CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá mức đa bội qua các đặc điểm hình thái, khí khổng và lục lạp của sâm Ngọc
Ngọc Linh đã xử lý bằng colchicine
3.1.1. Xác định dịng đa bội thơng qua đặc điểm hình thái lá
Phôi và cây con sâm Ngọc Linh được xử lý bằng colchicine ở các nghiệm thức khác nhau để tạo dòng đa bội. Các dòng sâm Ngọc Linh đa bội sau 24 tuần ni tạo thành cây con hồn chỉnh. Mẫu lá dùng để quan sát các đặc điểm hình thái được thu nhận từ cây con các dòng được tạo đa bội (bảng 2.1.). Thí nghiệm này so sánh sự khác biệt về đặc điểm hình thái lá của mẫu lưỡng bội và mẫu được tạo đa bội qua các chỉ tiêu hình dáng, màu sắc và chỉ số lá (tỷ lệ chiều dài/chiều rộng).
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái lá cây sâm Ngọc Linh đa bội in vitro
Mẫu Chỉ số lá Đặc điểm hình thái lá
DC 3,01 Mép khía răng cưa, đầu lá nhọn, phiến lá màu xanh lục A72 2,18 Mép lá hình răng cưa khơng đều, viền mép màu xanh lục A48 2,41 Mép lá hình răng cưa khơng đều, viền mép màu xanh lục A24 2,26 Mép khía răng cưa khơng đều, viền lá màu xanh lục A12 2,06 Mép khía răng cưa khơng đều, viền lá màu xanh lục A05 2,28 Mép lá hình răng cưa khơng đều, viền mép màu tím A075 2,59 Mép lá hình răng cưa khơng đều, viền mép màu xanh lục
Trong thí nghiệm này, có sự ghi nhận về sự thay đổi về hình dạng và các dữ liệu đo lường hình thái lá của cây đối chứng so với các cây tạo đa bội. So với mép khía hình răng cưa đều, mép và phiến có màu xanh lục của cây đối chứng; mép lá của các mẫu A72, A48, A24, A12, A05, A075 và A1 so le không đều nhau. Sự biến đổi về màu sắc ở viền mép lá cũng được ghi nhận, ở các mẫu A05 và A1 viền mép có màu tím trong khi mẫu đối chứng có viền màu xanh lục (Bảng 3.1.; Hình 3.1.). Chỉ số lá (tỷ lệ chiều dài/chiều rộng phiến lá) của nhóm được tạo đa bội thấp hơn đáng kể so với mẫu đối chứng. Các mẫu tạo đa bội có chỉ số lá dao động từ 1,99 đến 2,59 trong khi chỉ số lá mẫu đối chứng là 3,01 (Bảng 3.1.). Do đó, các kết quả của thí nghiệm hiện tại chỉ ra rằng đa bội hóa, khơng phải là lai ghép, có thể là lý do chính dẫn đến những thay đổi trong hình dạng lá và chỉ số lá.
Tuy nhiên, do hình thái lá là một tính trạng có tính biến dị lớn, thay đổi theo từng cá thể trong một quần thể, trong khi nguồn giống tạo cây đa bội lại đa dạng, nên chỉ số này cũng không ổn định. Nên vì thế chỉ số lá và hình thái lá khơng phải là chỉ tiêu phù hợp nhất để xác định đa bội thể. Sử dụng kích thước lá để xác định thể thể đa bội đã được áp dụng thành công ở P. australis (Paucã-Comãnescu và cs., 1999), Damnacanthus (Naiki và Nagamasu, 2004), và B. macrostachya (Chen và cộng sự, 2009). Nhưng chỉ tiêu này cũng không thành công trong việc xác định thể đa bội ở cây Anthurium andreanum Linden ex André (Winarto và cs., 2010) và cây Spathiphyllum wallisii (Vanstechelman và cs., 2009). Winarto cho rằng đây là phương pháp gián tiếp tệ nhất để xác định mức độ đa bội thể ở cây Anthurium andreanum. Mặc dù hình dạng lá khác nhau về mặt thị giác giữa cây đơn bội, lưỡng bội và tam bội, nhưng khơng có sự khác biệt về tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của lá.
