CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Đánh giá mức bội thể của các dòng sâm Ngọc Linh
Nghiên cứu của Hindmarsh (1953) cho thấy colchicine phá hủy thoi vô sắc ở tất cả các giai đoạn phân chia nhiễm sắc thể trong tế bào đang phân chia của chóp rễ và ngăn cản sự hình thành thoi vô sắc ở tế bào bắt đầu phân chia. Vì vậy khi xử lý, colchicine được hấp thụ vào tế bào đang phân chia làm cho nhiễm sắc thể sau khi phân tách không được đi về hai cực của tế bào và ngăn cản quá trình phân chia tế bào. Kết quả xử lý colchicine sẽ tạo nên tế bào có số nhiễm sắc thể nhiều hơn so với bình thường. Trong nghiên cứu này, số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào chóp rễ của các mẫu được tạo đa bội bằng colchicine ở các nồng độ và thời gian khác nhau được quan sát và đếm.
3.2.1. Xác định thời gian phân bào tối ưu
Việc xác định được khoảng thời gian phân bào tối ưu của loài có ý nghĩa rất quan trọng trong việc thực hiện tiêu bản kính hiển vi quan sát số lượng và hình thái nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể được quan sát tốt nhất khi đang ở kỳ giữa và kỳ sau của quá trình phân bào nguyên nhiễm, khi đó NST đang ở dạng kép và đóng xoắn cực đại. Ở thực vật, mỗi loài có thời điểm phân bào khác nhau và tùy thuộc vào từng loại mô phân sinh, vì vậy cần xác định rõ thời điểm phân bào của từng loài để có thể thực hiện được tiêu bản NST cho kết quả tốt nhất (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008; Trần Tú Ngà, 1982; Fukui và cs., 1991).
Thí nghiệm xác định thời gian phân bào tối ưu của sâm Ngọc Linh được khảo sát trong khoảng thời gian từ 7h30 đến 9h00 trên mẫu mô phân sinh ngọn rễ. Rễ được thu nhận trong vòng 15 phút, 10-20 rễ sẽ được lấy cho mỗi lần thu nhận. Mẫu rễ được cố định bằng
Linh có thời điểm phân bào tối ưu nằm trong khoảng 8h30 đến 8h45 buổi sáng (hình 3.3.; hình 3.4.). Đây là thời điểm cho mật độ tế bào đang phân chia nhiều, có nhiều kỳ khác nhau của quá trình nguyên phân. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác trước đây, khi số lượng tế bào ở kỳ giữa lớn nhất ở thực vật đạt được trong khung thời gian từ 8-9h, 8-10h sáng tùy thuộc vào loài và mùa vụ (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008; Trần Tú Ngà, 1982).
Hình 3.3. Tế bào sâm Ngọc Linh ở các thời kỳ phân bào nguyên nhiễm. A-Kỳ trung gian; B-Kỳ đầu; C-Kỳ giữa; D-Kỳ sau; E-Kỳ cuối. (100x)
Hình 3.4. Tỉ lệ tế bào ở kỳ giữa quá trình nguyên phân theo các mốc thời gian khác nhau
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sốc nhược trương đến sự phân tán NST sâm Ngọc Linh đa bội in vitro Ngọc Linh đa bội in vitro
Xử lý nhược trương tế bào là giai đoạn đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra tiêu bản nhiễm sắc thể có chất lượng cao. Nếu một tế bào sống được đặt trong môi trường nhược trương thì áp suất thẩm thấu sẽ làm các phân tử nước di chuyển vào trong tế bào, có thể
0 10 20 30 40 50 60 % Tế b ào ở KG, KS NP
làm tế bào trương lên và vỡ ra. Đối với các tế bào thực vật hoặc các loài có thành tế bào vững chắc khác, các tế bào có thể giữ được hình dạng của nó trong môi trường nhược trương. Dung dịch sốc nhược trương với nồng độ và thời gian xử lý phù hợp giúp tế bào trương phồng lên đến mức độ vừa đủ, giúp NST ở kỳ giữa phân tán, không xếp chồng lên nhau. Do đó, trong thí nghiệm này, chúng tôi xử lý nhược trương tế bào bằng dung dịch muối kali clorua (KCl) ở các nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,3% và 0,4% trong 45 phúttrước khi cố định. Kết quả thu nhận được NST phân tán đều, rõ hình thái và số lượng nhất ở nghiệm thức xử lý bằng dung dịch KCl 0,2%.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ kali clorua dùng để sốc nhược trương tế bào Nồng độ KCl ĐC (0%) 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% Hình dạng tế bào Tế bào vỡ nhiều Tế bào trương lên, nhiều tế bào bị vỡ Tế bào trương lên đúng mức Tế bào trương lên chưa đúng mức Tế bào trương lên đúng mức Độ phân tán NST NST bị lạc, không tập trung thành từng cụm NST không phân tán NST phân tán đều NST phân tán còn chồng lên nhau NST không phân tán
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sốc nhược trương đến sự phân tán NST sâm Ngọc Linh.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhược trương tế bào với dung dịch muối KCl 0,1%; KCl 0,3%; KCl 0,4% chưa hiệu quả, các tế bào trương lên nhưng chưa đủ để các NST dàn trải gây khó khăn trong việc quan sát hình thái và đếm số lượng NST. Xử lý nhược trương tế bào sâm Ngọc Linh bằng KCl 0,2% cho kết quả tốt nhất; hầu hết các tế bào trương lên và NST phân tán đều trong tế bào, có thể thấy rõ hình thái và đếm được số lượng NST. Dung dịch cố định không gây nhược trương tế bào nhưng NST có phân tán, mặc dù có thể quan sát và đếm được số lượng nhưng kếtquả sẽ không có độ chính xác cao do hầu hết tế bào bị vỡ gây thất lạc NST.
