mất do làm khô.
* Xác định hiệu suất chiết cao
Dựa trên độ ẩm của cao đặc, t nh hiệu suất bào chế cao đặc theo công thức:
2.2.3. Định tính một số nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Mẫu nghiên cứu: bột Ba ch, cao đặc Ba kích.
* Định tính Iridoid.
Lấy 5g bột Ba kích cao cho vào bình cầu 100ml. Thêm 10ml EtOH đun hồi lưu 10 phút. Lọc bỏ bã. Dịch lọc, thêm 1 lượng tương đương với nước. Thêm 5ml dung dịch chì axetat 2%. Lọc. Dịch lọc acid hóa bằng H2SO4 để kết tủa PbSO4. Lọc, dịch lọc cô đặc, hòa vào ít cồn làm dung dịch thử. 1 ml dung dịch thử + 1-2 giọt TT Trim Hill, đun nhẹ. Nếu có Iridoid sẽ xuất hiện màu xanh.
(Thuốc thử Trim Hill: 10ml CH3COOH + 1ml dung dịch CuSO4 0,2% và 0,5ml HCl đặc) [9]
* Định tính anthranoid. (Phản ứng Borntraeger)
Định tính dạng tự do
Lấy 0,5g Ba kích cho vào ống nghiệm 10ml. Thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml ether . L c nhẹ, gạn lấy lớp ether.Lấy 1ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, l c nhẹ. Lớp nước sẽ có màu hồng [8].
Định tính anthranoid toàn phần
Lấy 0,5g bột Ba kích cho vào ống nghiệm 10ml. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như đối với dạng tự do. Lấy 1ml dịch chiết ether, cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. L c nhẹ. Lớp nước sẽ có màu hồng [8].
* Định tính saponin.
Quan sát hiện tượng tạo bọt: Lấy 1g bột cho vào ống nghiệm 10ml. Thêm 5ml EtOH. Đun cách thủy 10 phút, lọc dịch lọc sang ống nghiệm hác. Cô cạn còn ¼ thể
t ch, thêm hoảng 10 ml nước, l c mạnh trong 1 phút theo chiều dọc ống nghiệm. Kết quả dương tính khi sau 15 phút cho cột bọt bền vững [8].
* Định tính đường khử và acid hữu cơ.
Cho 2g bột Ba kích vào ống nghiệm, thêm 15ml nước cất. Đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc, lấy dịch lọc.
- Định t nh đường khử: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 1ml TT Fehling A và Fehling B. Đun cách thủy trong vài phút xuất hiện tủa đỏ gạch [8].
- Định t nh acid hữu cơ: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 1 t bột Na2CO3 thấy c bọt khí bay lên [8].
* Định tính alcaloid.
Cho 5 g bột Ba kích vào các bình n n 50ml, iềm h a bằng dd NH4OH, đậy n để trong 30 phút. Thêm 20ml dd CHCl3, l c đều, ngâm trong 1giờ. Lọc lấy dịch chiết CHCl3 cho vào bình gạn. L c dịch chiết với dd HCl 5% (15ml 3 lần), gạn lấy dịch chiết nước, chia vào 3 ống nghiệm. Thêm vào mỗi ống:
- Ống 1: Nhỏ 2 – 3 giọt TT Mayer. Phản ứng dương t nh hi c ết tủa tr ng. - Ống 2: Nhỏ 2 – 3 giọt TT Dragendorff. Phản ứng dương t nh hi c tủa da cam. - Ống 3: Nhỏ 2 – 3 giọt TT Bouchardat. Phản ứng dương t nh hi c tủa nâu đỏ [8].
* Tiến hành các phản ứng như trên, thay bột Ba kích bằng cao đặc Ba kích.
2.2.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HP C)
a. Chuẩn bị mẫu
+ Mẫu chuẩn: pha dung dịch Monotropein trong methanol có nồng độ khoảng 250 µg/ml.