3.1.2. Đánh giá các dòng sâm Ngọc Linh đa bội in vitro qua các đặc điểm mật độ khí khổng và số lượng lục lạp khổng và số lượng lục lạp
Kết quả của nghiên cứu được thực hiện để xác định xem ba chỉ tiêu kích thước khí khổng, mật độ khí khổng và số lượng lục lạp của tế bào biểu bì có thể là tiêu chí hợp lý để xác định mức độ đa bội hay không, được trình bày trong bảng 3.2. Kết quả cho thấy rằng có sự khác nhau về ba chỉ tiêu trên giữa mẫu lưỡng bội (mẫu DC) và mẫu được tạo đa bội. Sự sai khác này cho thấy rằng ba chỉ tiêu trên phù hợp để xác định đa bội thể. Trong đó, số lượng lục lạp trong một tế bào khí khổng là chỉ tiêu tốt nhất, có sự chênh lệch nhiều ở các mẫu, sự chênh lệch này có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Bảng 3.2. Kích thước và mật độ khí khổng và số lượng lục lạp của các mẫu sâm Ngọc
Linh đa bội in vitro. Mẫu Chiều dài (µm) Chiều rộng
(µm) Mật độ khí khổng Số lượng lục lạp DC 26,50a±4,17 22,98a±3,17 15,60c±1,89 25,13e±6,16 A72 26,78a±3,30 26,73a±3,26 13,20c±2,63 35,21cd±6,04 A48 26,83a±3,30 25,00ab±1,76 15,00abc±1,03 48,00a±7,47 A24 26,20a±5,42 23,71b±3,26 12,57bc±2,16 24,97d±9,56 A12 26,99a±3,38 23,77b±2,60 12,60ab±3,05 21,97e±5,40 A05 26,28a±4,09 25,92ab±3,89 11,70a±2,91 36,73bcd±9,11 A075 28,34a±5,25 23,83b±3,62 9,70abc±2,22 42,50ab±8,84 A1 26,54a±3,7 26,17ab±2,85 12,70abc±3,56 39,90bc±7,92
Chú thích: Trong cùng 1 cột những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử tukey
Ở các mẫu sâm được tạo đa bội, chiều dài khí khổng đạt dao động từ 26,20µm±5,42µm đến 28,34µm±5,25 trong khi ở cây lưỡng bội là khoảng 26,50µm±4,17. Đối với khí khổng ở thể lưỡng bội, chiều rộng khí khổng trung bình là khoảng 22,98µm±3,17; trong khi ở thể đa bội dao động trong khoảng 23,71µm±3,26 đến 26,73µm±3,26 (bảng 3.2.; hình 3.2.). Điều này cho thấy rằng kích thước khí khổng ở các mẫu được tạo đa bội là lớn hơn so với mẫu lưỡng bội. Nhưng bảng 3.2. cho thấy khơng có sự sai khác nhiều giữa mẫu lưỡng bội và các mẫu được tạo đa bội. Vì vậy, mặc dù kích thước khí khổng có tăng lên ở các mẫu được tạo đa bội nhưng đây không phải là chỉ tiêu đáng tin cậy để xác định các dòng đa bội ở sâm Ngọc Linh. Bên cạnh đó, Beck (2003) cho
chỉ tiêu đáng tin cậy để xác định thể đơn bội, lưỡng bội và tam bội ở cây hồng môn (Anthurium andreanum Linden ex André).
