Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv) bằng chỉ thị phân tử est ssr phục vụ cho công tác chọn giống

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG NGUYỄN YẾN VY Đà Nẵng, năm 2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Ngành : Cơng nghệ sinh học Khố : 2018-2022 Sinh viên : Nguyễn Yến Vy Người hướng dẫn : TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú Đà Nẵng, năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Sinh viên Nguyễn Yến Vy i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực cố gắng thân, nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều tập thể cá nhân Trước hết xin bày tỏ lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa thầy, cô khoa Sinh- Môi trường môi trường Trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng, Ban lãnh đạo cán Bộ môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ có nhiều ý kiến quý báu giúp tơi xây dựng hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Minh Lý TS Đinh Xuân Tú tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu suốt q trình tơi nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đà Nẵng, ngày tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Yến Vy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv TÓM TẮT v MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sâm Ngọc Linh 1.1.1 Đặc điểm phân bố 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Giá trị dược liệu sâm Ngọc Linh 1.2 Chỉ thị phân tử 1.2.1 Khái niệm đặc điểm 1.2.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) 1.2.3 Expressed Sequence Tag (EST) 1.3 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Ngọc Linh thị phân tử 10 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu phạm vi nghiên cứu 14 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu Sâm Ngọc Linh 17 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 17 2.2.3 Phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) 19 2.2.4 Kỹ thuật điện di 20 2.2.5 Phương pháp phân tích kết xử lý số liệu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi EST- SSR 21 3.2 Kết xác định allen đa hình DNA số PIC thị EST- SSR nghiên cứu 22 3.3 Thiết lập mối quan hệ di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 32 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp Base pair CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic Acid ISSR Inter- Simple Sequence Repeat Kb Kilobase pair PCR Polymerase chain reaction PIC Polymorphism Information Content RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris-acetate EDTA TE Tris-EDTA iv TÓM TẮT Khảo sát đánh giá đa dạng di truyền trồng có vai trị quan trọng việc thu thập, bảo tồn nguồn gen chọn tạo giống Ở giống Sâm Ngọc Linh, số giống có đặc điểm hình thái gần giống hệt, có vài khác biệt nhỏ, thường dẫn đến nhầm lẫn đánh giá nguồn gen cấp độ loài Trong nghiên cứu này, thị EST- SSR sử dụng để phân tích đa dạng di truyền cấp độ phân tử 15 mẫu Sâm Ngọc Linh Kết nghiên cứu 29 thị EST- SSR, có 26 thị biểu đa hình, khuếch đại 121 allen, trung bình thị cho 4,17 allen, thị L149 khuếch đại nhiều 11 allen, thị Mr2U1, PVM129, VES17 với allen đơn hình 15 mẫu Sâm Ngọc Linh với 29 thị EST- SSR có hệ số PIC dao động từ 0.36 đến 0.9, trung bình 0,57; 68,97% thị có số PIC > 0,5 (20/29 thị) có khác biệt lớn tỉ lệ đa hình Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43-0,88 Ở mức độ tương đồng di truyền 0,68 phân chia 15 mẫu Sâm Ngọc Linh thành nhóm chính, có mức độ tương đồng di truyền dao động từ 0,54 đến 0,88 Nhóm I: gồm mẫu S1 Nhóm II: gồm mẫu S2, S3, S4, S15, S5, S6 Nhóm III: gồm mẫu S7, S8, S9, S10, S12 Nhóm IV: gồm mẫu S11, S13 S14 Trong 15 mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu, chọn 66 cặp mẫu Sâm Ngọc Linh với độ tương đồng di truyền khoảng 0,41 đến 0,69, phù hợp với cơng tác chọn tạo giống ưu lai Từ khóa: Chỉ thị phân tử, đa dạng di