+ Mẫu thử : Hòa tan cao Ba kích trong MeOH. Dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45µm.
b. Khảo sát và tìm điều kiện sắc kí * Cột sắc kí
Vì mẫu phân t ch là dược liệu có nhiều thành phần nên cần cần tách chất cần phân tích ra khỏi các thành phần khác trong mẫu nên việc lựa chọn cột rất quan
trọng. Một số loại cột C18-octadecylsilicagen, cột Phenol, cột Si, cột polymer,…. Trong quá trình khảo sát và thông qua một số tài liệu chúng tôi lựa chọn cột C18. Cột C18 là cột khá phổ biến hiện nay, dễ sử dụng trong s c ý pha đảo. Trong điều kiện nghiên cứu chúng tôi khảo sát cột C18 với 2 loại ch thước khác nhau:
- C18 (150 x 4,6mm) ch thước hạt 5µm - C18 (250 x 4,6mm) ch thước hạt 5µm
Chọn cột C18 (150 × 4,6mm) bởi thời gian pic ch nh ra tương đối nhanh (tR = 4,8 phút), thu được pic cân đối và tách hoàn toàn với những chất khác. Chọn ch thước hạt 5 µm để tăng hả năng tách chất.
* Pha động
- Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách s c kí, nó quyết định thời gian lưu giữ của các chất phân tích và hiệu quả của sự tách s c kí.
- Vì đối tượng nghiên cứu là dược liệu, có chứa rất nhiều hoạt chất khác nhau vì vậy để các chất tách ra khỏi nhau ta dùng chương trình gradient. Chương trình gradient có những ưu điểm: Giảm thời gian phân tích rõ rệt, độ phân giải chung của hỗn hợp tăng lên, pic trên s c đồ nhọn hơn, độ nhạy tăng lên.
* Tốc độ dòng
Lựa chọn tốc độ dòng để thời gian lưu hông quá lâu và hình ảnh p c cân đối (Hệ số bất đối xứng AF trong khoảng 0,8 – 1,2). Qua khảo sát lựa chọn tốc độ dòng 1ml/phút phù hợp với yêu cầu
* Thể tích tiêm mẫu
Khảo sát thể tích tiêm 20µl và 50µl, nhận thấy với thể tích tiêm 50µl phù hợp để phân tích. 2.2.5. Thẩm định phƣơng pháp HP C - T nh đặc hiệu. - Độ thích hợp hệ thống. - Độ tuyến tính. - Độ lặp lại. - Độ đúng.
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Các số liệu thống ê được xử l bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. - Kết quả th nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (µ = X ± SD). - Tính RSD bằng phương pháp thống kê Giá trị trung bình: ̅ ∑ Độ lệch chuẩn: √∑ ̅ Độ lệch tương đối: ̅
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM ẾT QUẢ V N UẬN 3.1. ẾT QUẢ THỰC NGHIỆM V NHẬN XÉT
3.1.1. ào chế cao đặc và xác định hiệu suất
* Bào chế cao đặc:
Sơ đồ bào chế:
Cân 100g dược liệu Ba kích tươi, thái lát trong bình nón 500 ml, thêm 300 ml dung môi. Đậy n, để yên 1 giờ. Sau đ đun sôi với nhiệt độ sôi của dung môi nước trong bình cách thủy là 800
C dưới hồi lưu trong 1 giờ, rút dịch chiết và bổ sung vào dược liệu 200ml dung môi mới. Tiếp tục đun sôi dưới hồi lưu trong 1giờ. Rút dịch chiết và bổ sung 200ml dung môi mới. Tập hợp dịch chiết ở 3 lần, để nguội, lọc qua phễu lọc vào bình chứa. Cô đến dạng cao lỏng 1:1. Cô dịch lọc thu
Dược liệu Ba kích (100g) và dung môi (300ml)
Đun hồi lưu 3 giờ (sau mỗi giờ rút dịch chiết bã bổ sung 200ml dung môi mới)
Tập hợp dịch chiết
Lọc trong
Cô đến thể chất cao đặc
được trên cách thủy cho đến hi cao c độ ẩm dưới 20%.
* Mất khối lượng do làm khô
Tiến hành xác định mất khối lượng do làm khô của cao theo hướng dẫn trong mục 9.6, phụ lục 9 của DĐVN IV.
- Mẫu nghiên cứu: dược liệu và mẫu cao đặc.
* Xác định hiệu suất:
- Xác định hàm lượng nước c trong dược liệu trước hi đem đi chiết xuất để xác định hối lượng dược liệu thực.
- Dựa trên độ ẩm của cao đặc, t nh hiệu suất bào chế cao đặc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hiệu suất bào chế cao đặc.
