Thu nhận tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell) người từ máu cuống rốn

Ở Việt Nam, nghiên cứu về máu cuống rốn còn khá mới mẻ, đặc biệt là MSC từ máu cuống rốn. Cho đến nay chưa thấy có báo cáo nào về thu nhận, nuôi cấy, ứng dụng MSC từ máu cuống rốn, có thể do quy trình phức tạp và môi trường nuôi cấy quá đắt. Hướng đến mục đích khai thác MSC từ máu cuống rốn nhằm ứng dụng trong nghiên cứu và y học, thực hiện nghiên cứu đề tài này.

Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 THU NHẬN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL) NGƯỜI TỪ MÁU CUỐNG RỐN Dương Thị Bạch Tuyết (i), Phạm Văn Phúc (ii) Trần Thanh Đây (iii) Mở đầu Hiện tế bào gốc trung mô (MSC) ứng dụng nhiều y học: cấy ghép tự thân, công nghệ mô… đem lại hiệu cấy ghép cao Nhưng nguồn cung cấp MSC gặp nhiều khó khăn, đặc biệt MSC thu nhận từ bào thai gây nhiều tranh cãi từ cộng đồng Máu cuống rốn – sản phẩm thường bỏ trình sinh sản, biết nguồn cung cấp tế bào gốc trung mơ lý tưởng có nhiều ưu điểm: khơng gây tranh cãi từ cộng đồng, nguồn cung cấp dồi dào, biểu kháng nguyên tương hợp mô MSC từ máu cuống rốn thấp, tiềm biệt hoá cao… Hiện nay, người ta thu nhận nuôi cấy MSC từ máu cuống rốn phương pháp li tâm máu cuống rốn dung dịch Phecoll, dùng hạt bead gắn kháng thể chuyên biệt vào MSC Nuôi cấy MSC mơi trường IMDM D’MEM có bổ sung hai nhân tố tăng trưởng bFGF, EGF Đây phương pháp đắt tiền Ở Việt Nam, nghiên cứu máu cuống rốn mẽ, đặc biệt MSC từ máu cuống rốn Cho đến chưa thấy có báo cáo thu nhận, ni cấy, ứng dụng MSC từ máu cuống rốn, quy trình phức tạp mơi trường ni cấy q đắt Hướng đến mục đích khai thác MSC từ máu cuống rốn nhằm ứng dụng nghiên cứu y học, thực nghiên cứu đề tài Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu  Máu cuống rốn thu nhận Bệnh viện Phụ sản Hùng Vương qua xét nghiệm âm tính với HIV, HBV số bệnh khác (i) Người hướng dẫn, TS, Khoa Sinh học, Trường ĐHSP Tp.HCM Người hướng dẫn, CN, Trường ĐHKHTN, ĐHQG Tp.HCM (iii) Sinh viên Khoa Sinh học, Trường ĐHSP Tp.HCM (ii) 173 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thanh Đây 2.2 Phương pháp 2.2.1 Thu nhận máu cuống rốn : thu nhận em bé vừa sinh 2.2.2 Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn Máu cuống rốn Hút máu vào syringe 10 ml Chuyển máu vào ống li tâm Cho ml dd li giải hồng cầu vào ống li tâm Ủ phút Lặp lại laàn Vortex phút Li tâm phút, 1000 vịng/ phút Đổ bỏ dịch Bổ sung ml môi trường nuôi cấy Vortex phút Chuyển huyền phù vào bình roux 25 cm2 Nuôi 37C, 5% CO2 Cấy chuyền Sơ đồ 2.1 Sơ đồ qui trình thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn 2.2.3 Nuôi cấy chọn lọc tế bào gốc từ quần thể tế bào đơn nhân Tiến hành 174 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 Để xác định môi trường phù hợp nhất, tốt điều kiện có thể, chúng tơi tiến hành thí nghiệm ni cấy chọn lọc sau: + Thí nghiệm : Nuôi cấy môi trường E’MEM 10%FBS, nuôi 37 C, 5%CO2 Chúng tiến hành thử nghiệm nuôi cấy với mơi trường môi trường nuôi cấy tế bào động vật + Thí nghiệm : Ni cấy môi trường D’MEM 10% FBS, nuôi 37 C, 5%CO2 Nếu nuôi cấy môi trường E’MEM thất bại, nghiên cứu nuôi