Sự giảm về mật độ khí khổng tuyến tính với sự gia tăng của kích thước khí khổng. Trong thí nghiệm này, có sự khác nhau về mật độ khí khổng giữa mẫu lưỡng bội và mẫu được tạo đa bội, mặc dù chênh lệch không lớn. Kết quả cho thấy ở mẫu lưỡng bội, mật độ khí khổng trung bình là 15,60±1,89; trong khi các mẫu đa bội có mật độ khí khổng khác nhau từ 9,70±2,22 đến 15,00±1,03 (bảng 3.2.). Số lượng khí khổng giảm do mức độ đa bội tăng đã được quan sát thấy ở Stevia reboudian (Oliveira và cs., 2004), Salvia miltiorrhiza (Gao và cs., 1996), Spathiphyllum wallisii (Vanstechelman và cs., 2009), Tetraploid spathiphyllum (Van Laere và cs., 2010), Miscanthus sinensis và M. sacchariflorus (Rayburn và cs., 2009). Rayburn và cộng sự (2009) đã báo cáo mối tương
quan của kích thước khí khổng với kích thước bộ gen ở M. giganteus, M. sinensis và M. sacchariflorus.
Trong khí khổng của mẫu lưỡng bội, tổng số lục lạp được tìm thấy là 25,13±6,16 nhưng ở thể đa bội thì từ khoảng 21,97±5,40 đến 48,00±7,47. Các mẫu A12 và A24 có số lượng lục lạp trong khí khổng khơng chênh lệch nhiều so với mẫu lưỡng bội. Trong khi đó, các mẫu A05, A075 và A1 được ghi nhận có sự chênh lệch lớn hơn về số lượng lục lạp so với mẫu lưỡng bội. Số lượng lục lạp cao nhất được ghi nhận ở thể đa bội là của mẫu A48 (48,05±5,85) và A72 (43,40±6,45) (bảng 3.2.; hình 3.2.). Sự sai khác về số lượng lục lạp của mẫu đối chứng với các mẫu đa bội được trình bày qua bảng bảng 3.2. là có ý nghĩa (p<0.05). Vì vậy, so với ba chỉ tiêu cịn lại trong nghiên cứu (chỉ số lá, kích thước và mật độ khí khổng), số lượng lục lạp là chỉ tiêu có hiệu quả nhất trong việc xác định thể đa bội ở sâm Ngọc Linh. Trong nghiên cứu của Winarto (1997), Murti (2012) và Ganga, M. (2002), số lượng lục lạp trong một tế bào khí khổng được cho là chỉ tiêu nhanh chóng và chính xác nhất để phân biệt và xác định các dòng đơn bội, lưỡng bội và đa bội với nhau. Vì vậy, kết hợp với kết quả thí nghiệm, các mẫu sâm đa bội là chọn ra là A72, A48, A05, A075 và A1. Mức bội thể cả 5 mẫu sẽ được xác định thông qua phương pháp đếm trực tiếp số lượng NST.
Hình 3.2. Hình thái khí khổng và lục lạp của các mẫu sâm đa bội. (40x) 3.2. Đánh giá mức bội thể của các dòng sâm Ngọc Linh
Nghiên cứu của Hindmarsh (1953) cho thấy colchicine phá hủy thoi vô sắc ở tất cả các giai đoạn phân chia nhiễm sắc thể trong tế bào đang phân chia của chóp rễ và ngăn cản sự hình thành thoi vơ sắc ở tế bào bắt đầu phân chia. Vì vậy khi xử lý, colchicine được hấp thụ vào tế bào đang phân chia làm cho nhiễm sắc thể sau khi phân tách không được đi về hai cực của tế bào và ngăn cản quá trình phân chia tế bào. Kết quả xử lý colchicine sẽ tạo nên tế bào có số nhiễm sắc thể nhiều hơn so với bình thường. Trong nghiên cứu này, số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào chóp rễ của các mẫu được tạo đa bội bằng colchicine ở các nồng độ và thời gian khác nhau được quan sát và đếm.
3.2.1. Xác định thời gian phân bào tối ưu
Việc xác định được khoảng thời gian phân bào tối ưu của lồi có ý nghĩa rất quan trọng trong việc thực hiện tiêu bản kính hiển vi quan sát số lượng và hình thái nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể được quan sát tốt nhất khi đang ở kỳ giữa và kỳ sau của quá trình phân bào ngun nhiễm, khi đó NST đang ở dạng kép và đóng xoắn cực đại. Ở thực vật, mỗi lồi có thời điểm phân bào khác nhau và tùy thuộc vào từng loại mơ phân sinh, vì vậy cần xác định rõ thời điểm phân bào của từng lồi để có thể thực hiện được tiêu bản NST cho kết quả tốt nhất (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008; Trần Tú Ngà, 1982; Fukui và cs., 1991).