Số mẫu (n) dƣợc liệu (g) H dƣợc liệu (%) KL cao (g) HA cao X (%) Hiệu suất H (%) 1 100,28 29,75 21,14 14,87 25,55 2 100,55 29,75 19,10 12,49 23,66 3 100,25 29,75 22,59 14,38 27,46 Tổng 301,08 62,83 SD X 13,91 ± 1,26 SD H 25,56 ± 1,90 Nhận xét:
- Cao: thể chất mềm dẻo, đặc quánh, mịn, đồng nhất. Màu nâu đen. Mùi thơm. Vị đ ng, hơi ngọt.
- Từ 301,08g dược liệu thu được 62,83g cao đặc. - Hiệu suất bào chế cao đặc đạt 25,56 ± 1,90
3.1.2. Định tính một số nhóm chất bằng phản ứng hóa học
Tiến hành phản ứng theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.2. Kết quả định tính hoá học được t m t t ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Định tính các nhóm chất trong vị thuốc và cao đặc
STT Nh m chất Phản ứng định tính Mẫu nghiên cứu Bột Ba ch Cao Ba kích
1 Iridoid TT Trim Hill + ++
2 Anthranoid Pư Borntraeger ++ ++
3 Saponin Pư tạo bọt + +
4 Đường hử TT Fehling + +
5 Acid hữu cơ Pư với Na2CO3 + +
6 Alcaloid TT Mayer - -
TT Dragendorff - -
TT Bouchardat - -
Ghi chú : (-): Phản ứng âm tính. (+): Phản ứng dương t nh . (++): Phản ứng dương t nh rõ.
* Nhận xét: Ba kích có chứa iridoid, anthranoid, saponin, acid hữu cơ, đường khử.
Không có alcaloid.
3.1.3. Xây dựng phƣơng pháp định tính định lƣợng Monotropein bằng HPLC.
3.1.3.1. Quy trình chạy sắc kí
* Lựa chọn điều kiện sắc ký.
Chương trình s c ký mà chúng tôi lựa chọn có các thông số sau: - Cột: C18 (150 × 4,6mm; 5 µm)
- Detector: DAD 231nm - Nhiệt độ cột: 250C - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Thể tích tiêm: 50µl
- Pha động: Dung môi A: MeOH : KH2PO4 0,4% (5:95) Dung môi B: MeOH : KH2PO4 0,4% (28,8:71,2)
Bảng 3.3. Chương trình chạy dung môi pha động.
Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)
0 100% 0
20 0 100%
Với điều kiện s c như trên, Monotropein được tách hoàn toàn, hình ảnh pic cân đối, thời gian lưu nhanh (tR = 4,868 phút)
* Chuẩn bị mẫu.
- Mẫu trắng: dung dịch MeOH.
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5mg Monotropein chuẩn vào bình
định mức 20ml, thêm 10ml dung dịch MeOH, l c ĩ, thêm MeOH vừa đủ tới vạch. Hút 2,0ml dung dịch trên vào bình định mức 20ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, l c đều.
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g cao đặc vào bình định mức 50ml.
Thêm 30ml MeOH, siêu âm trong 30 phút, để nguội rồi thêm MeOH vừa đủ tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
3.1.3.2. Thẩm định phƣơng pháp HP C a) Tính đặc hiệu.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn của phần thử độ lặp lại.
- Chuẩn bị mẫu thử: Sử dụng dung dịch thử của phần thử độ lặp lại.
- Chuẩn bị mẫu trắng: Dung môi pha mẫu (MeOH)
Chạy s c ý đồ của mẫu tr ng, mẫu chuẩn và mẫu thử theo điều kiện như trên, ghi lại diện tích pic và thời gian lưu.
Hình 3.1.Sắc k ý đồ của Monotropein. (A): Mẫu chuẩn; (B): Mẫu trắng; (C): Mẫu thử. * Nhận xét:
- Trên s c ý đồ mẫu tr ng, không cho pic nào có thời gian lưu tương ứng với (A)
(C) (B)
thời gian lưu của Monotropein chuẩn ở phút 4,8 phút trên s c ký đồ mẫu chuẩn. - Trên s c ý đồ mẫu thử cho một pic c tương ứng về hình dạng và thời gian lưu 4,879 phút tương ứng với thời gian lưu của Monotropein trên s c ý đồ mẫu chuẩn. Pic Monotropein trong mẫu thử cân xứng, tách hoàn toàn và không bị lẫn với pic khác. Như vậy phương pháp c t nh đặc hiệu đối với phân tích Monotropein.
b) Độ thích hợp hệ thống.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: là mẫu chuẩn trong phần độ lặp lại.