cấy môi trường D’MEM 10% FBS + Thí nghiệm : Ni cấy mơi trường D’MEM/F12 10% FBS, nuôi 37 C, 5%CO2 D’MEM/F12 kết hợp theo tỉ lệ 1:1 môi trường D’MEM F12 Sato + Thí nghiệm : Nuôi cấy môi trường D’MEM/F12 10% FBS + SFM, nuôi 370C, 5%CO2 Môi trường D’MEM/F12 10% FBS + SFM kết hợp theo tỉ lệ 1:1 môi trường D’MEM/F12 10% FBS SFM + Thí nghiệm : Ni cấy mơi trường D’MEM/F12 10% FBS + CM, nuôi 37 0C, 5%CO2 Môi trường D’MEM/F12 10% FBS + CM kết hợp theo tỉ lệ 1:1 D’MEM/F12 10% FBS môi trường CM  Huyền phù tế bào đơn cho vào bình Roux 25 cm 2, đặt tủ ni 370C, 5% CO2  Đánh giá kết quả: theo dõi tồn tại, trạng thái bám dính, thay đổi hình dạng, tăng sinh phát triển tế bào môi trường để xác định môi trường tối ưu cho tế bào Phương pháp đánh giá trạng thái bám dính so sánh số lượng tế bào bám dính mơi trường  Trạng thái bám dính đánh giá khả cố định bề mặt bình Roux Khi di chuyển bình Roux tế bào bám khơng trơi theo dịng mơi trường lay động 175 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thanh Đây  Để so sánh số lượng tế bào bám dính môi trường khác nhau, tiến hành đếm số lượng tế bào/cụm tế bào bám dính vào bề mặt nuôi 10 thị trường khác (được chọn ngẫu nhiên) độ phóng đại 20X kính hiển vi đảo ngược Olympus Để tránh đếm lại lần thị trường, tiến hành đếm bắt đầu góc bình Roux sau di chuyển theo đường thẳng, đến góc bên kia, tiếp tục di chuyển xuống góc dưới, đếm cho đủ 10 thị trường (Có hình minh hoạ báo cáo chính) Kết sau đếm tính trung bình cộng Các môi trường khảo sát lần Khả bám dính tế bào mơi trường so sánh biểu thị bảng Phương pháp đánh giá khả phát triển tế bào sau bám Sau 24 giờ, tiến hành thay môi trường nuôi cấy sơ cấp, bình ni cấy cịn hầu hết tế bào bám tế bào hồng cầu sót lại Sau 24 -48 tiếp, thay môi trường lần Sau lần thay môi trường, tế bào bình ni cấy cịn tế bào bám Tế bào gọi phát triển sau bám tế bào có khả trải hình dạng giống tế bào fibroblast (khơng cịn hình cầu) (có hình minh hoạ báo cáo chính) Để đánh giá khả phát triển, tế bào có hình dạng giống fibroblast (tế bào gốc trung mơ) đếm 10 thị trường với phương pháp tương tự Số tế bào bám tính trung bình 10 lần đếm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Kết đánh giá mặt: số lượng tế bào trải thí nghiệm hiệu phát triển tế bào Hiệu phát triển = Số tế bào phát triển / Số tế bào bám dính 2.2.4 Ni cấy làm giàu tế bào gốc trung mô Phương pháp đánh giá khả tăng sinh Chúng xác định số lượng tế bào nuôi cấy sau ngày ngày, 10 ngày, 13 ngày, 16 ngày, 19 ngày, 21 ngày 24 ngày Để làm việc này, mẫu tế 176 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 bào nuôi sơ cấp sau 24 ngày cấy chuyền vào 14 giếng đĩa giếng Lần lượt sau 7, 10, 13, 16, 19, 21, 24 ngày, tiến hành tách lấy tế bào đếm buồng đếm hồng cầu Tế bào gốc trung mô sau nuôi cấy chọn lọc Bỏ môi trường cũ Rửa tế bào với ml PBSThêm vào bình Roux 2-3ml Trysin / EDTA 0,25% Đặt vào tủ ấm 37OC từ 2-3 phút Lắc nhẹ bình Roux Thêm vào bình Roux – 12 ml môi trường chọn lọc Chia dịch huyền phù tế bào cho bình Roux Nuôi tủ ấm 370C, 5% CO2 Hình 2.2 Sơ đồ qui trình cấy chuyền 2.2.5 Phương pháp xác định tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô nuôi cấy bám bề mặt ni cấy, có hình dạng giống hình dạng nguyên bào sợi Tuy vậy, hình dạng, tế bào gốc trung mơ có số điểm khác với ngun bào sợi Các tế bào gốc trung mơ có thân bầu nguyên bào sợi Trong đó, ngun bào sợi có hình dạng sợi dài (Có hình minh hoạ báo cáo chính) 177 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thanh Đây 2.2.6 Xử lí số liệu Các số liệu thu nhận xử lí Phần mềm Microsoft Excel Phần mềm xử lí thống kê Statraphic 7.0 Kết thảo luận 3.1 Thu nhận máu cuống rốn  Thể tích máu trung bình thu lần thu mẫu là: 24,57 ml 3.2 Thu nhận tế bào đơn nhân Sau lần li tâm dung dịch li giải hồng cầu tốc độ 1000 vòng/1phút phút, dung dịch ống li tâm (máu cuống rốn + dung dịch li giải) nhạt màu dần Nguyên nhân: tế bào hồng cầu vỡ lên trên, bị loại bỏ Sau lần li tâm liên tiếp, thu vệt màu trắng trải dài từ đáy lên miệng ống (phần nhiều đáy ống li tâm), tế bào gốc đơn nhân 3.2.1 Kết thí nghiệm Trong q trình tiến hành thí nghiệm, có Thí nghiệm cho kết thích hợp để tiếp tục công việc nghiên cứu đề tài Thí nghiệm 5: Ni cấy mơi trường D’MEM/F12 10% FBS + CM Từ kết thí nghiệm, tiến hành kết hợp môi trường D’MEM/F12, 10% FBS môi trường CM, với suy nghĩ môi trường D’MEM/F12, 10% FBS cung cấp chất dinh dưỡng cần cho phát triển môi trường CM cung cấp yếu tố tăng trưởng cần cho bám dính tăng sinh Nhiều nghiên cứu cho thấy mơi trường CM chứa nhiều (1) chất cần cho bám dính, (2) yếu tố tăng trưởng, (3) chất chuyển hố thứ cấp… Với chứng rằng, mơi trường CM sử dụng thành công cho nuôi cấy tế bào khó ni tế bào gốc phơi chuột, người; sử dụng nghiên cứu tạo dịng để kích thích phát triển tế bào thành dòng  Sau 24 giờ, tế bào bám dính nhiều, số tế bào bám dính trung bình thị trường đếm 39,73 tế bào, cao gấp 1,70 lần so với thí nghiệm 178 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 Như vậy, mơi trường D’MEM/F12 10%FBS + CM kích thích bám dính tế bào cao Bảng 3.1 Số tế bào bám dính ghi nhận 10 thị trường, lơ (sau 24 giờ) Thị trường 10 Trung bình 34 20 37 71 54 20 86 23 50 22 41,7 34 25 50 27 30 32 18 52 26 31 32,5 19 22 34 40 34 39 78 98 20 12 39,6 Lần lặp lại 39,73  Sau 72 giờ, số lượng tế bào phát triển thị trường ghi nhận nhiều (trung bình 35,8 tế bào, cao gấp 1,52 lần so với thí nghiệm môi trường D’MEM/F12 10%FBS) Bảng 3.2 Số tế bào phát triển ghi nhận 10 thị trường, lơ (sau 72 giờ) Thị trường 10 Trung bình 30 31 18 24 56 54 15 34 45 20 32,7 44 35 10 23 10 42 24 37 29 31 28,5 29 21 24 47 24 49 88 88 10 82 46,2 Lần lặp lại 35,8 - Sau 10 ngày, 13 ngày, 16 ngày…, số lượng tế bào thị trường đến 100 tế bào, nên chuyển sang phương pháp xác định số lượng buồng đếm Kết giải thích mục 3.3 Như vậy, kết hợp môi trường D’MEM/F12, 10% FBS CM tạo môi trường mới, với khả tăng cường bám dính, kích thích phát triển, đẩy mạnh tăng sinh tế bào gốc trung mô máu cuống rốn 179 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thanh Đây 3.2.2 So sánh kết thí nghiệm Bảng 3.3 Tổng kết khả sống bám dính tế bào ni sơ cấp Môi trường * Bám Trạng thái tế bào Phát triển** Tăng trưởng*** E’MEM 10% FBS - - - D’MEM 10% FBS + - - D’MEM/F12 10% FBS ++ ++ + D’MEM/F12 10% FBS + SFM - - - D’MEM/F12 10% FBS + CM +++ +++ +++ Khả bám dính Sau 24 cho thấy: tế bào môi trường DMEM/F12 10% FBS + CM bắt đầu bám dính vào bề mặt ni cấy với số lượng lớn Trong đó, mơi trường D’MEM 10% FBS, D’MEM/F12 10% FBS số lượng tế bào bám ít, tế bào trong mơi trường E’MEM 10% FBS, DMEM/F12 10%FBS + SFM gần khơng có tế bào bám dính vào bề mặt đĩa ni Như vậy, môi trường khảo sát giới hạn đề tài, môi trường DMEM/F12 10% FBS + CM tạo điều kiện tốt cho bám dính tế bào Bảng 3.4 Khả bám dính tế bào môi trường nuôi cấy (sau 24 giờ) Môi trường Số lượng tế bào trung bình thị trường E’MEM D’MEM D’MEM/F12 2,0 22,3 D’MEM/F12 D’MEM/F12 + SFM + CM 39,73 Khả phát triển Sau 72 cho thấy: tế bào môi trường D’MEM/F12 10%FBS + CM phát triển với số lượng lớn, có hình dạng đặc trưng Trong mơi trường D’MEM/F12 10%FBS, tế bào phát triển nhiều Ba mơi trường cịn lại (E’MEM 10% FBS, D’MEM 10% FBS, D’MEM/F12 10% FBS + SFM) khơng thấy có tế bào phát triển Như vậy, môi trường khảo sát giới hạn đề 180 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 tài, môi trường D’MEM/F12 10%FBS + CM tạo điều kiện tốt cho phát triển tế bào Bảng 3.5 Khả phát triển tế bào mơi trường ni cấy (sau 72 giờ) Môi trường E’MEM D’MEM D’MEM/F12 Số lượng tế bào trung bình thị trường 0 D’MEM/F12 D’MEM/F12 + SFM + CM 23,6 35,8 Khả tăng trưởng Sau ngày nuôi cấy sơ cấp cho thấy: Các tế bào mơi trường D’MEM/F12 10%FBS có tăng trưởng chậm Trong đó, mơi trường E’MEM 10% FBS, D’MEM 10% FBS, D’MEM/F12 10% FBS + SFM tế bào không tăng trưởng Chỉ môi trường D’MEM/F12 10% FBS + CM số lượng tế bào tăng trưởng mạnh Như vậy, môi trường khảo sát giới hạn đề tài, môi trường D’MEM/F12 10% FBS + CM tạo điều kiện tốt cho tăng trưởng tế bào Bảng 3.6 Khả tăng trưởng tế bào mơi trường ni cấy (sau ngày) Môi trường Số lượng tế bào trung bình thị trường E’MEM D’MEM 0,73 D’MEM/F12 D’MEM/F12 + SFM D’MEM/F12 + CM 19,1 > 100 tế bào/ thị trường 181 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thanh Đây E’MEM, 10% FBS D’MEM, 10% FBS Tế bào không bám Tế bào bám ít, vài tế bào phát triển,tăng sinh D’MEM/F12, 10% FBS Tế bào bám nhiều, số lượng tế bào phát triển nhiều, tăng sinh yếu D’MEM F12, 10% FBS+ FSM D’MEM F12, 10% FBS+ CM Tế bào không bám Tế bào bám nhiều, phát triển tốt, tăng sinh mạnh Hình 3.1 Sơ đồ tổng kết kết nuôi cấy chọn lọc loại môi trường 3.3 Cấy chuyền tăng sinh Các mẫu nuôi cấy sơ cấp môi trường D’MEM/F12, 10% FBS + CM cho thấy kết tốt chọn làm mẫu để nuôi cấy tăng sinh Số lượng tế bào xác định lô, ngày tổng kết lần sau : Bảng 3.7 Kết nuôi cấy tăng sinh môi trường D’MEM/F12, 10% FBS + CM Ngaøy 10 13 16 19 21 24 Số tế bào trung bình (x104) 2,33 6,89 10,00 11,78 20,88 22,66 25,99 LSD, 95% a b c c d D f 182 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 Nhận xét  Theo thời gian, tế bào nuôi cấy môi trường D’MEM/F12, 10% FBS + CM gia tăng số lượng  Từ ngày đến ngày 13, tế bào gia tăng nhanh số lượng; từ ngày 13 đến ngày 21 gia tăng số lượng chậm Thật vậy, từ ngày 13 đến ngày 16 từ ngày 19 đến ngày 21, gia tăng khơng có ý nghĩa thống kê Ngun nhân, có lẽ tăng mật độ đến giá trị định, tế bào giảm sút khả sinh sản, với cạn kiệt