Phytase từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) phân lập từ rừng Nam Cát Tiên được nuôi cấy trong môi trưởng YPD cải tiến cho hoạt độ phytase là 2,720 UI/ml và nhiệt độ và pH tối ưu cho phytase thu nhận là 40oC, pH 4,0. Tác nhân tủa thích hợp cho phytase là ethanol 96%, với hoạt tính riêng đạt được là 312,924 UI/mg protein. Các ion Ca2+ nồng độ 1 mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase và Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase ở nồng độ 5 mmol/ml. Hoạt độ riêng của phytase là 187,942 đối với peak 1 và 286,388 đối với peak 2. Hoạt độ riêng của tổng 2 peak tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc ký. Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% và hiệu suất hoạt độ đạt 90,75%. Hằng số Michaelis (Km) của phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km= 0,0313. Điều này cho thấy ái lực cao giữa phytase với cơ chất sodium phytate. Trọng lượng phân tử phytase của sporobolomyces japonicus là 36,90 KDa.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PHYTASE NGOẠI BÀO TỪ NẤM MEN Sporobolomyces japonicus (L9) Hồng Quốc Khánh1*, Ngơ Đức Duy1, Đào Thị Thu Hiền1, Trịnh Phong Vân2 (1) Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (*)hoangqk@gmail.com (2) Đại học Kinh tế Kỹ thuật Bình Dương TĨM TẮT: Phytase từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) phân lập từ rừng Nam Cát Tiên nuôi cấy môi trưởng YPD cải tiến cho hoạt độ phytase 2,720 UI/ml nhiệt độ pH tối ưu cho phytase thu nhận 40oC, pH 4,0 Tác nhân tủa thích hợp cho phytase ethanol 96%, với hoạt tính riêng đạt 312,924 UI/mg protein Các ion Ca2+ nồng độ mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase nồng độ mmol/ml Hoạt độ riêng phytase 187,942 peak 286,388 peak Hoạt độ riêng tổng peak tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc ký Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% hiệu suất hoạt độ đạt 90,75% Hằng số Michaelis (Km) phytase chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km = 0,0313 Điều cho thấy lực cao phytase với chất sodium phytate Trọng lượng phân tử phytase sporobolomyces japonicus 36,90 KDa Từ khóa: Sporobomyces japonicus, phytase, hoạt độ riêng, Ca2+, Mn2+, Km MỞ ĐẦU Phytase enzyme acid phosphohyrolase, xúc tác thủy phân acid phytic thành phosphate vô dẫn xuất myoinositol phosphate Phytase tìm thấy vi sinh vật nấm mốc, vi khuẩn, mấn men Phytase ý ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt việc giảm nhiễm photpho vùng chăn nuôi tập trung [2] Sự thủy phân acid phytic phytase không sinh độc tố, vậy, khai thác phytase cơng nghiệp thân thiện với môi trường hỗ trợ phát triển công nghệ Hiện nay, phytase quan tâm nghiên cứu nhiều, đặc biệt phytase từ nấm mốc nấm mốc có khả sản xuất phytase có hoạt tính cao [5] Phytase vi khuẩn nấm men quan tâm nghiên cứu ứng dụng [4] Nghiên cứu sản xuất phytase từ nấm men hướng quan trọng so với nấm mốc nấm men đảm bảo an toàn nhiều ứng dựng chế biến thực phẩm cho người gia súc, nấm men không sinh độc tốc Ngồi ra, cơng nghệ sản xuất phytase từ nấm men đơn giản so với nấm mốc Trong khuôn khổ hợp tác với BIOTEC (Thái Lan), sưu tập số chủng nấm men vườn quốc gia Cát Tiên (số liệu chưa xuất bản) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu, hóa chất môi trường Chủng nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên, sưu tập Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Dung dịch đệm thuốc khử: Đệm acetate 0,2 M, pH 5,5; đệm glycine-HCl 0,2 M, pH 2,0, 2,5, 3,0 3,5; đệm Tris-HCl 0,2 M, pH 7,0, 7,5 8,0 [3] Coomassive Brilliant blue, Thuốc thử Bradford (Bio-Rad) Môi trường: Yeast Malt (YM) Yeast Malt Agar (YMA); môi trường YM bổ sung 20% Glycerol; môi trường chọn lọc nấm men sinh tổng hợp phytase: môi trường Schopfer; môi trường lên men sinh tổng hợp phytase: môi trường bột bắp; môi trường Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) với 0,5% Na-phytate Phương pháp Thí nghiệm ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme thực sau: phản ứng enzyme chất tiến hành khoảng pH 2,0 đến 7,5 nhiệt độ 37oC thời gian 15 phút Các loại đệm thực thí nghiệm có nồng độ 200 mM bao gồm HCl (pH 2,0-3,5), acetate (pH 4,0-6,5) Tris-HCl (pH 7,0-7,5) Thí nghiệm ảnh hưởng nhiện đô thực dãy nhiệt từ 30oC đến 80oC thời gian 15 phút Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính 91 Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van phytase ủ có mặt ion kim loại Ca2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ chất ức chế EDTA với nồng độ mM/ml mM/ml 37o C 15 phút để xác định hoạt tính lại phytase Xác định mật độ tế bào phương pháp đo độ đục buồng đếm hồng cầu; xác định hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp Murphy Riley [3]; xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradfrod [1]; tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel (Biogel P-100) mô tả Bio-Rab; xác định trọng lượng phân tử phytase phương pháp chạy điện di SDS-PAGE [1] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc sơ chủng nấm men sinh tổng hợp phytase Từ sưu tập nấm men thu thập từ rừng Nam Cát Tiên, sàng lọc từ 37 chủng nấm men xác định chủng nấm men có khả sinh tổng hợp phytase Dựa vào kết nghiên cứu sơ bộ, chọn chủng nấm men (định danh dựa vào vùng gen 26S rDNA thuộc vùng D1/D2) Sporobolomyces japonicus (L9), Sporobolomyces carnicolor (L62) Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K-490 (L40), có khả sinh tổng hợp phytase cao môi trường bột bắp 1,63 UI/mol YPD cải tiến có bổ sung 0,5% natri phytate làm nguồn chất cảm ứng Chúng nhận thấy, chủng L9 cho hoạt độ cao 1,46 UI/ml, nên chúng tơi chọn chủng L9 q trình thu nhận enzyme thuận lợi môi trường bột bắp định danh chủng Sporobolomyces japonicus với accession number AY07009.1 Khảo sát thời gian ni lên men thích hợp cho sinh tổng hợp phytase chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy từ chủng nấm men L9 môi trường YPD 0,5% sodium phytate thu nhân mẫu sau 24 thời gian lên men 10 ngày Kết thu theo hình cho thấy, phytase tổng hợp giai đoạn sớm trình lên men đạt hàm lượng cao ngày thứ (1,49 UI/ml) Hoạt tính enzyme bắt đầu giảm nhẹ ngày thứ 6, 7, giảm mạnh ngày lên men thứ 10 Sự tăng giảm hoạt tính phytase tương ứng với thay đổi mật độ tế bào theo thời gian lên men Hình Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính phytase chủng Sporobolomyces japonicus (L9) 92 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 Hình Ảnh hưởng tỉ lệ giống bổ sung ban đầu đến trình sản xuất phytase Khảo sát tỉ lệ bổ sung giống thích hợp cho sản xuất phytase Chủng Sporobolomyces japonicus (L9 ) hoạt hóa mơi trường Schopfer sau 48 giờ, bổ sung tỉ lệ giống (v/v) 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 6% (mật độ tế bào 6.108 CFU/ml) vào môi trường YPD bổ sung 0,5% sodium phytate Sau ngày lên men, hoạt tính phytase mật độ tế bào dịch lên men xác định kết hình 2, với tỉ lệ giống từ 3% đến 6% có hoạt tính phytase tương đối cao hàm lương phytase 4% cao (2,72 UI/ml) Kết cho thấy, tỷ lệ giống bổ sung ban đầu 4% thích hợp cho q trình sinh tổng hợp phytase Khảo sát tác nhân tủa thích hợp để thu nhận phytase Sau lên men sản xuất phytase điều kiện thích hợp, việc thu nhận tinh enzyme phytase khâu quan trọng việc khảo sát tác nhân tủa nồng độ khác lên hoạt tính enzyme phytase, sử dụng tác nhân tủa ethanol 96%, acetone ammonium sulfate kết trình bày bảng Bảng Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật Chủng khảo sát L9 L40 L62 Hàm lượng protein mg /ml 0,049 0,026 0,031 HĐ chung UI/ml 1,455 0,451 0,347 Bảng So sánh hoạt độ phytase theo tác nhân tủa Tác nhân tủa Lượng tủa (g) Cồn 1,1043 Acetone 1,1156 Muối amôn 1,1337 CPE - Chế phẩm enzyme Hàm lượng protein mg /g 0,205 0,457 0,363 Như vậy, dựa vào kết hoạt tính riêng ethanol 96% với tỉ lệ chọn tác nhân tủa thích hợp nhằm thu nhận phytase chủng Sporobolomyces japonicus (L9) HĐ chung UI/gCPE 63,885 48,418 78,447 HĐ riêng UI/mg protein 311,365 