truyền, Sâm Ngọc Linh, EST- SSR v MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sâm Ngọc Linh có tên khoa học P.vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), gọi với tên khác sâm Việt Nam, Sâm khu năm (sâm K5), … (Pua, 2007) Sâm Ngọc Linh xác định thuốc quý giá trị sử dụng giá trị nguồn gen Từ phần mặt đất sâm Ngọc Linh phân lập 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin biết 26 saponin có cấu trúc Các saponin xem hoạt chất định cho tác dụng dược tính, sinh học sâm Ngọc Linh như: ngăn ngừa tế bào ung thư, bảo vệ gan, kích thích hệ miễn dịch,… (Nguyễn Thượng Dong & cs., 2007) Do khai thác mức nạn chặt phá rừng làm cho trữ lượng loài thuốc bị suy giảm Từ nhiều năm nay, Sâm Ngọc Linh đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, danh lục Đỏ thuốc Việt Nam đối tượng ưu tiên bảo tồn (Nguyễn Tiến Bân & cs., 2007; Nguyễn Tập, 2006; Đỗ Huy Bích & cs., 2003) Đối với loài thuốc, yêu cầu hàng đầu công nghiệp dược phẩm dựa dược liệu tự nhiên yêu cầu tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu Việc lựa chọn nguồn gen có chất lượng phục vụ cơng tác chọn tạo giống lồi thuốc có vai trị quan trọng (Phạm Thanh Huyền, Đinh Đồn Long, 2017) Với phát triển công nghệ sinh học, công cụ phân tử đời tỏ rõ ưu công tác phân loại, bảo tồn, chọn, tạo nhân giống loài thực vật, chúng không chịu ảnh hưởng từ điều kiện nuôi trồng, đồng thời thao tác số lượng lớn mẫu định với độ xác cao để đáp ứng yêu cầu trình phát triển công nghiệp chế biến dược liệu bền vững Các thị phân tử khác nghiên cứu phát triển trở thành cơng cụ để phân tích đa dạng di truyền xác định mối quan hệ giống trồng RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats),… Trong đó, thị SSR loại thị sử dụng phổ biến, xác hữu hiệu giúp phân loại giống trồng khác lồi thực vật có ưu điểm vượt trội so với thị khác khả phát đa hình cao Dựa theo nguồn gốc, thị SSR chia thành loại: SSR từ thư viện gen SSR từ sở liệu EST Các dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản có nguồn gốc từ thẻ biểu (EST-SSRs) dấu hiệu lựa chọn sử dụng nghiên cứu chúng phong phú, có tính đồng trội, đa hình cao dễ dàng lập đồ di truyền lồi có mối quan hệ gần gũi với Hiện nhu cầu sử dụng Sâm Ngọc Linh Việt Nam lớn Vấn đề đặt làm để khai thác phát triển bền vững loài thuốc đáp ứng nhu cầu thị trường nước Để có sở cho cơng tác bảo tồn chọn lọc nguồn nguyên liệu làm giống để phát triển nguồn nguyên liệu làm thuốc việc đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen Sâm Ngọc Linh thực cần thiết Trên sở đó, tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thị phân tử EST-SSR phục vụ cho công tác chọn giống” Mục tiêu đề tài Đánh giá mức độ đa dạng di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh giống gốc thị phân tử EST-SSR phục vụ công tác chọn giống Ý nghĩa đề tài a Ý nghĩa khoa học Kết đề tài đóng góp đáng kể vào nghiên cứu xác định tính đa dạng di truyền giống sâm Ngọc Linh nói chung lồi dược liệu q Việt Nam nói riêng Kết nghiên cứu đề tài bổ sung tư liệu khoa học đặc điểm di truyền sâm Ngọc Linh, góp phần làm phong phú thêm kho tư liệu sâm làm sở cho nhà chọn tạo giống nghiên cứu b Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đánh giá đa dạng di truyền cấp độ phân tử 15 mẫu giống Sâm Ngọc Linh, cho phép phân loại mẫu giống hệ số tương đồng di truyền với nhóm, từ chọn cặp để lai tạo giống Sâm Ngọc Linh có ưu lai cao phục vụ cho cơng tác chọn giống Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi EST- SSR Nội dung 2: Xác định mức độ đa hình thị phân tử EST- SSR Nội dung 3: Đánh giá mức độ đa dạng di truyền dòng sâm Ngọc Linh allen mẫu số 6, 9, 10 Mẫu số 12 xuất allen Mẫu số 14 xuất allen Mẫu số xuất allen mẫu số Các mẫu lại xuất allen Giá trị PIC thị PVM104 cao (0,9) Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR thị L145 Phân tích hình 3.3, cho thấy thị L145 biểu đa hình