Thí nghiệm xác định thời gian phân bào tối ưu của sâm Ngọc Linh được khảo sát trong khoảng thời gian từ 7h30 đến 9h00 trên mẫu mô phân sinh ngọn rễ. Rễ được thu nhận trong vòng 15 phút, 10-20 rễ sẽ được lấy cho mỗi lần thu nhận. Mẫu rễ được cố định bằng
Linh có thời điểm phân bào tối ưu nằm trong khoảng 8h30 đến 8h45 buổi sáng (hình 3.3.; hình 3.4.). Đây là thời điểm cho mật độ tế bào đang phân chia nhiều, có nhiều kỳ khác nhau của quá trình nguyên phân. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác trước đây, khi số lượng tế bào ở kỳ giữa lớn nhất ở thực vật đạt được trong khung thời gian từ 8-9h, 8-10h sáng tùy thuộc vào lồi và mùa vụ (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008; Trần Tú Ngà, 1982).
Hình 3.3. Tế bào sâm Ngọc Linh ở các thời kỳ phân bào nguyên nhiễm.
A-Kỳ trung gian; B-Kỳ đầu; C-Kỳ giữa; D-Kỳ sau; E-Kỳ cuối. (100x)
Hình 3.4. Tỉ lệ tế bào ở kỳ giữa quá trình nguyên phân theo các mốc thời gian khác nhau
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sốc nhược trương đến sự phân tán NST sâm Ngọc Linh đa bội in vitro Ngọc Linh đa bội in vitro
Xử lý nhược trương tế bào là giai đoạn đóng vai trị quan trọng trong việc tạo ra tiêu bản nhiễm sắc thể có chất lượng cao. Nếu một tế bào sống được đặt trong mơi trường nhược trương thì áp suất thẩm thấu sẽ làm các phân tử nước di chuyển vào trong tế bào, có thể
0 10 20 30 40 50 60 % Tế b ào ở KG, KS NP
làm tế bào trương lên và vỡ ra. Đối với các tế bào thực vật hoặc các lồi có thành tế bào vững chắc khác, các tế bào có thể giữ được hình dạng của nó trong mơi trường nhược trương. Dung dịch sốc nhược trương với nồng độ và thời gian xử lý phù hợp giúp tế bào trương phồng lên đến mức độ vừa đủ, giúp NST ở kỳ giữa phân tán, không xếp chồng lên nhau. Do đó, trong thí nghiệm này, chúng tơi xử lý nhược trương tế bào bằng dung dịch muối kali clorua (KCl) ở các nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,3% và 0,4% trong 45 phút trước khi cố định. Kết quả thu nhận được NST phân tán đều, rõ hình thái và số lượng nhất ở nghiệm thức xử lý bằng dung dịch KCl 0,2%.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ kali clorua dùng để sốc nhược trương tế bào
Nồng độ KCl ĐC (0%) 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Hình dạng tế bào Tế bào vỡ nhiều Tế bào trương lên, nhiều tế bào bị vỡ Tế bào trương lên đúng mức Tế bào trương lên chưa đúng mức Tế bào trương lên đúng mức Độ phân tán NST NST bị lạc, không tập trung thành từng cụm NST không phân tán NST phân tán đều NST phân tán cịn chồng lên nhau NST khơng phân tán
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sốc nhược trương đến sự phân tán NST sâm
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhược trương tế bào với dung dịch muối KCl 0,1%; KCl 0,3%; KCl 0,4% chưa hiệu quả, các tế bào trương lên nhưng chưa đủ để các NST dàn trải gây khó khăn trong việc quan sát hình thái và đếm số lượng NST. Xử lý nhược trương tế bào sâm Ngọc Linh bằng KCl 0,2% cho kết quả tốt nhất; hầu hết các tế bào trương lên và NST phân tán đều trong tế bào, có thể thấy rõ hình thái và đếm được số lượng NST. Dung dịch cố định khơng gây nhược trương tế bào nhưng NST có phân tán, mặc dù có thể quan sát và đếm được số lượng nhưng kết quả sẽ khơng có độ chính xác cao do hầu hết tế bào bị vỡ gây thất lạc NST.