106,006 215,932 Khảo sát sinh lý sinh hóa phytase sinh tổng hợp chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Ảnh hưởng pH lên hoạt tính phytase 93 Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van Hình Ảnh hưởng pH lên hoạt tính phytase Kết ảnh hưởng pH lên hoạt tính phytase thể hình Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính phytase Biên độ pH giao động khoảng pH 4,06,5 cho hoạt tính phytase tốt, cao pH = 4,0 (74,104 UI/g), nhiên dãy pH 2,0-3,5 hoạt tính phytase tương đối yếu Kết theo dõi ảnh hưởng nhiệt độ cho thấy, phytase đạt hoạt tính cao nhiệt 40oC, nhiệt độ 70oC hoạt độ phytase giảm mạnh (hình 4) Hinh Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính phytase 94 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 60 50 40 30 20 10 UI/gCPE Hoạt độ chung phytase UI/gCPE 70 2+ Ca 2+ Cu Fe 2+ Fe 3+ Mg 2+ 2+ Mn 2+ Zn EDTA Các ion kim loại chất ức chế EDTA với nồng độ mmol/ml Hình Biến thiên hoạt độ phytase tác động ion kim loại nồng độ mmol/ml Ảnh hưởng ion kim loại lên ổn định phytase Kết ảnh hưởng ion kim loại lên ổn định phytase trình bày hình Khi cho phytase tương tác với ion kim loại nồng độ mM mM chứng tỏ nhận thấy, có tương tác khác nhau, nồng độ mM kìm hãm khả hoạt động enzyme mạnh so với nồng độ mM Khi nồng độ mM, kìm hãm hoạt tính phytase ion Fe3+ (hoạt tính lại 87,6%) so với ion khác Trong đó, hai nồng độ ion Ca2+ kìm hãm hoạt động phytase ion lại tương tự Tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel Tinh enzyme phytase phương pháp sắc ký lọc gel sau tủa hòa tan đệm acetate pH 4,0 Kết sau chạy sắc ký cho thấy đỉnh theo hình 6, đó, đỉnh phân đoạn 7-14 ml đỉnh từ 1827 ml sau thu nhận đem xác định hàm lượng protein với hoạt tính phytase cho kết hiệu suất thu hồi hoạt độ hiệu suất thu hồi protein theo bảng Hình Sắc ký đồ phytase Sporobolomyces japonicus 95 Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van Hình Kết điện di đồ enzyme phytase sau tủa ethanol Giếng Phytase thương mại; giếng 2, Phytase sau tủa cồn; Giếng Thang protein chuẩn Kiểm tra độ tinh phytase sau sắc ký xác định trọng lượng phân tử phytase Phương pháp SDS-PAGE tiến hành để kiểm tra độ tinh enzyme phytase sau sắc ký đồng thời xác định trọng lượng phân tử phytase sinh tổng hợp từ chủng Sporobolomyces japonicus (L9) kết hình Enzyme phytase thu hồi sau sắc ký cho phản ứng với chất natri phytate nồng độ 0,05, 010, 0,15, 0,20 25 mM khoảng thời gian 10, 15, 30, 45 60 phút Với nồng độ 0,05 mM, thời gian phản ứng 10 phút, lại nồng độ chất 0,10, 0,15, 0,20 0,25 mM vận tốc phản ứng tối đa Vmax phytase 15 phút Xác định số Km phản ứng enzyme-cơ chất natri phytate Tính vận tốc phản ứng (V) theo nồng độ chất [S] Bảng So sánh hoạt tính phytase, hàm lượng protein trước sau sắc ký hiệu suất thu hồi Mẫu Mẩu trước sắc ký Đỉnh Đỉnh Tổng đỉnh Hiệu suất thu hồi protein (%) Hiệu suất thu hổi hoạt tính (%) 96 Hàm lượng protein (mg/ml) 0,465 0,181 0,261 0,442 95,05 Hoạt tính tổng (UI/ml) 118,91 33,958 74,845 108,803 90,75 Hoạt tính riêng (UI/mg protein) 258,048 187,942 286,388 474,330 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 Xác định số Km vận tốc phản ứng xúc tác tối đa Vmax thông qua phương trình Xác định số Km vận tốc phản ứng xúc tác tối đa (Vmax) thông qua phương trình Line Weak Buk Sử dụng phần mềm Sigma plot để vẽ đồ thị tính tốn Km, Vmax, kết theo bảng Lineweaver-Burk Khi tăng [S] vận tốc phản ứng tăng, nhiên, sau thời nồng độ chất bão hòa giảm dần Nhận thấy vận tốc phản ứng tăng tăng nồng độ chất [S] từ 0,05 mM đến 0,20 mM, vận tốc bắt đầu giảm dần tăng nồng độ chất từ 0,20 mM đến 0,25 mM 0,04 0,03 -1/Vmax 0,02 1/Rate (µmol/min/ml) 0,01 -1/Km -40 -30 -20 Vmax = 35 -10 10 20 30 1/[Substrate] (mM) Km = 0,03128 Hình Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk xác định số Km phytase Đồ thị hình cho thấy, số Km phytase nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) 0,03128 mM Hằng số Km cho biết lực enzyme chất, mạnh hay yếu chủng nấm