Nghiên cứu phân biệt dòng đa bội và tái sinh thể đa bội sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv )

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG LÊ HUỲNH THỊ DIỄM SƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT DÒNG ĐA BỘI VÀ TÁI SINH THỂ ĐA BỘI SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG LÊ HUỲNH THỊ DIỄM SƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT DÒNG ĐA BỘI VÀ TÁI SINH THỂ ĐA BỘI SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tơi thực hướng dân TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú Các số liệu thu thập kết phân tích đề tài trung thực Đề tài không trùng với đề tài nghiên cứu khoa học Những thông tin tham khảo khóa luận trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Đà Nẵng, ngày 09 tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Lê Huỳnh Thị Diễm Sương i LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành phịng Công nghệ Sinh học Tế bào thuộc Khoa Sinh Môi trường - Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng Trung tâm Ươm tạo hỗ trợ Doanh nghiệp Khoa học & Công Nghệ - Bộ Khoa học & Công Nghệ (Cơ sở Tp Đà Nẵng), hướng dẫn khoa học giúp đỡ tận tình TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hai thầy tận tâm gợi ý dẫn hướng cho đề tài, ln nhắc nhở để tơi ln hồn thành tốt công việc Chân thành cảm ơn hai thầy với kiến thức kinh nghiệm quý báu truyền đạt cho suốt thời gian vừa qua Chân thành cảm ơn anh chị, bạn bè, Th.S Lê Thị Mai ln nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, bảo bước ban đầu lĩnh vực nghiên cứu khoa học Trong q trình nghiên cứu, tơi nhận quan tâm giúp đỡ nhiệt tình nhiều mặt chị nhân viên Trung tâm Ươm tạo hỗ trợ Doanh nghiệp, đặc biệt chị Trần Thị Kim Anh Thời gian gặp không dài chị cho ấn tượng sâu sắc lịng nhiệt tình với cơng việc tạo cho nhiều niềm phấn khởi để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn giúp đỡ chị thời gian qua Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình ln bên cạnh động viên giúp đỡ suốt q trình hồn thành đề tài khóa luận Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Sâm Ngọc Linh 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm phân loại sâm Ngọc Linh .3 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái .4 1.1.4 Tác dụng dược lý sâm Ngọc Linh .6 1.2 Thể đa bội đặc điểm thực vật đa bội 1.2.1 Thể đa bội 1.2.2 Ưu điểm nhược điểm đa bội 1.2.3 Đa bội thực vật 1.3 Tình hình nghiên cứu 1.3.1 Ngoài nước 1.3.2 Trong nước 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Vật liệu 12 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phương pháp xác định thể đa bội sâm Ngọc Linh thông qua đặc điểm hình thái, khí khổng lục lạp 13 2.3.2 Phương pháp xác định số lượng nhiễm sắc thể 13 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào sâm Ngọc Linh đa bội tạo mô sẹo phôi soma từ mẫu lá, cuống rễ 14 iii 2.3.4 Phương pháp phân tích hình ảnh 15 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu .15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .16 3.1 Đánh giá mức đa bội qua đặc điểm hình thái, khí khổng lục lạp sâm Ngọc Linh xử lý colchicine 16 3.1.1 Xác định dịng đa bội thơng qua đặc điểm hình thái 16 3.1.2 Đánh giá dòng sâm Ngọc Linh đa bội in vitro qua đặc điểm mật độ khí khổng số lượng lục lạp .17 3.2 Đánh giá mức bội thể dòng sâm Ngọc Linh 20 3.2.1 Xác định thời gian phân bào tối ưu 20 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch sốc nhược trương đến phân tán NST sâm Ngọc Linh đa bội in vitro 21 3.2.3 Số lượng NST sâm Ngọc Linh 23 3.2.4 Mức đa bội thể dòng sâm Ngọc Linh đa bội in vitro 24 3.3 Ảnh hưởng nguồn mẫu cấy đầu vào đến phát sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh đa bội nuôi cấy in vitro 25 3.4 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo .28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 Kết luận 34 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic BA: benzyladenine KCl: kali clorua MS: Murashige & Skoog NAA: α- naphthaleneacetic acid NST: nhiễm sắc thể v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên bảng Ký hiệu mẫu sâm Ngọc Linh Khảo sát ảnh hưởng dung dịch nhược trương đến phân tán NST sâm Ngọc Linh Đặc điểm hình thái sâm Ngọc Linh đa bội in vitro Kích thước mật độ khí khổng số lượng lục lạp mẫu sâm Ngọc Linh đa bội in vitro Kết khảo sát nồng độ kali clorua dùng để sốc nhược trương tế bào Số lượng NST dòng sâm Ngọc Linh đa bội Sự phát sinh mô sẹo nguồn mẫu lá, cuống sâm Ngọc Linh đa bội in vitro sau tuần nuôi cấy Thời gian phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo Sự phát sinh phôi soma nguồn mẫu lá, cuống sâm Ngọc Linh đa bội in vitro sau tuần nuôi cấy vi Trang 12 14 16 18 22 25 26 29 30 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 2.1 Tên hình vẽ Một số hình ảnh hình thái sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Quy trình thực tiêu hiển vi tạm thời để quan sát đếm số lượng nhiễm sắc thể Trang 11 3.1 Đặc điểm hình thái sâm Ngọc Linh đa bội in vitro 16 3.2 Hình thái khí khổng lục lạp mẫu sâm đa bội 20 3.3 Tế bào sâm Ngọc Linh thời kỳ phân bào nguyên nhiễm 21 3.4 3.5 Tỉ lệ tế bào kỳ trình nguyên phân theo mốc thời gian khác Ảnh hưởng nồng độ dung dịch sốc nhược trương đến phân tán NST sâm Ngọc Linh 21 22 3.6 Số lượng NST sâm Ngọc Linh lưỡng bội 24 3.7 Số lượng NST mẫu sâm Ngọc Linh đa bội 24 3.8 3.9 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến cảm ứng tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh đa bội in vitro Ảnh hưởng nguồn mẫu đến phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh đa bội in vitro vii 27 32 TÓM TẮT Sàng lọc tuyển chọn dòng sâm Ngọc Linh đa bội thực nghiên cứu thông qua đánh giá tiêu hình thái số lá, số lượng mật độ khí khổng, số lượng lục lạp tế bào khí khổng đếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể Trong bảy dòng sâm Ngọc Linh tạo đa bội colchicine, có năm dịng xác định đa bội thơng qua phương pháp đếm số lượng lục lạp tế bào khí khổng Phương pháp đếm trực tiếp số lượng NST tế bào soma tỏ hiệu việc xác định xác mức bội thể dịng đa bội Kết cho thấy bốn dòng xác định thể tam bội với 2n=3x=36, dòng chưa xác định rõ mức bội thể Năm dòng đa bội dùng làm vật liệu nhân giống in vitro thông qua cảm ứng tạo mô sẹo phát sinh phôi soma Các mẫu cuống từ dòng tam bội khảo sát xác định ảnh hưởng nguồn mẫu đến tái sinh mô sẹo phát sinh phôi Kết nghiên cứu cho thấy nguồn mẫu cuống cho tỷ lệ tạo mô sẹo tỷ lệ phát sinh phôi tốt so với nguồn mẫu Từ khóa: sâm Ngọc Linh, đa bội, nhiễm sắc thể, mơ sẹo, phơi soma viii Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến cảm ứng tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh đa bội in vitro L1-L4 Sự tăng sinh mô sẹo mẫu tương ứng qua tuần, tuần, tuần tuần nuôi; CL1-CL4 Sự tăng sinh mô sẹo mẫu cuống tương ứng qua tuần, tuần, tuần tuần nuôi Sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô cấy auxin Thông thường; 2,4-D NAA thường sử dụng làm nguồn auxin ngoại sinh cho hình thành mơ sẹo loài thực vật (Dixon and Gonzales, 1994; Hsia and Korbam, 1996) Các mẫu thí nghiệm cấy vào mơi trường có NAA; 2,4-D hầu hết có tượng hóa nâu vài tuần đầu vị trí vết thương, tinh dầu tiết gây nên tượng Tuy nhiên, sau vài tuần nuôi cấy, tác động chất điều hịa sinh trưởng thực vật, mơ sẹo bắt đầu hình thành từ vị trí vết thương, sau tế bào mô sẹo phát triển 27 mạnh tạo thành khối Mô thực vật bị tổn thương có khuynh hướng làm lành vết thương cách phản phân hóa tế bào để phân chia tạo tế bào khác che lấp vùng bị tổn thương Nhờ có chất điều hịa sinh trưởng thực vật, tế bào thúc đẩy phát triển nhanh Sự kết hợp hai loại auxin trình cảm ứng mô sẹo nghiên cứu nhiều đối tượng khác Trên Thu thảo kê (Pogonatherum paniceum) bổ sung kết hợp 2,4-D NAA với nồng độ khác nhau, mẫu cấy cảm ứng tạo thành mơ sẹo có hình thái khác nhau; bên cạnh xuất mô sẹo “xốp”, mềm, màu trắng xanh hay vàng nhạt cịn có mô sẹo cứng, chắc, màu vàng đậm (Wang cs., 2008) Ở Ngũ trảo (Vitex negundo) bổ sung 2,4-D kết hợp với NAA nồng độ thấp (dưới 1,0 mg/l) tạo thành mô sẹo bở, màu trắng; nồng độ 2,4-D NAA khoảng 1,0 mg/l - 2,0 mg/l mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo “xốp”, bở, mọng nước, màu trắng Khi bổ sung nồng độ NAA 2,4-D cao 2,0 mg/l mơ sẹo hình thành bở, có màu vàng trắng xanh (Chowdhury cs.,2011) Trong nước, mô sâm số tác giả sử dụng vật liệu ban đầu để nghiên cứu tạo mô sẹo với kết tốt (Nhut cs., 2011; Dương Tấn Nhựt cs., 2009; Dương Tấn Nhựt cs., 2010); có nghiên cứu dùng mơ củ (Nguyễn Thị Liễu cs., 2011; Nguyễn Trung Thành cs., 2007; Trần Thị Liên cs., 2009), mô cuống (Dương Tấn Nhựt cs., 2009), mô rễ (main root) cấy mơ (Nhut cs., 2012) để tạo nguồn vật liệu mô sẹo Sự phát sinh mơ sẹo thí nghiệm cho kết hồn toàn phù hợp với nghiên cứu Trung tâm Sâm từ năm 1984 đối tượng sâm Ngọc Linh Nghiên cứu Nguyễn Thượng Dong cho thấy mẫu có gân hình thành mơ sẹo - tuần với tỷ lệ 100%, rễ hình thành - tuần với tỷ lệ 96,76% thân phát sinh tuần với tỷ lệ 100% (Nguyễn Thượng Dong cs., 2007) Đặc điểm hình thái mơ sẹo thí nghiệm tương ứng với kết nghiên cứu Lê Kim Cương cộng sự, mẫu cấy cuống sâm Ngọc Linh cảm ứng tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” tốt mơi trường khống MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA (Lê Kim Cương cs., 2012) Như vậy, đối tượng sâm Ngọc Linh đa bội, tỷ lệ cảm ứng tạo thành mơ sẹo hình thái mơ sẹo khơng có nhiều khác biệt so sâm Ngọc Linh lưỡng bội nuôi cấy mơi trường có bổ sung 2,4-D NAA với tỷ lệ 1:1 3.4 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo Phơi vơ tính có nhiều đặc tính tốt cơng tác nhân giống trồng quan trọng Nhân giống đường phát sinh phơi cho thấy có nhiều thuận lợi so với đường phát sinh quan Bên cạnh đó, nghiên cứu q trình phát sinh phơi vơ tính cịn cung cấp khía cạnh quan trọng mặt sinh lý học, phôi học thực vật Phơi vơ tính 28 hình thành phát triển lớn dần nhờ hoạt động phân chia diễn liên tục tế bào sinh phôi nằm khối tiền phôi Bonnelle cho với diện auxin, q trình methyl hóa DNA xảy gây kết thúc làm thay đổi chương trình biểu gen tế bào Quan trọng hơn, tế bào cần phải tách khỏi kiểm soát tế bào xung quanh cần phóng thích khỏi cụm mơ sẹo Các tế bào cảm ứng cụm tách khỏi tế bào xung quanh cách cắt đứt cầu sinh chất chết mô xung quanh, làm gián đoạn tương tác tế bào-tế bào Từ đó, kết thúc chương trình biểu gen có sẵn thiết lập chương trình phát sinh phơi (Bonnelle cs., 1990) Auxin có vai trị quan trọng cảm ứng sinh phơi lẫn phát sinh hình thái phơi Với có mặt auxin, cấu trúc tiền phơi (PEM, pro embryonic mass) có biểu gen cần thiết để hồn tất giai đoạn phơi hình cầu (Zimmerman, 1993) Vì vậy, thí nghiệm này, tiếp tục nuôi cấy khối mô sẹo môi trường MS có bổ sung NAA 2,4-D với tỷ lệ 1:1 để quan sát đánh giá trình hình thành phôi soma nguồn mẫu cấy khác Bảng 3.6 Thời gian phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo Mẫu Lá Cuống Thời gian (tuần) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 72L - - - - - - + + + 48L - - - - - - - - + 05L - - - - - - + + + 075L - - - - + + + + + 1L - - - - - - + + + 72C + + + + + + + + + 48C - - - - - + + + + 05C - - - - - - + + + 075C - + + + + + + + + 1C + + + + + + + + + Bảng 3.7 Sự phát sinh phôi soma nguồn mẫu lá, cuống sâm Ngọc Linh đa bội in vitro sau 18 tuần nuôi cấy 29 Mẫu Lá Cuống Tỉ lệ phôi soma (%) Phôi soma/mẫu cấy Đặc điểm phôi 72L 50,2±2,82 2,33±0,82 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, màu vàng nhạt, trơn bóng, kích thước nhỏ, số lượng 48L 50,94±3,63 3,33±1,37 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, màu vàng nhạt, trơn bóng 05L 53,33±1,76 3,92±1,88 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, có màu vàng 075L 63,33±4,71 3,63±0,53 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu thủy lơi, có màu vàng 1L 53,57±5,05 5,67±4,71 Cụm phơi soma hình cầu, trơn bóng, có màu vàng nhạt xanh nhạt 72C 62,5±2,5 5,75±1,5 Có phát sinh rễ; phơi hình cầu mầm, có màu vàng 48C 66,67±2,89 5,17±1,41 Có phát sinh rễ; phơi hình cầu thủy lơi, có màu vàng nhạt trơn bóng 05C 50,45±2,5 3,01±0,67 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, có màu vàng 075C 63,33±4,17 3,67±1,89 Có phát sinh rễ; phơi hình cầu thủy lơi, có màu vàng