Thời gian sốc nhược trương cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phân tán đồng đều NST. Cần đảm bảo đủ thời gian của giai đoạn sốc nhược trương sao cho tế bào căng phồng ở mức độ vừa đủ. Nếu sốc nhược trương quá mức, các tế bào sẽ vỡ sớm, NST sẽ bị lạc. Ngược lại, sốc nhược trương không đủ sẽ dẫn đến các NST chồng chéo lên nhau, gây khó khăn trong việc đếm chính xác số lượng. Trong thí nghiệm này, chúng tơi xử lý nhược trương tế bào sâm Ngọc Linh trong 45 phút dựa theo kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thanh Phương (2012). Kết quả xử lý cho thấy hầu hết các tế bào khi xử lý nhược trương trong 45 phút đều trương đúng mức, không bị vỡ và các NST phân tán đều.
Vì vậy, nồng độ dung dịch sốc nhược trương KCl 0,2% và nhược trương tế bào trong 45 phút là hai nghiệm thức được dùng để phân tán NST các mẫu đa bội (A72, A48, A05, A75, A1) dưới đây
3.2.3. Số lượng NST của sâm Ngọc Linh
Số lượng NST của sâm Ngọc Linh thông qua việc đếm dựa trên 30 tế bào là 2n=22,05±1,76 ở bộ lưỡng bội. Nhiễm sắc thể được biết đến đối với các lồi trong chi Panax hầu hết có số lượng cơ bản là x=12 (Yi và cs., 2004). Bên cạnh đó, phân tích phát sinh lồi với các hệ gen lục lạp được báo cáo cho thấy bốn lồi Panax được nhóm trong cùng một chi và P. vietnamensis có quan hệ họ hàng gần với P. notoginseng hơn P. ginseng và P. quinquefolius (Manzanilla và cs., 2018; Nguyen Binh và cs., 2017). Nghiên cứu khác của Zhu (2003) và Phan Kế Long và cs. (2014) đã chỉ ra rằng, hai thứ sâm Lai Châu (P.
vietnamensis var. fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha Grushv. var.
vietnamensis) của loài sâm Việt (P. vietnamensis Ha et Grushv.) có quan hệ chị em. Mặc khác, bộ NST lưỡng bội ở P. vietnamensis var. fuscidiscus và P. notoginseng đã được xác định là 2n = 24 (Zhang và cs., 2017; Zhu và cs., 2003). Vì vậy, với những dữ liệu trên, kết hợp với kết quả thí nghiệm, số lượng NST của sâm Ngọc Linh ở thể lưỡng bội là 2n = 24.
Hình 3.6. Số lượng NST sâm Ngọc Linh ở bộ lưỡng bội.(100x)
3.2.4. Mức đa bội thể của các dòng sâm Ngọc Linh đa bội in vitro
Mức bội thể của các dòng đa bội trong nghiên cứu này được xác định thông qua việc đếm số lượng NST trong tế bào và so sánh với số lượng NST của sâm Ngọc Linh ở bộ lưỡng bội.
Hình 3.7. Số lượng NST ở các mẫu sâm Ngọc Linh đa bội.
Bảng 3.4. Số lượng NST của các dòng sâm đa bội.
Số lượng NST Mức đa bội thể
DC 22,05± 1,76 2n A72 34,62+1,7 3x A48 33,2+2,31 3x A12 21,35 ± 2,13 2x A24 22,55 ± 1,02 2x A05 34,7±1,61 3x A75 33,46±2,4 3x A1 22,05±1,76 -
Số lượng NST cơ bản của chi Panax trong họ Cuồng Cuồng là x=12, kết hợp số lượng