chất dinh dưỡng vào thời điểm  So với mơi trường IMDM bổ sung với bFGF EGF mà nhiều tác giả sử dụng nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn hiệu tăng sinh gần tương đương  Như vậy, môi trường D’MEM/F12, 10% FBS + CM có hiệu tốt việc ni cấy, phát triển tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người Sự bổ sung CM có hiệu tương đương với bổ sung bFGF EGF Kết cho thấy phù hợp với số cơng trình cơng bố thay CM bFGF EGF việc nuôi cấy tế bào gốc phôi người chuột Kết luận đề nghị 4.1 Kết luận Có thể thu nhận tế bào đơn nhân phương pháp li tâm hỗn hợp tế bào máu cuống rốn với dung dịch li giải hồng cầu Môi trường E’MEM 10% FBS, D’MEM/F12 10% FBS+SFM khơng thích hợp cho nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ cuống rốn Môi trường D’MEM 10% FBS, D’MEM/F12 10% FBS cho hiệu nuôi cấy tương đối tốt Tuy nhiên số lượng tế bào bám dính phát triển cịn Môi trường D’MEM/F12 10% FBS + CM cho hiệu phát triển tốt với tế bào bám nhiều phát triển mạnh 183 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thanh Đây 4.2 Đề nghị So sánh môi trường nuôi cấy D’MEM/F12 10%FBS + CM với môi trường sử dụng nhiều nơi khác IMDM + bFGF + EGF Biệt hoá tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người nhằm ứng dụng y học TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phan Kim Ngọc (2002), ”Giáo trình thực tập sở : Công nghệ sinh học động vật”, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM [2] Phạm Văn Phúc (2005), Luận văn tốt nghiệp ”Thu nhận tinh tế bào mầm từ phôi chuột (Mus musculis var Albino) tạo lớp feeder MEF nuôi tế bào mầm”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM [3] Nguyễn Thị Hằng (2006), Luận văn tốt nghiệp ”Thu nhận, ni cấy biệt hố ngun bào sợi (Fibroblast) chuột thành tế bào mỡ (Adipocyte)”, Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM [4] Nguyễn Vũ Thanh Vy (2004), Luận văn tốt nghiệp ”Thiết lập qui trình phân tách tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn Percoll”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM [5] Stewart Sell MD (2004), Stem cell handbook Humana Press Inc, Totowa [6] Cheng L Quasba P, Vanguri P et al Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD 34+ hematopoietic progenitor cells J Cell Physiol 2000; 184:58-69 [7] Daniel R Marshak, Richard L Gardner, David Gottlieb (2001), Stem cell Biology Cold Spring Harbor Laboratory Press [8] I.Robert (2004), Mesenchymal stem cell Vox Sanguinis 38-41 [9] Moustapha Kassen CS (2004), Mesenchymal Stem Cells: Cell Biology 184 ... Phương pháp 2.2.1 Thu nhận máu cuống rốn : thu nhận em bé vừa sinh 2.2.2 Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn Máu cuống rốn Hút máu vào syringe 10 ml Chuyển máu vào ống li tâm... liệu thu nhận xử lí Phần mềm Microsoft Excel Phần mềm xử lí thống kê Statraphic 7.0 Kết thảo luận 3.1 Thu nhận máu cuống rốn  Thể tích máu trung bình thu lần thu mẫu là: 24,57 ml 3.2 Thu nhận tế. .. thu nhận tế bào đơn nhân phương pháp li tâm hỗn hợp tế bào máu cuống rốn với dung dịch li giải hồng cầu Môi trường E’MEM 10% FBS, D’MEM/F12 10% FBS+SFM khơng thích hợp cho ni cấy tế bào gốc trung