Thời gian sốc nhược trương cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phân tán đồng đều NST. Cần đảm bảo đủ thời gian của giai đoạn sốc nhược trương sao cho tế bào căng phồng ở mức độ vừa đủ. Nếu sốc nhược trương quá mức, các tế bào sẽ vỡ sớm, NST sẽ bị lạc. Ngược lại, sốc nhược trương không đủ sẽ dẫn đến các NST chồng chéo lên nhau, gây khó khăn trong việc đếm chính xác số lượng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi xử lý nhược trương tế bào sâm Ngọc Linh trong 45 phút dựa theo kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thanh Phương (2012). Kết quả xử lý cho thấy hầu hết các tế bào khi xử lý nhược trương trong 45 phút đều trương đúng mức, không bị vỡ và các NST phân tán đều.
Vì vậy, nồng độ dung dịch sốc nhược trương KCl 0,2% và nhược trương tế bào trong 45 phút là hai nghiệm thức được dùng để phân tán NST các mẫu đa bội (A72, A48, A05, A75, A1) dưới đây
3.2.3. Số lượng NST của sâm Ngọc Linh
Số lượng NST của sâm Ngọc Linh thông qua việc đếm dựa trên 30 tế bào là 2n=22,05±1,76 ở bộ lưỡng bội. Nhiễm sắc thể được biết đến đối với các loài trong chi Panax hầu hết có số lượng cơ bản là x=12 (Yi và cs., 2004). Bên cạnh đó, phân tích phát sinh loài với các hệ gen lục lạp được báo cáo cho thấy bốn loài Panax được nhóm trong cùng một chi và P. vietnamensis có quan hệ họ hàng gần với P. notoginseng hơn P. ginseng
và P. quinquefolius (Manzanilla và cs., 2018; Nguyen Binh và cs., 2017). Nghiên cứu khác
của Zhu (2003) và Phan Kế Long và cs. (2014) đã chỉ ra rằng, hai thứ sâm Lai Châu (P.
vietnamensis var. fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha Grushv. var.
vietnamensis) của loài sâm Việt (P. vietnamensis Ha et Grushv.) có quan hệ chị em. Mặc khác, bộ NST lưỡng bội ở P. vietnamensis var. fuscidiscus và P. notoginseng đã được xác định là 2n = 24 (Zhang và cs., 2017; Zhu và cs., 2003). Vì vậy, với những dữ liệu trên, kết hợp với kết quả thí nghiệm, số lượng NST của sâm Ngọc Linh ở thể lưỡng bội là 2n = 24.
Hình 3.6. Số lượng NST sâm Ngọc Linh ở bộ lưỡng bội.(100x)
3.2.4. Mức đa bội thể của các dòng sâm Ngọc Linh đa bội in vitro
Mức bội thể của các dòng đa bội trong nghiên cứu này được xác định thông qua việc đếm số lượng NST trong tế bào và so sánh với số lượng NST của sâm Ngọc Linh ở bộ lưỡng bội.
Hình 3.7. Số lượng NST ở các mẫu sâm Ngọc Linh đa bội.
Bảng 3.4. Số lượng NST của các dòng sâm đa bội. Số lượng NST Mức đa bội thể
DC 22,05± 1,76 2n A72 34,62+1,7 3x A48 33,2+2,31 3x A12 21,35 ± 2,13 2x A24 22,55 ± 1,02 2x A05 34,7±1,61 3x A75 33,46±2,4 3x A1 22,05±1,76 -
Số lượng NST cơ bản của chi Panax trong họ Cuồng Cuồng là x=12, kết hợp số lượng NST của sâm là 2n=24 cho thấy các mẫu A72, A48, A05, A075 trong nghiên cứu này là thể tam bội (2n=3x=36). Mẫu A12 và A24 không sự sai khác nhiều về lượng NST so với mẫu với mẫu đối chứng (2n=2x=24), kết hợp với kết quả đếm số lượng lục lạp trong tế bào khí khổng cho thấy hai mẫu này được tạo đa bội không thành công, tế bào vẫn ở dạng lưỡng bội. Riêng mẫu A1, kết quả đến số lượng lục lạp cho thấy đây là thể đa bội, nhưng kết quả đếm NST là 2n=2x=24. Khi xử lý colchicine tạo thể đa bội, có thể xuất hiện trường hợp A1 là thể khảm, mô lá có thể là 3x trong khi mô rễ là 2x.
Kết hợp với các chỉ tiêu đánh giá đa bội thể ở các thí nghiệm trước, chỉ tiêu xác định số lượng NST và số lượnglục lạp là chính xác nhất để sàng lọc và tuyển chọn các dòng đa bội ở sâm trong nghiên cứu này. Kết quả này phù hợp với kết luận của Winato (2010) trong nghiên cứu về các phương pháp sàng lọc cây Hồng môn đơn bội (Winarto và cs., 2010).