- Tiêm vào hệ thống s c ký 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại s c ý đồ, xác định các giá trị về thời gian lưu, diện t ch pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
* Kết quả: Độ thích hợp của hệ thống được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4.Độ thích hợp của hệ thống.
STT Thời gian lƣu của Monotropein (phút) Diện tích pic Monotropein (mAU*S) 1 4,873 1598,3 2 4,863 1590,4 3 4,895 1586,7 4 4,859 1600,6 5 4,827 1594,7 6 4,891 1580,4 Trung bình 4,868 1591,85 RSD (%) 0,51 0,48
Nhận xét: Từ kết quả cho thấy, RSD của thời gian lưu và diện t ch pic đều
nhỏ hơn 2%. Như vậy, phương pháp c độ thích hợp hệ thống tốt với Monotropein.
- Chuẩn bị các mẫu chuẩn: Pha loãng trong dung dịch MeOH từ dung dịch chuẩn gốc ở phần độ lặp lại để được các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1,26 - 50,4 (µg/ml)
mmẫuchuẩn cân thực tế = 5,04mg được dung dịch chuẩn có nồng độ 25,2µg/ml.
* Kết quả: Khảo sát sự tương quan giữa y (diện tích pic) và x (nồng độ) bằng phương trình hồi quy tuyến tính. (Bảng 3.5, hình 3.2)
Bảng 3.5.Độ tuyến tính của Monotropein.
dd1 dd2 dd3 dd4 (chuẩn) dd5 dd6 Mẫu chuẩn (ml) 0,1 0,5 1 3 4 Bình định mức (ml) 20 20 20 20 20 Nồng độ (µg/ml) 1,26 6,3 12,6 25,2 37,8 50,4 Diện tích pic (mAU*S) 70,5 386,7 803,8 1598,13 2356,2 3159,9 Phương trình hồi quy: y = 62,706x + 0,0385
Hệ số tương quan R2= 0,9999.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của
Monotropein
* Nhận xét: Hệ số tương quan rất gần 1 (R2>0,9999), chứng tỏ có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất khảo sát trong khoảng nồng độ khảo sát 1,26µg/ml-50,4µg/ml. y = 62,706x + 0,0385 R² = 0,9999 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 10 20 30 40 50 60 D iệ n tí c h p e a k Nồng độ (µg/ml)
d) Độ đúng.
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn vào thử: thêm 10%, 30%, 50% chuẩn monotropein so với hàm lượng mẫu thử vào mẫu thử.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn: Cân 5,2mg vào bình định mức
20ml, hòa tan và pha loãng vừa đủ với MeOH. Hút chính xác 10ml dung dịch này hòa loãng vừa đủ trong 100ml MeOH.
- Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1g cao đặc vào bình định mức 50ml. Hút chính xác 2ml, 6ml và 10ml dung dịch chuẩn vào bình định mức chứa mẫu thử này. Siêu âm 30 phút, làm đầy vừa đủ bằng MeOH.
Tiến hành trên 9 mẫu, mỗi mức nồng độ làm 3 mẫu thử.
* Kết quả: Bảng 3.6. Độ đúng STT Tỉ lệ thêm chuẩn (%) Thể tích chuẩn thêm vào (ml) ƣợng chuẩn thêm vào Diện tích mẫu thử (mAU*S) ƣợng Monotropein tìm lại X % phục hồi 1 10% 2 0.0520 882.1 0.0520 100.0 2 10% 2 0.0520 880.7 0.0509 97.8 3 10% 2 0.0520 881.7 0.0517 99.4 4 30% 6 0.1560 1009.3 0.1559 99.9 5 30% 6 0.1560 1005.8 0.1530 98.1 6 30% 6 0.1560 1012.8 0.1587 101.8 7 50% 10 0.2600 1135.3 0.2588 99.5 8 50% 10 0.2600 1142.1 0.2643 101.7 9 50% 10 0.2600 1134.9 0.2584 99.4 Trung bình 99.7 RSD (%) 1.36
* Nhận xét: Giá trị trung bình nằm trong khoảng từ 97,0%-103,0%, và RSD < 3%.
Phương pháp c hả năng thu hồi tốt.
e) Độ lặp lại.
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5mg Monotropein chuẩn vào bình