cao mẫu Mẫu số 11 có số allen xuất allen Các mẫu số 4, 8, 13 xuất allen Mẫu xuất allen nhiều mẫu số 1, 5, 9, 12, 14, 15 với allen Các mẫu lại xuất allen Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR thị PVM104 Phân tích hình 3.4, cho thấy thị PVM104 biểu đa hình mẫu Mẫu số khơng có allen xuất Các mẫu 5, 8, 14, 15 xuất allen Trong mẫu số đa hình với mẫu số 8, 14 15 Các mẫu lại xuất allen khơng đa hình với Giá trị PIC thị PVM104 thấp (0,36) Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR thị L73 23 Phân tích hình 3.5, cho thấy thị L73 biểu đa hình cao mẫu Mẫu số 3, 4, có số allen xuất nhiều allen Các mẫu số 1, 8, 9, 14 xuất 2, 5, allen Các mẫu lại xuất allen Đây thị nhân lên nhiều allen với 97 allen Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR thị Mr2U1 Phân tích hình 3.6, cho thấy thị Mr2U1 khơng biểu đa hình, xuất allen đơn hình, qua xác định số PIC thị Mr2U1 Từ kết xác định allen đa hình tính số thơng tin đa hình PIC thị EST- SSR 15 mẫu Sâm Ngọc Linh Kết cho thấy, 29 thị ESTSSR sử dụng để xác định tính đa hình 15 mẫu Sâm Ngọc Linh, có 26/29 thị cho kết đa hình Kết tổng hợp bảng 3.28 Số allen nhân lên nhiều thị L149 với 11 allen, số allen xuất thị Mr2U1, PVM129, VES17 với allen Tổng số allen nhân lên với 29 thị EST- SSR 121 allen, trung bình thị cho 4,17 allen Tổng số allen nhân lên qua phân tích 29 thị 15 mẫu Sâm Ngọc Linh thu từ nghiên cứu 936 allen, trung bình thị nhân lên 32,28 allen Trong đó, thị nhân lên nhiều allen L73 với 97 allen thị nhân lên allen PVM129 với 11 allen Mức độ đa dạng di truyền kiểu gen 15 mẫu Sâm Ngọc Linh đánh giá số đa hình PIC (Polymorphic Information Content) thị EST- SSR (giá trị PIC lớn tính đa hình thị cao) Giá trị PIC không liên quan tới tỷ lệ allen đa hình mà cịn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể xuất allen đa hình lớn hay nhỏ Giá trị PIC biến động qua vị trí locus, dao động từ 0,36 (chỉ thị PVM104) đến 0,9 (chỉ thị L149) với giá trị trung bình 0,57 Bảng 3.28 Số Allen đa hình giá trị PIC thị EST- SSR phân tích với 15 mẫu Sâm Ngọc Linh 24 Chỉ thị EST- SSR Tổng số allen Tổng số allen đa hình Chỉ số PIC Mr2U1 12 VES15 32 0,66 VES13 22 0,53 PVM129 11 VES11 22 0,48 PVM184 15 0,56 VES17 14 PVM176 25 0,7 PVM148 21 0,47 PVM137 25 0,48 PVM134 29 0,5 PVM132 15 0,67 VES2 29 0,63 Mr2U2 15 0,55 VES16 16 0,83 VES1 69 0,85 VES12 23 0,5 PVM104 18 0,36 TP07 60 0,84 L145 31 0,65 L39 15 0,66 PVM139 17 0,63 L119 40 0,87 L149 11 85 0,9 PVM99 20 0,48 PVM105 14 0,41 L111 63 0,75 L115 81 0,84 L73 97 0,87 TỔNG 121 936 TRUNG BÌNH 4,17 32,28 0,57 Giá trị PIC vị trí locus có allen đơn hình (monomorphism) Các STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 thị EST- SSR có giá trị PIC lớn 0,5 cho phân biệt cao tỷ lệ đa hình thị (DeWoody & cs., 1995) Như qua Bảng 3.28 ta nhận thấy có 20/29 thị có giá trị PIC > 0,5 Điều khẳng định 68,97% số thị sử dụng nghiên cứu có khác biệt lớn tỷ lệ đa hình 3.3 Thiết lập mối quan hệ di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh 25 Dựa xuất hay không xuất allen giống điện di sản phẩm EST- SSR, xác định hệ số đa dạng di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh mức độ phân tử Các số liệu tính tốn phân tích theo chương trình NTSYSpc version 2.1 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) (theo quy ước = xuất hiện; = không xuất hiện) Kết nhận hệ số tương đồng di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh thể Bảng 3.29 Dựa vào kết chọn cặp lai cho phù hợp, cho ưu lai cao Các cặp lai cho ưu lai cao hệ số tương đồng di truyền nằm khoảng từ 0,4 đến 0,7 Nếu hệ số tương đồng di truyền < 0,4 xảy tượng lai bất dục lai xa, hệ số tương đồng di truyền > 0,7 cặp bố mẹ lai coi gần giống mặt di truyền lai không cho ưu lai cao Hệ số tương đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh với Hai mẫu Sâm Ngọc Linh gần mặt di truyền hệ số tương đồng chúng lớn ngược