nhạt 1C 75,1±2,55 5,67±2,51 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, hình thuỷ lơi hình mầm, có màu vàng nhạt Ghi chú: Giá trị phơi/mẫu cấy tổng số phơi hình dạng cầu, thuỷ lôi mầm Đánh giá thực sau 18 tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung 2,4-D NAA với tỷ lệ 1:1 Kết sau 18 tuần nuôi cấy cho thấy nguồn mẫu cuống khác cho tỷ lệ cảm ứng tạo phôi khác Hầu hết mẫu cho phát sinh rễ bất định trình hình thành phơi Những thay đổi hình thái mẫu ghi nhận sau 18 tuần ni cấy với thay đổi hình dạng số tế bào mô sẹo mẫu cấy 30 Các tế bào mô sẹo tiếp tục tăng sinh kích thước, có nhiều hình dạng khác xếp lỏng lẻo phân chia theo nhiều hướng khác tuần thứ Nhưng bắt đầu tuần thứ 14, mẫu 075L có khối mơ sẹo bắt đầu chuyển từ màu trắng sang vàng nhạt, bề mặt trở nên trơn bóng bắt đầu hình thành cấu trúc hình cầu nhỏ li ti Các cấu trúc nhỏ có màu vàng đậm so với khối tế bào mô sẹo xung quanh, Halperin (1970) gọi PEM Những cấu trúc PEM thường định vị vùng ngoại vi thường nằm rải rác khối mô sẹo Sự biến đổi cấu trúc PEM sang dạng khác phơi soma hình cầu rõ rệt hình thủy lơi ghi nhận sớm mẫu 075L Nguồn mẫu cuống nhìn chung có thời gian phát sinh phơi soma sớm hơn, tỷ lệ phôi soma tạo thành số phôi/ mẫu lớn so với nguồn mẫu Phôi soma hình thành sớm mẫu cuống 1C 72C sau tuần nuôi cấy tạo mô sẹo, phơi có dạng hình cầu trơn nhẵn phát triển riêng lẻ bề mặt khối mô sẹo Sau 18 tuần nuôi, mô phôi soma mẫu cuống nhận thấy có phân hóa thái tốt nhất, thường dạng khối cầu, số phôi trạng thái phân hóa cao với mầm, thân phơi có hình dạng đặc trưng (hình 3.9.) Nhìn chung, sau 16 tuần, tất mẫu đề có xuất phôi cầu, thể phôi cầu vào trạng thái biệt hóa có bề mặt trơn láng, khác với khối mô sẹo thường gặp nhiều trường hợp dạng cầu có bề mặt “sần sùi” Khi tiếp tục nuôi, phôi cầu dần hình thành phát thể mầm Sự tăng trưởng chiều cao mầm mầm bao xung quanh trục phơi tạo phơi hình thủy lơi mẫu 48C, 075C 1C Phôi soma dạng hai mầm xuất mẫu 72C 1C sau 18 tuần nuôi cấy mô sẹo, phôi có màu vàng nhạt mầm kích thước nhỏ Trong thời gian điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ phát sinh phôi số lượng phôi soma hai nguồn mẫu cấy cuống khác Tỉ lệ phát sinh phôi cao nguồn mẫu cuống 1C (75,1%±2,55), thấp nguồn mẫu 72L (50,2%±2,82) Số lượng phơi soma hình thành mẫu cấy nguồn mẫu cuống cao so với nguồn mẫu Mẫu 72C cho số lượng phôi soma nhiều (5,75±1,5 phôi/mẫu cấy), ngược lại mẫu 72L có số lượng phơi hình thành thấp (2,33±0,82 phơi/mẫu cấy) 31 Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh đa bội in vitro L1-L4: Sự phát sinh phôi soma mẫu tương ứng qua 10 tuần, 12 tuần, 14 tuần, 16 tuần 18 tuần nuôi; CL1-CL4: Sự tăng sinh mô sẹo mẫu cuống tương ứng qua 10 tuần, 12 tuần, 14 tuần, 16 tuần 18 tuần ni Trong thí nghiệm này, khơng có bất thường hình thái phơi ghi nhận Chất lượng hình thái phơi vơ tính có ảnh hưởng đến khả phát triển thành hồn chỉnh Những phơi có định hướng lưỡng cực rõ ràng, có mầm đầy đủ có trục phơi phát triển hồn chỉnh dễ dàng phát triển thành so với phôi bất thường (Lazzeri cs., 1987; Hartweck cs., 1988; Rodriguez Wetzstein, 1994) Phơi vơ tính nghiên cứu nhiều lồi, chi Panax, phương pháp tạo phơi vơ tính nghiên cứu nhiều loài P ginseng (Tang cs., 2000; Arya cs., 1993); P japonicus (You cs., 2007); P quinquefolius (Zhou cs., 2005) Phơi vơ tính sâm Mỹ (P quinquefolius) hình thành mơi trường MS có bổ sung mg/l 2,4-D kết hợp với mg/l NAA từ mẫu cấy mầm (Zhou cs., 2005) Phơi vơ tính P japonicus lại hình thành mơi trường MS có bổ sung 4,4 µM 2,4-D từ phơi hợp tử (You cs., 2007) 32 Phơi vơ tính P ginseng tạo từ mầm mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D kết hợp 0,1 mg/l BA (Tang cs., 2000) Kết thí nghiệm cho thấy cuống nguồn mẫu phù hợp dùng để cảm ứng mơ sẹo phát sinh phơi soma Nhưng khơng có chênh lệch khác biệt hình thái, tỷ lệ tạo phơi số phơi hình thành mẫu cấy nguồn mẫu Bên cạnh đó, số nghiên cứu nước phơi vơ tính sâm Ngọc Linh, mẫu cho nguồn vật liệu nuôi cấy tốt (Mai Trường cs., 2014; Vũ Thị Hiền cs., 2014; Bùi Văn Thế Vinh cs., 2014; ) Điều