CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sự phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo
Phơi vơ tính có nhiều đặc tính tốt trong cơng tác nhân giống các cây trồng quan trọng. Nhân giống bằng con đường phát sinh phơi cho thấy có nhiều thuận lợi hơn so với con
hình thành và phát triển lớn dần nhờ hoạt động phân chia diễn ra liên tục của các tế bào sinh phôi nằm trong các khối tiền phôi.
Bonnelle cho rằng với sự hiện diện của auxin, q trình methyl hóa DNA xảy ra và gây ra sự kết thúc hoặc làm thay đổi chương trình biểu hiện gen của tế bào. Quan trọng hơn, các tế bào này cần phải tách khỏi sự kiểm soát của các tế bào xung quanh và cần được phóng thích khỏi cụm mơ sẹo. Các tế bào đã được cảm ứng trong cụm có thể tách khỏi các tế bào xung quanh bằng cách cắt đứt cầu sinh chất hoặc do sự chết của những mô xung quanh, làm gián đoạn tương tác tế bào-tế bào. Từ đó, kết thúc chương trình biểu hiện gen đã có sẵn và thiết lập chương trình phát sinh phơi (Bonnelle và cs., 1990). Auxin có vai trị quan trọng cả trong cảm ứng sinh phôi lẫn trong sự phát sinh hình thái phơi. Với sự có mặt của auxin, các cấu trúc tiền phơi (PEM, pro embryonic mass) có các biểu hiện gen cần thiết để hoàn tất giai đoạn phơi hình cầu (Zimmerman, 1993). Vì vậy, trong thí nghiệm này, tiếp tục nuôi cấy khối mơ sẹo trên mơi trường MS có bổ sung NAA và 2,4-D với tỷ lệ 1:1 để quan sát và đánh giá quá trình hình thành phơi soma ở các nguồn mẫu cấy khác nhau.
Bảng 3.6. Thời gian phát sinh phôi soma thông qua mô sẹo
Mẫu Thời gian (tuần)
10 11 12 13 14 15 16 17 18 Lá 72L - - - - - - + + + 48L - - - - - - - - + 05L - - - - - - + + + 075L - - - - + + + + + 1L - - - - - - + + + Cuống lá 72C + + + + + + + + + 48C - - - - - + + + + 05C - - - - - - + + + 075C - + + + + + + + + 1C + + + + + + + + +
Bảng 3.7. Sự phát sinh phôi soma của nguồn mẫu lá, cuống lá sâm Ngọc Linh đa bội in
Mẫu Tỉ lệ phôi soma (%)
Phôi soma/mẫu cấy
Đặc điểm phôi
Lá 72L 50,2±2,82 2,33±0,82 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, màu vàng nhạt, trơn bóng, kích thước nhỏ, số lượng ít
48L 50,94±3,63 3,33±1,37 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, màu vàng nhạt, trơn bóng
05L 53,33±1,76 3,92±1,88 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, có màu vàng
075L 63,33±4,71 3,63±0,53 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu và thủy lơi, có màu vàng
1L 53,57±5,05 5,67±4,71 Cụm phơi soma hình cầu, trơn bóng, có màu vàng nhạt và xanh nhạt Cuống
lá
72C 62,5±2,5 5,75±1,5 Có phát sinh rễ; phơi hình cầu và lá mầm, có màu vàng
48C 66,67±2,89 5,17±1,41 Có phát sinh rễ; phơi hình cầu và thủy lơi, có màu vàng nhạt và trơn bóng
05C 50,45±2,5 3,01±0,67 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, có màu vàng
075C 63,33±4,17 3,67±1,89 Có phát sinh rễ; phơi hình cầu và thủy lơi, có màu vàng nhạt
1C 75,1±2,55 5,67±2,51 Có phát sinh rễ; phơi soma hình cầu, hình thuỷ lơi và hình lá mầm, có màu vàng nhạt
Ghi chú: Giá trị phôi/mẫu cấy là tổng số phơi ở các hình dạng như cầu, thuỷ lơi và lá mầm. Đánh giá được thực hiện sau 18 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D
và NAA với tỷ lệ 1:1.
Kết quả sau 18 tuần nuôi cấy cho thấy ở các nguồn mẫu lá và cuống lá khác nhau cho tỷ lệ cảm ứng tạo phôi khác nhau. Hầu hết các mẫu đều cho sự phát sinh rễ bất định trong
Các tế bào mô sẹo tiếp tục tăng sinh về kích thước, có nhiều hình dạng khác nhau được sắp xếp lỏng lẻo và phân chia theo nhiều hướng khác nhau ở tuần thứ 8. Nhưng bắt đầu ở tuần thứ 14, mẫu 075L có các khối mơ sẹo bắt đầu chuyển từ màu trắng trong sang vàng nhạt, bề mặt trở nên trơn bóng và bắt đầu hình thành các cấu trúc hình cầu nhỏ li ti. Các cấu trúc nhỏ này có màu vàng đậm hơn so với khối tế bào mô sẹo xung quanh, được Halperin (1970) gọi là PEM. Những cấu trúc PEM này thường định vị ở vùng ngoại vi và thường nằm rải rác trên khối mô sẹo. Sự biến đổi cấu trúc PEM sang các dạng khác của phơi soma như hình cầu rõ rệt và hình thủy lơi được ghi nhận sớm nhất ở mẫu 075L.
