Thu nhận và nuôi cấy tế bào sinh dưỡng của bò rừng Bos Javanicus (Wagrer, 1844) nhằm bảo tồn nguồn gien cấp độ tế bào

Bài viết thu nhận và nuôi cấy tế bào sinh dưỡng của bò rừng Bos Javanicus (Wagrer, 1844) nhằm bảo tồn nguồn gien cấp độ tế bào và làm nguyên liệu để tạo dòng vô tính về sau này. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.

30(2): 88-91 6-2008 Tạp chí Sinh học Thu nhận nuôi cấy tế bào sinh dỡng bò rừng Bos javanicus (Wagrer, 1844) nhằm bảo tồn nguồn gien cấp độ tế bào Hoàng Nghĩa Sơn, Trần Cẩm Tú Viện Sinh học nhiệt đới Lê Văn Ty Viện Công nghệ sinh häc Bß rõng Bos javanicus (Wagrer, 1844) thuéc hä Bovidae, loại thú cỡ lớn, có trọng lợng thể 600 - 800 kg Bò rừng thích sống vùng rừng tha thoáng mát, rừng khộp nh÷ng khu rõng rËm cã thung lòng cã nhiỊu cá Việt Nam, trớc bò rừng có nhiều tỉnh Đồng Nai (Biên Hoà, La Ngà), Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận (Phan Rí - Phan Thiết), Lâm Đồng, Đắc Lắc Đây loài thú quý rừng nhiệt đới, thờng bị săn bắn nhiều nơi nên đứng trớc nguy tuyệt chủng Trong Sách Đỏ Việt Nam (2000), bò rừng đợc xếp cÊp ®é V (SÏ nguy cÊp) [1]; Danh lơc §á cđa IUCN (2004), bß rõng ë møc EN (Nguy cấp) [2]; Nghị Định 48/2002/NĐ-CP Chính phủ, bò rừng đợc xếp phụ lục IB [3] Do vậy, vấn để bảo tồn nguồn gien nhiệm vụ chiến lợc công nghệ sinh học Việt Nam Trên sở tế bào sinh dỡng loài bò rừng có khả phát triển môi trờng DMEM đợc bổ sung huyết thanh, đồng thời dựa vào điều kiện sẵn có phòng thí nghiệm, tiến hành thu nhận nuôi cấy tế bào sinh dỡng bò rừng nhằm bảo tồn nguồn gien cấp độ tế bào làm nguyên liệu để tạo dòng vô tính sau Kết thu đợc tế bào sinh dỡng bò rừng phát triển tốt môi trờng DMEM đợc bổ sung 10% huyết bào thai bê thu đợc số lợng lớn tế bào fibroblast bò rừng I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Hóa chất Dung dịch PBS(-); cồn 70o (China); môi trờng 88 DMEM (Gibco); FBS(Gibco); trypsin (Sigma); EDTA (Merk); polyvinyl alcohol (China); Lglutamine (Sigma); D-glucose (Sigma) Vật liệu Mẫu mô tai bò rừng đợc thu nhận sở nuôi thú hoang dã khu vực Tuyền Lâm, thành phố Đà Lạt Phơng pháp Nghiên cứu thực nghiệm đợc tiến hành Viện Sinh học nhiệt đới Trờng Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh a Phơng pháp thu nhận xử lý mẫu Mẫu tai bò rừng sau đợc thu nhận, đợc rửa môi trờng PBS(-); nửa cho vào týp đông lạnh chứa ml PBS 10% DMSO để đông lạnh Nửa lại cho vào effendorf chuyển phòng Thí nghiệm tế bào động vật, Viện Sinh học nhiệt đới Mẫu tai bò rừng đợc xử lý qua bớc sau: effendorf chứa mẫu đợc xịt cồn 70o đa vào tủ vô trùng Mẫu đợc rửa qua dung dịch PBS(-) lần, tiến hành cạo lông Sau đó, ngâm mẫu vào cồn vòng 10 giây rửa lại lần dung dịch PBS(-) b Phơng pháp nuôi sơ cấp mẫu mô Tiến hành cắt nhỏ mẫu mô thành mảnh có kích thớc 0,5 ì 0,5 mm Sau đó, gắp mảnh mô vào đĩa nhựa giếng Mỗi giếng từ đến mảnh mô Chờ từ 20 đến 30 phút để mẫu mô cố định mặt đĩa Sau mẫu cố định, bổ sung 400 àl môi trờng DMEM 10% FBS chuyển vào tủ ấm 37 - 38oC; 5% CO2 để nuôi cấy Sau 24 giờ, kiểm tra ghi nhận hình ảnh Hình Sau ngày nuôi sơ cấp Hình Sau 10 ngày nuôi Hình Tế bào sau 10 ngày nuôi (X20) Hình Tế bào sau 10 ngày nuôi (X10) Hình Sau tách trypsin/edta 0,25% Hình Tế bào sau 24 đợc cấy chuyền lần Hình Tế bào sau 48 cấy chuyền lần Hình Tế bào sau 48 đợc cấy chuyền lần (X20) Hình Tế bào sau 48 đợc cấy chuyền lần (X10) 89 c Phơng pháp cấy chuyền Mẫu mô đợc nuôi sau ngày, gắp bỏ mảnh mô bổ sung môi trờng Quan sát phát triển nguyên bào sợi, thấy tế bào lan hết mặt đĩa tiến hành cấy chuyền Hút bỏ hết môi trờng cũ ra, bổ sung vào 200 àl trypsin/EDTA 0,25%; lắc nhẹ đĩa để tế bào tách khỏi mặt đĩa; quan sát dới kính hiển vi, thấy tế bào bung hết bổ sung thêm 200 àl môi trờng DMEM 10% FBS để bất hoạt trypsin Hút 200 àl huyền phù tế bào vào đĩa giếng bổ sung thêm 200 àl môi trờng DMEM 10% FBS Tiếp tục nuôi tủ ấm 5% CO2 Sau 24 