gây mâu thuẫn việc lựa chọn nguồn mẫu nuôi cấy sâm Ngọc Linh đa bội in vitro Vì vậy, để có kết luận xác ảnh ảnh hưởng nguồn mẫu đến khả phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh đa bội in vitro, cần phải tiếp tục theo dõi phát sinh hình thái tiêu đánh giá phôi soma nguồn mẫu thời gian tới 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Số lượng lục lạp tế bào khí khổng số lượng NST tế bào sinh dưỡng hai tiêu tốt dùng để xác định thể đa bội sâm Ngọc Linh Nghiên cứu chọn lọc dòng từ dòng đa bội A72, A48, A05, A075 A1 - Nồng độ dung dịch KCl 0.2% tối ưu để nhược trương tế bào sâm Ngọc Linh, giúp NST phân tán mà không gây vỡ tế bào Qua đó, xác định xác số lượng NST sâm Ngọc Linh lưỡng bội 2n=2x=24 Mức bội thể dòng sâm tam bội 2n=3x=36 xác định qua nghiên cứu - Sự tái sinh mô sẹo phát sinh phôi soma tốt nguồn mẫu cuống Kiến nghị - Xác định lại số lượng NST mẫu 72L - Tiếp tục theo dõi mẫu cấy phát sinh phôi soma, đánh giá đặc điểm hình thái giải phẫu phơi 24 tuần ni cấy - Thực nghiên cứu xác định mức bội thể phương pháp đo dòng chảy tế bào (flow cytometry) - Thực nghiên cứu khảo sát mức độ chống chịu stress môi trường mẫu sâm Ngọc Linh tam bội so với mẫu lưỡng bội - Thực nghiên cứu đánh giá hàm lượng hoạt chất sâm Ngọc Linh tam bội so với lưỡng bội 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alix, K., Gérard, P R., Schwarzacher, T., & Heslop-Harrison, J S (2017) Polyploidy and interspecific hybridization: partners for adaptation, speciation and evolution in plants Annals of Botany, 120(2), 183-194 Arya, S., Arya, I D., & Eriksson, T (1993) Rapid multiplication of adventitious somatic embryos of Panax ginseng Plant cell, tissue and organ culture, 34(2), 157-162 Beck, S L., Dunlop, R W., & Fossey, A (2003) Stomatal length and frequency as a measure of ploidy level in black wattle, Acacia mearnsii (de Wild) Botanical Journal of the Linnean Society, 141(2), 177-181 Bộ Y tế (2010), Hội nghị phát triển dược liệu sản phẩm thuốc quốc gia, Bình Dương Bonnelle C, Lejeune F, Fournier D, Tourte Y (1990) Infrastructural modifications and acquisition of embryogenic properties in cotyledonary cells of leguminous species Compt Rend Acad Sci Paris, Sér 3, Sci Vie 310(13): 657-664 Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thương Hiền, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014) Nghiên cứu hình thái giải phẫu cấu trúc phơi q trình phát sinh phơi vơ tính sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) J Sci, 12(7), 1140-1148 Buxton, B H., & Darlington, C D (1931) Behaviour of a new species, Digitalis mertonensis Nature, 127(3194), 94-94 Chen, G., SUN, W B., & Sun, H (2009) Morphological characteristics of leaf epidermis and size variation of leaf, flower and fruit in different ploidy levels in Buddleja macrostachya (Buddlejaceae) Journal of Systematics and Evolution, 47(3), 231-236 Chowdhury, F B., Azam, F S., Hassan, M M., Jahan, F I., Chowdhury, A R., Seraj, S., & Rahmatullah, M (2011) Studies with callus induction of Vitex negundo: an aromatic medicinal plant American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture, 5(1), 6-14 Comai, L (2005) The advantages and disadvantages of being polyploid Nature reviews genetics, 6(11), 836-846 Đào Kim Long , 1973 Về loài thuốc quý núi Tài liệu đánh máy tr Dixon, R A., & Gonzales, R A (Eds.) (1994) Plant cell culture: a practical approach (No 145) IRL press 35 Đỗ Hữu Bích (2003), Từ điển thuốc động vật làm thuốc Việt Nam II NXB Khoa học Kỹ thuật Dung, H T., & Grushvisky, I V (1985) A new species of the genus Panax L Araliaceae in Vietnam: Panax vietnamensis Ha et Grushv Bot J Vietnam, 70, 518 Hà Thị Dụng, Grushvitzky IV, Skvortsova NT (1983), “Đặc tính hình thái - giải phẫu Panax vietnamensis (Araliaceae)”, Tạp chí Sinh học, 7(3), tr 45-48 Dương Tấn Nhựt (2016), Công nghệ sinh học nghiên cứu chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Dương Tấn Nhựt, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Phạm Thanh Phong, Bùi Ngọc Huy, Đặng Thị Ngọc