Nguồn mẫu cuống lá nhìn chung có thời gian phát sinh phôi soma sớm hơn, tỷ lệ phôi soma tạo thành và số phôi/ mẫu lớn hơn so với nguồn mẫu lá. Phơi soma được hình thành sớm nhất ở mẫu cuống lá 1C và 72C chỉ sau 8 tuần ni cấy tạo mơ sẹo, phơi có dạng hình cầu và trơn nhẵn phát triển riêng lẻ trên bề mặt khối mô sẹo. Sau 18 tuần nuôi, mô phôi soma ở các mẫu cuống lá được nhận thấy có sự phân hóa về thái tốt nhất, thường ở dạng khối cầu, một số phơi ở trạng thái phân hóa cao hơn với lá mầm, thân phơi có hình dạng đặc trưng hơn (hình 3.9.). Nhìn chung, sau 16 tuần, tất cả các mẫu đề có sự xuất hiện của phôi cầu, các thể phơi cầu đi vào trạng thái biệt hóa có bề mặt trơn láng, khác với các khối mô sẹo thường gặp trong nhiều trường hợp cũng ở dạng cầu nhưng có bề mặt “sần sùi”. Khi được tiếp tục ni, các phơi cầu dần hình thành phát thể lá mầm. Sự tăng trưởng về chiều cao của các mầm lá mầm bao xung quanh trục phơi tạo ra phơi hình thủy lơi ở các mẫu 48C, 075C và 1C. Phôi soma ở dạng hai lá mầm xuất hiện ở các mẫu 72C và 1C sau 18 tuần ni cấy mơ sẹo, phơi có màu vàng nhạt và lá mầm kích thước nhỏ.
Trong cùng thời gian và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ phát sinh phôi và số lượng phôi soma ở hai nguồn mẫu cấy lá và cuống lá là khác nhau. Tỉ lệ phát sinh phôi cao nhất ở nguồn mẫu cuống lá 1C (75,1%±2,55), và thấp nhất ở nguồn mẫu lá 72L (50,2%±2,82). Số lượng phơi soma hình thành trên một mẫu cấy ở nguồn mẫu cuống lá là cao hơn so với nguồn mẫu lá. Mẫu 72C cho số lượng phôi soma nhiều nhất (5,75±1,5 phôi/mẫu cấy), ngược lại mẫu 72L có số lượng phơi được hình thành thấp nhất (2,33±0,82 phơi/mẫu cấy).
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sự phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh đa bội
in vitro. L1-L4: Sự phát sinh phôi soma của mẫu lá tương ứng qua 10 tuần, 12 tuần, 14
tuần, 16 tuần và 18 tuần nuôi; CL1-CL4: Sự tăng sinh mô sẹo của mẫu cuống lá tương ứng qua 10 tuần, 12 tuần, 14 tuần, 16 tuần và 18 tuần ni.
Trong thí nghiệm này, khơng có sự bất thường nào về hình thái của phơi được ghi nhận. Chất lượng hình thái phơi vơ tính có ảnh hưởng đến khả năng phát triển thành cây con hồn chỉnh. Những phơi có định hướng lưỡng cực rõ ràng, có lá mầm đầy đủ và có trục phơi phát triển hoàn chỉnh dễ dàng phát triển thành cây con hơn so với những phôi bất thường (Lazzeri và cs., 1987; Hartweck và cs., 1988; Rodriguez và Wetzstein, 1994). Phôi vơ tính được nghiên cứu trên nhiều lồi, đối với chi Panax, phương pháp tạo phơi vơ tính đã được nghiên cứu nhiều trên các loài P. ginseng (Tang và cs., 2000; Arya và cs., 1993);
P. japonicus (You và cs., 2007); P. quinquefolius (Zhou và cs., 2005). Phơi vơ tính cây
Phơi vơ tính P. ginseng được tạo ra từ lá mầm trên mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D kết hợp 0,1 mg/l BA (Tang và cs., 2000).
Kết quả thí nghiệm này cho thấy cuống lá là nguồn mẫu phù hợp dùng để cảm ứng mơ sẹo và phát sinh phơi soma. Nhưng khơng có sự chênh lệch quá khác biệt về hình thái, tỷ lệ tạo phơi và số phơi hình thành trên mẫu cấy của 2 nguồn mẫu này. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trong nước về phơi vơ tính sâm Ngọc Linh, mẫu lá được cho là nguồn vật liệu nuôi cấy tốt nhất (Mai Trường và cs., 2014; Vũ Thị Hiền và cs., 2014; Bùi Văn Thế Vinh và cs., 2014; ). Điều này gây mâu thuẫn trong việc lựa chọn nguồn mẫu nuôi cấy cây sâm Ngọc Linh đa bội in vitro. Vì vậy, để có được kết luận chính xác hơn về ảnh ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh phôi soma cây sâm Ngọc Linh đa bội in vitro, cần phải tiếp tục theo dõi sự phát sinh hình thái và các chỉ tiêu đánh giá phôi soma của các nguồn mẫu trong thời gian tới.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