lại hai giống có hệ số tương đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng xa Kết cho thấy độ tương đồng di truyền giống 15 mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43 - 0,88 Trong đó, hai cặp mẫu S1 S6 có sai khác lớn mặt di truyền (0,43) Cặp mẫu S2 S3 gần mặt di truyền (0,88) Điều cho thấy có khác biệt có ý nghĩa mặt di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu Cụ thể khẳng định 26/29 thị EST- SSR sử dụng nghiên cứu cho kết đa hình cao mẫu Sâm Ngọc Linh (Bảng 3.29) Sau phân tích hệ số tương đồng truyền, tơi tiến hành phân tích đa dạng di truyền chương trình UPGMA dựa vào hệ số Jaccard xây dựng sơ đồ hình 15 mẫu Sâm Ngọc Linh để sai khác di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh (hình 3.7) Mức độ khác biểu hệ số sai khác giống Các giống có hệ số di truyền cao xếp vào nhóm, nhóm lại có liên kết với 26 Bảng 3.29 Hệ số tương đồng di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh Mẫu sâm Ngọc S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 Linh S1 S2 0,62 S3 0,63 0,88 S4 0,66 0,78 0,82 S5 0,6 0,7 0,74 0,73 S6 0,43 0,64 0,7 0,7 0,74 S7 0,49 0,6 0,64 0,64 0,62 0,71 S8 0,51 0,74 0,72 0,65 0,6 0,6 0,64 S9 0,5 0,68 0,69 0,64 0,58 0,7 0,74 0,75 S10 0,52 0,69 0,68 0,68 0,62 0,69 0,69 0,74 0,78 S11 0,47 0,74 0,69 0,66 0,57 0,58 0,54 0,68 0,63 0,67 S12 0,51 0,66 0,67 0,62 0,69 0,67 0,63 0,65 0,67 0,73 0,61 S13 0,52 0,67 0,66 0,6 0,57 0,6 0,59 0,69 0,69 0,74 0,72 0,66 S14 0,54 0,64 0,66 0,69 0,59 0,61 0,62 0,64 0,64 0,67 0,64 0,69 0,77 S15 0,58 0,73 0,74 0,7 0,68 0,67 0,64 0,65 0,7 0,71 0,63 0,67 0,69 0,73 Hình 3.7 Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền 15 mẫu Sâm Ngọc Linh Phân tích hình 3.7 cho thấy, với hệ số tương đồng 0,68 chia 15 mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu thành nhóm chính, có mức độ tương đồng di truyền dao động từ 0,54 đến 0,88: - Nhóm I: gồm mẫu S1 27 - Nhóm II: gồm mẫu S2, S3, S4, S15, S5, S6 Trong nhóm II, chia thành nhóm phụ gồm: nhóm IIA gồm mẫu S2, S3, S4 S15 có hệ số tương đồng di truyền 0,73 Nhóm IIB gồm mẫu S5 S6 có hệ số tương đồng di truyền 0,75 - Nhóm III: gồm mẫu S7, S8, S9, S10, S12 Trong nhóm III, chia thành nhóm phụ gồm: nhóm IIIA gồm mẫu S7, S8, S9 S10 có hệ số tương đồng di truyền 0,7 nhóm IIIB gồm mẫu S12 - Nhóm IV: gồm mẫu S11, S13 S14 Trong nhóm IV, chia thành nhóm phụ gồm: nhóm IVA gồm mẫu S11 nhóm IVB gồm mẫu S13 S14 có hệ số tương đồng di truyền 0,77 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết phân tích đa hình di truyền 15 mẫu Sâm Ngọc Linh với 29 thị EST- SSR, đến kết luận sau: - Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 29 mồi cho kết có 5/29 mồi hoạt động tốt với mẫu nhiệt độ 52,60C; 16/29 mồi hoạt động tốt với mẫu nhiệt độ 540C; 3/29 mồi hoạt động tốt với mẫu nhiệt độ 55,70C; 5/29 mồi hoạt động tốt với mẫu nhiệt độ 57,10C thể bảng 3.1 - Trong 29 thị EST- SSR, có 26 thị biểu đa hình, khuếch đại 121 allen, trung bình thị cho 4,17 allen, thị L149 khuếch đại nhiều 11 allen, thị Mr2U1, PVM129, VES17 với allen đơn hình - 15 mẫu Sâm Ngọc Linh với 29 thị EST- SSR có hệ số PIC dao động từ 0.36 đến 0.9, trung bình 0,57; 68,97% thị có số PIC > 0,5 (20/29 thị) có khác biệt lớn tỉ lệ đa hình - Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43-0,88 Hai cặp mẫu S1 S6 có sai khác lớn mặt di truyền (0,43) Cặp mẫu S2 S3 gần mặt di truyền (0,88) Ở mức độ tương đồng di truyền 0,68 phân chia 15 mẫu Sâm Ngọc Linh thành nhóm chính, có mức độ tương đồng di truyền dao động từ 0,54 đến 0,88 Nhóm I: gồm mẫu S1 Nhóm II: gồm mẫu S2, S3, S4, S15, S5, S6 Nhóm III: gồm mẫu S7, S8, S9, S10, S12 Nhóm IV: gồm mẫu S11, S13 S14 - Trong 15 mẫu Sâm Ngọc Linh nghiên cứu, chọn 66 cặp mẫu Sâm Ngọc Linh với độ tương đồng di truyền khoảng 0,41 đến 0,69, phù hợp với công tác chọn tạo giống ưu lai Kiến nghị Từ kết phân tích đa hình di truyền sử dụng thị phân tử