Hà, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thi Hiền, Bùi Thế Vinh, Lâm Thị Mỹ Hằng, Dương Thị Mộng Ngọc, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận (2009) Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro bước đầu phân tích hàm lượng saponin Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 7(3): 365-378 Dương Tấn Nhựt; Lâm Thị Mỹ Hằng; Bùi Thế Vinh; Phan Quốc Tâm; Nguyễn Bá Nam; Nguyễn Cửu Thành Nhân; Hoàng Xuân Chiến; Lê Nữ Minh Thuỳ; Vũ Thị Hiền; Nguyễn Văn Bình; Vũ Quốc Luận; Trần Cơng Luận; Đồn Trọng Đức (2010) Xác định hàm lượng saponin dư lượng số chất điều hòa sinh trưởng callus, chồi rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Fukui, K., & Iijima, K (1991) Somatic chromosome map of rice by imaging methods Theoretical and Applied Genetics, 81(5), 589-596 Ganga, M., Chezhiyan, N., Kumar, N., & Soorianathasundaram, K (2002) Stomatal and chloroplast traits as ploidy assessment techniques for ploidy screening of in vitro induced tetraploids of banana Phytomorphology, 52(2-3), 113-120 Gao, S L., Zhu, D N., Cai, Z H., & Xu, D R (1996) Autotetraploid plants from colchicine-treated bud culture of Salvia miltiorrhiza Bge Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 47(1), 73-77 H.T Dung, I.V Grushvitzky, A new species of the genus Panax L., Araliaceae in Vietnam: Panax vietnamensis Ha et Grushv., Botanical Journal of Vietnam, 1985, 70, 518-522 Hà Thị Loan, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hồng Qn, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier (2014) Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Tạp chí Cơng nghệ sinh học 2014, 36(1se), 293-300 36 Halperin, W A L T E R (1970) Embryos from somatic plant cells Control mechanisms in the expression of cellular phenotypes, 169-191 Hartweck L.M., Lazzeri P.A., Cui D., Collins G.B and Williams E.G (1988) Auxinorientation effects on somatic embryogenesis from immature soybean cotyledons In Vitro Cell Dev Biol., 24: 821-828 Hindmarsh M M (1953) The effects of colchicine on spindle of root-tip cells Biol Abstr., 28(11): 2488 Hsia, C N., & Korban, S S (1996) Organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida and Rosa chinensis minima Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 44(1), 1-6 Huỳnh Thị Ngọc Nhân - Kiều Ngọc Ẩn - Mai Thị Tuyết (2004) Thực tập di truyền sở Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Kim, Y J., Joo, S C., Shi, J., Hu, C., Quan, S., Hu, J., & Zhang, D (2018) Metabolic dynamics and physiological adaptation of Panax ginseng during development Plant cell reports, 37(3), 393-410 Kim, Y S., Hahn, E J., Murthy, H N., & Paek, K Y (2004) Effect of polyploidy induction on biomass and ginsenoside accumulations in adventitious roots of ginseng Journal of Plant Biology, 47(4), 356-360 Konoshima T., Takasaki M., Ichiishi E., Murakami T., Tokuda H., Nishino H., Duc N.M., Kasai R., Yamasaki K (1999), Cancer chemopreventive activity of majonosideR2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis, Cancer letters,147(1-2), pp 11-16 Lazzeri P.A., Hildebrand D.F and Collins G.B (1987) Soybean somatic embryogenesis: effects of hormones and culture manipulations Plant Cell Tiss Org Cult., 10: 197208 Lê Đình Khả, R Griffin, Hà Huy Thịnh, J Harbard, Lê Sơn, Dương Thanh Hoa, Nghiêm Quỳnh Chi (2016) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn ISSN 0888-7209 2009, No pp 114-120 Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt (2012) Ảnh hưởng số yếu tố lên khả tăng sinh mô sẹo “xốp” bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Trần Trọng Tuấn, Phan Tường Lộc, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Ngọc Hân1, Phạm Đức Trí 1, Lê Tấn Đức, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Hữu Hổ (2014) Tạo nhân phôi soma sâm 37 ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) môi trường lỏng J Sci, 12(7), 1085-1095 Manzanilla, V., Kool, A., Nhat, L N., Van, H N., Thu, H L T., & De Boer, H J (2018) Phylogenomics and barcoding of Panax: toward the identification of ginseng species BMC evolutionary