CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đầu vào đến sự phát sinh mô sẹo của cây sâm Ngọc
Ngọc Linh đa bội nuôi cấy in vitro
Mô sẹo phát triển khơng theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phơi để có thể hình thành cây hồn chỉnh. Hai điều kiện căn bản cho sự tạo mô sẹo là cây non và phần non cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện ni cấy in vitro, dưới
cytokinin. Trong thí nghiệm này, các mẫu lá và cuống lá từ các dòng sâm Ngọc Linh đa bội in vitro được cấy sang mơi trường MS có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng 2,4-D và NAA theo tỷ lệ 1:1, nhằm theo dõi sự ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng tái sinh mô sẹo của sâm. Kết quả thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo và số lượng mơ sẹo hình thành trong cùng điều kiện ni cấy từ 2 nguồn mẫu là lá và cuống lá là hoàn toàn khác nhau.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, mẫu lá tái sinh mơ sẹo lâu nhất, sau 7-8 tuần để đạt tỷ lệ là 100%. Trong đó, mẫu có sự cảm ứng nhanh nhất là 72L và 05L sau 4 tuần nuôi cấy, lá bắt đầu phồng lên, dày ra do có sự hấp thu nước, sau 6 tuần thì bắt đầu hình thành mơ sẹo rất nhiều. Hầu hết các mẫu đều cho mô sẹo xốp, màu trắng trong và mọng nước.
Mẫu cuống lá cho kết quả phát sinh mô sẹo tốt nhất, tỷ lệ phát sinh đạt 100% sau 3- 4 tuần. Trong 3 tuần đầu nuôi cấy, tất cả các mẫu đều cảm ứng với môi trường và tạo thành mô sẹo. Mô sẹo thu được ở trạng thái xốp, mọng nước, có màu trắng trong. Riêng mẫu 1C và 72C có sự hình thành phơi soma ở tuần ni thứ 8, phơi ở dạng hình cầu và có kích thước nhỏ.
Bảng 3.5. Sự phát sinh mô sẹo của nguồn mẫu lá, cuống lá sâm Ngọc Linh đa bội in vitro
sau 8 tuần nuôi cấy. Nguồn mẫu Tỷ lệ phát sinh
mô sẹo (%)
Đặc điểm hình thái Lá 72L 100 Mô sẹo xốp, màu trắng trong, rời rạc
48L 100 Mô sẹo xốp, mọng nước, màu trắng trong 05L 100 Mô sẹo xốp, mọng nước, màu trắng trong 075L 100 Mô sẹo xốp, màu trắng trong
1L 100 Mô sẹo màu trắng trong, tăng sinh yếu Cuống
lá
72C 100 Mô sẹo xốp, mọng nước, màu vàng ngà 48C 100 Mô sẹo xốp, mọng nước, màu trắng trong, rời
rạc
05C 100 Mô sẹo xốp, mọng nước, màu trắng trong, rời rạc
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc
Linh đa bội in vitro. L1-L4. Sự tăng sinh mô sẹo của mẫu lá tương ứng qua 1 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuôi; CL1-CL4. Sự tăng sinh mô sẹo của mẫu cuống lá tương ứng
qua 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần và 8 tuần nuôi.
Sự tạo mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô cấy và auxin. Thông thường; 2,4-D và NAA thường được sử dụng làm nguồn auxin ngoại sinh cho sự hình thành mơ sẹo ở các lồi thực vật (Dixon and Gonzales, 1994; Hsia and Korbam, 1996). Các mẫu trong thí nghiệm này được cấy vào mơi trường có NAA; 2,4-D hầu hết đều có hiện tượng hóa nâu trong vài tuần đầu tại vị trí vết thương, có thể do tinh dầu trong lá tiết ra gây nên hiện tượng này. Tuy nhiên, sau vài tuần ni cấy, do tác động của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật, mơ sẹo bắt đầu hình thành từ vị trí vết thương, sau đó các tế bào mô sẹo phát triển
mạnh tạo thành khối. Mơ thực vật khi bị tổn thương ln có khuynh hướng làm lành vết thương bằng cách phản phân hóa các tế bào để phân chia tạo các tế bào khác che lấp vùng bị tổn thương. Nhờ có chất điều hịa sinh trưởng thực vật, các tế bào này được thúc đẩy phát triển nhanh hơn.
Sự kết hợp của hai loại auxin trong q trình cảm ứng mơ sẹo cũng đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. Trên cây Thu thảo kê (Pogonatherum paniceum) khi bổ sung kết hợp 2,4-D và NAA với các nồng độ khác nhau, mẫu cấy cũng cảm ứng và tạo thành mơ sẹo có hình thái khác nhau; bên cạnh sự xuất hiện của các mô sẹo “xốp”, mềm, màu trắng xanh hay vàng nhạt cịn có các mơ sẹo cứng, chắc, màu vàng đậm (Wang và cs., 2008). Ở cây Ngũ trảo (Vitex negundo) khi bổ sung 2,4-D kết hợp với NAA ở nồng độ thấp (dưới 1,0 mg/l) tạo thành mô sẹo bở, màu trắng; nồng độ 2,4-D và NAA khoảng 1,0 mg/l - 2,0 mg/l mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo “xốp”, bở, mọng nước, màu trắng. Khi bổ sung ở nồng độ NAA và 2,4-D cao hơn 2,0 mg/l mơ sẹo hình thành bở, có màu vàng hoặc trắng xanh (Chowdhury và cs.,2011). Trong nước, mô lá sâm đã được một số tác giả sử dụng như vật liệu ban đầu để nghiên cứu tạo mô sẹo với kết quả tốt (Nhut và cs., 2011; Dương Tấn Nhựt và cs., 2009; Dương Tấn Nhựt và cs., 2010); có nghiên cứu dùng mơ củ (Nguyễn Thị Liễu và cs., 2011; Nguyễn Trung Thành và cs., 2007; Trần Thị Liên và cs., 2009), mô cuống lá (Dương Tấn Nhựt và cs., 2009), mơ rễ chính (main root) cây cấy mơ (Nhut và cs., 2012) để tạo nguồn vật liệu mơ sẹo.
Sự phát sinh mơ sẹo trong thí nghiệm này cho kết quả hồn tồn phù hợp với nghiên cứu của Trung tâm Sâm từ năm 1984 trên đối tượng sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu của Nguyễn Thượng Dong cho thấy mẫu lá có gân chính hình thành mơ sẹo trong 3 - 4 tuần với tỷ lệ 100%, rễ hình thành trong 1 - 2 tuần với tỷ lệ 96,76% và thân phát sinh trong 4 tuần với tỷ lệ 100%. (Nguyễn Thượng Dong và cs., 2007). Đặc điểm hình thái mơ sẹo trong thí nghiệm này cũng tương ứng với kết quả nghiên cứu của Lê Kim Cương và cộng sự, mẫu cấy cuống lá sâm Ngọc Linh được cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” tốt nhất trên mơi trường khống MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA (Lê Kim Cương và cs., 2012). Như vậy, trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh đa bội, tỷ lệ cảm ứng tạo thành mơ sẹo và hình thái mơ sẹo khơng có nhiều sự khác biệt so mới cây sâm Ngọc Linh lưỡng bội khi cùng nuôi cấy trên mơi trường có bổ sung 2,4-D và NAA với tỷ lệ 1:1.