EST- SSR, nghiên cứu xác định cặp mẫu Sâm Ngọc Linh cho đa hình di truyền cao, có tiềm cho ưu lai Tuy nhiên kết cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật SSR với nhiều thị kết hợp nhiều kỹ thuật khác RAPD, AFLP, RFLP,… đặc tính nơng sinh học, suất chất lượng để xác định mối quan hệ di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh có độ tin cậy cao tạo sở cho việc lai chọn tạo giống Sâm Ngọc Linh có hiệu 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) nhiều người khác, 1996, Sách đỏ Việt Nam, phần (II), NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 29-31, 204-208 [2] Bộ Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ, 2007, Sách đỏ Việt Nam, Phần II thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, tr 85-89 [3] Võ Văn Chi & cs., 1973, Cây cỏ thường thấy Việt Nam, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, 3, tr 109 [4] Võ Văn Chi 1997, Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, tr 19-21, 64 [5] Lê Trọng Cúc & cs., 2003, Danh lục lồi thực vật Việt Nam, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội, tr.640 [6] Lê Trần Đức, Cây thuốc Việt Nam trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 1013-1026 [7] Phạm Hoàng Hộ, 1970, Cây cỏ Miền nam Việt Nam, Nxb Bộ Văn hóa giáo dục niên trung tâm học liệu, 1, tr.989 [8] Phạm Hoàng Hộ, 1993, Cây cỏ Miền Nam Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội, 2(2), tr 640641 [9] Phạm Hoàng Hộ, 2000, Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội, 2, tr 515-516 [10] Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thị Mai Linh , Lê Thanh Sơn (2014), “Mối quan hệ di truyền mẫu sâm thu Lai Châu sở phân tích trình tự nucleotide vùng Matk ITS-rADN”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 12(2), tr.327-337 [11] Đỗ Tất Lợi, 1995, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, tr 376-379, 1004-1007 [12] Trần Đình Lý & cs., 1993, 1900 lồi có ích Việt Nam, Nxb Thế giới, tr 3233 [13] Nguyễn Thanh Thuận, Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2010), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định số loài sâm thuộc chi Panax”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 14(1), tr.129-133 30 Tài liệu tiếng Anh [14] Bentham G and J D Hooker, 1867, Genera plantarum, Araliaceae, L Reeve and Co., London, Vol I, pp 931-947 [15] Candolle, A P de, 1830, Prodromus systematis naturalis regni vegetabilis, Araliaceae, Vol 4, Treuttel Wurtz, Paris, pp.251-266 [16] Clarke C B., 1879, The Flora of British India, London, vol pp.808 [17] Decaisne, J E Planchon, 1854, Esquisse d’une monographie des Araliacées Rev Hort 4, pp.104-109 [18] Grushvitzky, I.V., Skvortsova, N.T., Ha Thi Dung Arnautov, N.N., 1996, Fam Araliaceae Juss Ngu gia bi Vascular plants Synopsis of Flora, 2, pp.16-42 [19] Ha T.D Grushvitsky I.V., 1985, A new species of the genus Panax (Araliaceae) from Vietnam, Bot J (Leningrad), tr 519-522 [20] Harms H, 1897, Zur Kenntnis der Gattungen Aralia und Panax, Botanische Jahrbucher fur Systematik Pflarzengeschichte, 23, pp.1–23 [21] J.W Lee, et al (2011), “Development of an ISSR-Derived SCAR Marker in Korean Ginseng Cultivars (Panax ginseng C.A Meyer)”, Journal of Ginseng Research,35(1), pp.52-59 [22] Linnaeus C., 1735, Systema naturae, pp 8-13, Leyden [23] Linnaeus C., 1753, Species plantarum, Laurentius Salvius, pp.133134, 202, 273, 1058 [24] Seemann, 1868, Journal of Botany, vol 6, pp.54 [25] Wen J., 2000, Species diversity, Nomenclature, phylogeny, Biogeography and Classificational Ginseng genus (Panax L., Araliaceae), Proceeding of the International Ginseng Workshop “Utilza of Biotechno, genetic and cultural approaches for North American and Asian Ginseng improvement”, Zamir K Punja, pp 29-45 10 Nocerino E et al., 2000, Fitoterapia, 71, pp 1-5 [26] Y.H Shim, et al (2003), “Molecular Differentiation of Panax Species