biology, 18(1), 1-14 Melaragno, J.E., Mehrotra, B and Coleman, A.W (1993) Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis Plant Cell, 5, 1661– 1668 Murti, R H., Kim, H Y., & Yeoung, Y R (2012) Morphological and anatomical characters of ploidy mutants of strawberry International Journal of Agriculture and Biology, 14(2) Naiki, A., & Nagamasu, H (2004) Correlation between distyly and ploidy level in Damnacanthus (Rubiaceae) American Journal of Botany, 91(5), 664-671 Nguyễn Nghĩa Thìn, Các phương pháp nghiên cứu thực vật, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, 2008 Nguyễn Thị Kim Loan, Nguyễn Thanh Sang, Vũ Thị Thủy, Nguyễn Hồng Hoàng, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt (2015) Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu trình phát sinh hình thái sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, (4), 657 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết, 2011 Nghiên cứu khả tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Trần Nhân Dũng, Đỗ Tấn Khang (2012) Đánh giá hiệu colchicine chọn tạo giống quýt hồng Lai Vung tứ bội (Citrus reticulate blanco) Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Paek Kee Yoeup, 2007 Nuôi cấy rễ bất định Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 828-831 Nguyễn Vũ Linh, Nguyễn Xuân Phước, Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Nguyễn Lê Duy Trung Trần Nhân Dũng (2011) Mức đa bội thể tập đồn giống có múi việt nam phương pháp dịng chảy tế bào Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 238-247 38 Nguyen, B., Kim, K., Kim, Y C., Lee, S C., Shin, J E., Lee, J., & Yang, T J (2017) The complete chloroplast genome sequence of Panax vietnamensis Ha et Grushv (Araliaceae) Mitochondrial DNA Part A, 28(1), 85-86 Nhut, D T., Huy, N P., Luan, V Q., Van Binh, N., Nam, N B., Thuy, L N M., & Hien, V T (2011) Shoot regeneration and micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv from ex vitro leaf-derived callus African Journal of Biotechnology, 10(84), 19499-19504 Nhut, D T., Nga, L T M., Chien, H X., Huy, N P., 2012 Morphogenesis of in vitro main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Afr J Biotechnol., 11(23): 6274-6289 Nhut, D T., Vinh, B V T., Hien, T T., Huy, N P., Nam, N B., Chien, H X., 2012 Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Afr J Biotechnol., 11(5): 1084-1091 Oliveira, V M D., Forni-Martins, E R., Magalhães, P M., & Alves, M N (2004) Chromosomal and morphological studies of diploid and polyploid cytotypes of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni (Eupatorieae, Asteraceae) Genetics and molecular biology, 27(2), 215-222 Paucã-Comãnescu, M., Clevering, O A., Hanganu, J., & Gridin, M (1999) Phenotypic differences among ploidy levels of Phragmites australis growing in Romania Aquatic Botany, 64(3-4), 223-234 Phạm Thành Hổ (1998) Di truyền học (tr 243) Nhà xuất Giáo dục Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn Mối quan hệ di truyền mẫu sâm thu Lai Châu sở phân tích trình tự nucleotide vùng matK ITS-rDNA Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(2): 327-337, 2014 Rayburn, A L., Crawford, J., Rayburn, C M., & Juvik, J A (2009) Genome size of three Miscanthus species Plant Molecular Biology Reporter, 27(2), 184 Rodriguez A.P.M and Wetzstein H.Y (1994) The effect of auxin type and concentration on pecan (Carya illinoinensis) somatic embryo morphology and subsequent conversion into plants Plant Cell Rep., 13: 607-611 Sari, N., Abak, K., & Pitrat, M (1999) Comparison of ploidy level screening methods in watermelon: Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum and Nakai Scientia Horticulturae, 82(3-4), 265-277 39 Tang, W (2000) High-frequency plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis and in vitro flowering of regenerated plantlets in Panax ginseng Plant Cell Reports, 19(7), 727-732 Trần Thị Liên, Tạ Như Thục Anh, Nguyễn Văn Thuận, 2009 Nghiên cứu nhân giống in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) Kỷ yếu Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Trường