giờ, kiểm tra ghi nhận hình ảnh II KếT QUả Và THảO LUậN Điều chứng tỏ, sau đợc nuôi cấy môi trờng DMEM 10% FBS cấy chuyền nhiều lần, tế bào thu đợc nguyên bào sợi Mục tiêu đặt nuôi cấy thành công nguyên bào sợi từ mẫu tai bò rừng Trong quần thể tế bào thu đợc sau cấy chuyển lần: - Chủ yếu nguyên bào sợi điển hình: có hình thoi, hình - Có sinh sản với phân bào điển hình Nh vậy, quẩn thể nguyên bào sợi thu đợc chứng tỏ nuôi cấy thành công tế bào sinh dỡng bò rừng môi trờng DMEM 10% FBS để thu nhận số lợng lớn tế bào nhằm bảo tồn nguồn gien cấp độ tế bào, tạo nguyên liệu cho nghiên cứu sâu nh chuyển nhân, tạo dòng vô tính Kết nuôi cấy sơ cấp mẫu mô da tai bò rừng TàI LIệU THAM KHảO Khi đợc nuôi nguyên phát từ mảnh mô, nguyên bào sợi tăng sinh nhanh, di c khỏi mẫu mô ban đầu phát triển tốt sau gắp bỏ mảnh mô khỏi môi trờng nuôi cấy Có thể quan sát đợc nhiều tế bào phân chia đĩa nuôi với nhiều hình dạng khác nhau; sau ngµy, tÕ bµo mäc lan vµ sau 10 ngày, tế bào lan hết bề mặt đĩa giếng tiến hành cấy chuyền đĩa giếng Kết sau cấy chuyền lần Sau đợc cấy chuyền lần 1, tế bào tiếp tục phân chia phát triển mạnh môi trờng nuôi cấy Sau ngày, tế bào mọc lan hết bề mặt đĩa giếng đạt mật độ cấy chuyền qua đĩa Khi nuôi cấy in vitro, tế bào bám bề mặt đĩa đa phần có hình hình thoi, có nhân to hình cầu Tiếp tục cấy chuyền tế bào mọc lan 80% diện tích đĩa nuôi Kết sau cấy chuyền lần Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trờng, 2000: Sách Đỏ Việt Nam, phần I: động vật Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi IUCN, 2004: Red List of Threatened Species ChÝnh phđ n−íc CHXHCN ViƯt Nam, 2002: Nghị Định 48/2002/NĐ-CP sửa đổi, bổ sung danh mơc thùc vËt, ®éng vËt hoang d· qóy hiÕm ban hành kèm theo NĐ 18/HĐBT ngày 17/1/2002 Hội ®ång Bé tr−ëng Fresney I R., 1984: Culture of animal cells: A manual of basic technique Aln R Liss, Inc., New York Ngun Phan Xu©n Lý, 2006: Ln văn thạc sĩ Thiết lập quy trình nuôi nguyên bào sợi từ da quy đầu ngời Trờng Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh Lê Văn Ty cs., 2003: Tạp chí Công nghệ sinh học, 25(2): 1-6 Hà Nội Lê Văn Ty cs., 2003: Nhân nuôi, bảo quản đông lạnh tế bào, tạo phôi kỹ thuật cấy nhân nhằm bảo vệ đa dạng sinh học loài bò tót: 712-716 Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Sau cấy chuyền lần 2, nguyên bào sợi tiếp tục phân chia lan hết bề mặt đĩa nuôi sau ngày Hình dạng tế bào có hình thoi, có nhân to hình cầu 90 Collect and culture of bull somatic cell Bos javanicus (Wagrer, 1844) for gene conservation Hoang nghia son, le van ty Summary Vietnam is a tropical country which has plentiful animals and plants, especially wide animals Many animal species were listed in the Red Data Book of Vietnam (2000) However, many animal species were illegally hunted for aesthetic and economic purposes, for example bull According to some points of view, bull somatic cells had the ability to develop in the DMEM added serum; besides, in our lab conditions, we have collected and cultured bull somatic cells to gene conservation for the making of materials for cloning later Study results showed that bull somatic cells grew well in the DMEM medium added 10% FBS and we have collected a large number of typical firoblasts Ngµy nhËn bµi: 1-9-2007 91 ... sù sinh sản với phân bào điển hình Nh vậy, quẩn thể nguyên bào sợi thu đợc chứng tỏ nuôi cấy thành công tế bào sinh dỡng bò rừng môi trờng DMEM 10% FBS để thu nhận số lợng lớn tế bào nhằm bảo tồn. .. FBS cấy chuyền nhiều lần, tế bào thu đợc nguyên bào sợi Mục tiêu đặt nuôi cấy thành công nguyên bào sợi từ mẫu tai bò rừng Trong quần thể tế bào thu đợc sau cấy chuyển lần: - Chủ yếu nguyên bào. .. ngày nuôi sơ cấp Hình Sau 10 ngày nuôi Hình Tế bào sau 10 ngày nuôi (X20) Hình Tế bào sau 10 ngày nuôi (X10) Hình Sau tách trypsin/edta 0,25% Hình Tế bào sau 24 đợc cấy chuyền lần Hình Tế bào