men nghiên cứu hoạt tính phytase nó, vậy, so sánh Km chủng Sporobolomyces japonicus (L9) với số Km số nấm men nghiên cứu trước [6] Kết qua cho thấy, số Km chủng Sporobolomyces japonicas 0,031 mM, điều cho thấy, lực phytase chất sodium phytate cao japonicus (L9 ) mơi trường lỏng YPD cải tiến (có bổ sung 0,5% sodium phytate) thời gian ngày với tỉ lệ bổ sung 4% giống cho hoạt độ phytase 2,720 UI/ml nhiệt độ pH tối ưu cho phytase thu nhận 40oC, pH 4,0 Tác nhân tủa thích hợp cho phytase ethanol 96%, với tỉ lệ dung môi/dung dịch phytase 1: 2, thời gian tủa thích hợp Hoạt tính riêng đạt 312,924 UI/mg protein KẾT LUẬN Các ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt độ phytase Ca2+ nồng độ mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase nồng độ mmol/ml Điều kiện ni cấy thích hợp cho trình sản xuất phytase chủng Sporobolomyces Hoạt độ riêng phytase 187,94 đỉnh 286,39 đỉnh Hoạt độ riêng 97 Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van tổng đỉnh tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc ký Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% hiệu suất hoạt độ đạt 90,75% Hằng số Michaelis (Km) phytase chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km 0,0313 mM cho thấy lực cao phytase với chất sodium phyate Trọng lượng phân tử phytase Sporobolomyces japonicus (L9) 36,9 KDa TÀI LIỆU THAM KHẢO Bollag D M., Rozyck M D., Edelstein S J., 1991 Protein methods, Willey Liss, New York, 415 pages Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., Lohscheidt M., Zelder O., 2005 Biotechnological production and application of phytase, Applied Microbiology and Biotechnology, 68: 588-597 Kim T W., Lei X G., 2005 An improving method for a rapid determination of phytase activity in animal feed, J Anim Sci., 83: 1062-1067 Lei X G., Porres J M., 2003 Phytase enzymology, application, and biotechnology, Biotechnology letters, 25: 1787-1794 Oh B C., Choi W C., Kim Y O., Oh T K., 2004 Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytase, Applied Microbiology and Biotechnology, 63: 62-372 Parvinder Kaur, G Kunze, T Satyanarayana, 2007 Yeast Phytase: present scenario and future perspectives, Critical Reviews in Biotechnology, 27: 93-109 ISOLATION AND PURIFICATION EXTRACELLULAR PHYTASE FROM Sporobolomyces japonicus (L9) Hoang Quoc Khanh1*, Ngo Duc Duy1, Dao Thi Thu Hien1 , Trinh Phong Van2 (1) Institute of Tropical Biologty, VAST (2) Binh Duong University of Economics and Technology SUMMARY Phytase of the yeast Sporobolomyces japonicus (L9), isolated from Cat Tien National Forest, was cultivated in modified YPD medium with activity of 2.720 UI/ml and optimal temperature and pH of 400C and 4.0 A suitable precipitation agent is ethanol 96% with specific activity of 312.924 UI/mg protein Ca2+ ion with 1mmol/ml reduced enzyme activity to 97% and Mn2+ with mmol/mlreduced enzyme activity to 98% Specific activity for peak was 187.942 UI/mg protein and for peak 2-286.388 UI/mg protein Total specific activity increased 1.8 times before chromatography work Recovery efficiency of protein was 95.05% and recovery activity - 90.75% The Michaelis-Menten constant (Km) was 0.0313 µM The purified phytase had a molecular weight of 36.90 kDa Keywords: Sporobomyces japonicus, phytase, specific activity, Ca2+, Mn2+, Km Ngày nhận bài: 21-6-2012 98 ... phytase phương pháp chạy điện di SDS-PAGE [1] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc sơ chủng nấm men sinh tổng hợp phytase Từ sưu tập nấm men thu thập từ rừng Nam Cát Tiên, sàng lọc từ 37 chủng nấm men. .. định chủng nấm men có khả sinh tổng hợp phytase Dựa vào kết nghiên cứu sơ bộ, chọn chủng nấm men (định danh dựa vào vùng gen 26S rDNA thu c vùng D1/D2) Sporobolomyces japonicus (L9), Sporobolomyces. .. số Km phytase Đồ thị hình cho thấy, số Km phytase nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) 0,03128 mM Hằng số Km cho biết lực enzyme chất, mạnh hay yếu chủng nấm men nghiên cứu hoạt tính phytase