Đại học Thái Nguyên, 233-236 Trần Thị Oanh Yến, Nguyễn Thị Nga Đào Thị Bé Bảy (2017) Tạo bưởi tam bội từ hạt nhỏ bưởi da xanh bưởi đỏ năm dù Trần Tú Ngà, Giáo trình thực tập di truyền học chọn giống, NXB Nông nghiệp Hà Ni, 1982 Van Laere, K., Franỗa, S C., Vansteenkiste, H., Van Huylenbroeck, J., Steppe, K., & Van Labeke, M C (2011) Influence of ploidy level on morphology, growth and drought susceptibility in Spathiphyllum wallisii Acta Physiologiae Plantarum, 33(4), 11491156 Vandenhout, H., Ortiz, R., Vuylsteke, D., Swennen, R., & Bai, K V (1995) Effect of ploidy on stomatal and other quantitative traits in plantain and banana hybrids Euphytica, 83(2), 117-122 Vanstechelman, I., Vansteenkiste, H., Eeckhaut, T., Van Huylenbroeck, J., & Van Labeke, M C (2009, August) Morphological and anatomical characterisation of chemically induced polyploids in Spathiphyllum wallisii In XXIII International Eucarpia Symposium, Section Ornamentals: Colourful Breeding and Genetics 836 (pp 79-84) Võ Thị Thanh Phương, “Khảo sát số lượng nhiễm sắc tế bào thực vật tế bào động vật phương pháp xử lý sốc nhược trương”, Tạp chí Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, Số 21b, 2012, Số trang: 198-208 Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Wang, W., Zhao, X., Zhuang, G., Wang, S., & Chen, F (2008) Simple hormonal regulation of somatic embryogenesis and/or shoot organogenesis in caryopsis cultures of Pogonatherum paniceum (Poaceae) Plant cell, tissue and organ culture, 95(1), 57-67 Winarto, B., Mattjik, N A., da Silva, J A T., Purwito, A., & Marwoto, B (2010) Ploidy screening of anthurium (Anthurium andreanum Linden ex André) regenerants derived from anther culture Scientia Horticulturae, 127(1), 86-90 Yang D-Q (1981) The cyto-taxonomic studies on some species of Panax L Acta Phytotaxonomica Sinica 19: 298-303 40 Yi, T., Lowry, P P., Plunkett, G M., & Wen, J (2004) Chromosomal evolution in Araliaceae and close relatives Taxon, 53(4), 987-1005 Yobimoto, K., Matsumoto, K., Huong, N T T., Kasai, R., Yamasaki, K., & Watanabe, H (2000) Suppressive effects of Vietnamese ginseng saponin and its major component majonoside-R2 on psychological stress-induced enhancement of lipid peroxidation in the mouse brain Pharmacology Biochemistry and Behavior, 66(3), 661-665 You, X L., Han, J Y., & Choi, Y E (2007) Plant regeneration via direct somatic embryogenesis in Panax japonicus Plant Biotechnology Reports, 1(1), 5-9 Zhang, D., Li, W., Xia, E H., Zhang, Q J., Liu, Y., Zhang, Y., & Gao, L Z (2017) The medicinal herb Panax notoginseng genome provides insights into ginsenoside biosynthesis and genome evolution Molecular plant, 10(6), 903-907 Zhou, J., Huang, W.-G., Wu, M.-Z., Yang, C.-R., Feng, K.-M., and Wu, Z.-Y (1975) Triterpenoids from Panax Linn and their relationship with taxonomy and geographical distribution Acta Phytotax Sin 13(2): 29–45, plates 6–7 Zhu, S., Fushimi, H., Cai, S., Chen, H., & Komatsu, K (2003) A new variety of the genus Panax from southern Yunnan, China and its nucleotide sequences of 18S ribosomal RNA gene and matK gene Journal of Japanese Botany, 78(2), 86-94 Zimmerman JL (1993) Somatic embryogenesis: a model for early development in higher plants Plant Cell 5: 1411 Zuo, Y., Chen, Z., Kondo, K., Funamoto, T., Wen, J., & Zhou, S (2011) DNA barcoding of Panax species Planta medica, 77(02), 182-187 41 ... PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG LÊ HUỲNH THỊ DIỄM SƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT DÒNG ĐA BỘI VÀ TÁI SINH THỂ ĐA BỘI SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã... việc thiếu liệu sâm Ngọc Linh nói chung chi Panax nói riêng, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phân biệt dòng đa bội tái sinh thể đa bội sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)? ?? Các kết... Thể đa bội đặc điểm thực vật đa bội 1.2.1 Thể đa bội Đa bội thuật ngữ dùng để tế bào mô hay thể sinh vật có số nhiễm sắc thể bội số lớn đơn bội Thể đa bội thể mà tế bào sinh dưỡng có số NST bội