by RAPD Analysis”, Archives of Pharmacal Research, 26(8), pp.601-605 [27] Yuri N Zhuravlev, Nguyen T.P Trang, Nguyen T.H Mai (2017), “Application of DNA Barcoding to Authentic Panax Vietnamensis”, American Scientific Research Journal for Engineering, Technology, and Sciences (ASRJETS), 29(1), pp.60-67 31 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng 3.2 Kết xác định allen đa hình thị VES15 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 0 0 0 0 0 0 VES15 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 PHỤ LỤC Bảng 3.3 Kết xác định allen đa hình thị VES13 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 0 0 0 0 1 VES13 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC Bảng 3.4 Kết xác định allen đa hình thị VES11 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 VES11 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 PHỤ LỤC Bảng 3.5 Kết xác định allen đa hình thị PVM184 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 1 0 0 0 0 0 PVM184 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 PHỤ LỤC Bảng 3.6 Kết xác định allen đa hình thị PVM176 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 1 0 0 0 1 PVM176 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 PHỤ LỤC Bảng 3.7 Kết xác định allen đa hình thị PVM148 Chỉ thị Các mẫu 32 14 1 15 0 1 14 1 15 0 14 1 15 1 14 15 0 14 0 15 0 0 10 11 12 13 PVM148 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 PHỤ LỤC Bảng 3.8 Kết xác định allen đa hình thị PVM137 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM137 1 1 1 1 1 1 14 1 15 1 14 15 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC Bảng 3.9 Kết xác định allen đa hình thị PVM134 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM134 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC Bảng 3.10 Kết xác định allen đa hình thị PVM132 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM132 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 PHỤ LỤC 10 Bảng 3.11 Kết xác định allen đa hình thị VES2 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 VES2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC 11 Bảng 3.12 Kết xác định allen đa hình thị Mr2U2 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 Mr2U2 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 PHỤ LỤC 12 14 1 15 1 14 0 15 0 14 0 0 15 0 0 14 15 33 Bảng 3.13 Kết xác định allen đa hình thị VES16 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 VES16 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 PHỤ LỤC 13 Bảng 3.14 Kết xác định allen đa hình thị VES1 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 VES1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 PHỤ LỤC 14 Bảng 3.15 Kết xác định allen đa hình thị VES12 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 VES12 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC 15 Bảng 3.16 Kết xác định allen đa hình thị PVM104 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM104 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 PHỤ LỤC 16 Bảng 3.17 Kết xác định allen đa hình thị TP07 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 TP07 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 34 14 0 0 0 15 0 0 0 14 0 0 15 1 0 1 14 1 15 14 1 15 1 14 1 1 15 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 PHỤ LỤC 17 Bảng 3.18 Kết xác định allen đa hình thị L145 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L145 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 PHỤ LỤC 18 Bảng 3.19 Kết xác định allen đa hình thị L39 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L39 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 PHỤ LỤC 19 Bảng 3.20 Kết xác định allen đa hình thị PVM139 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM139 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 PHỤ LỤC 20 Bảng 3.21 Kết xác định allen đa hình thị L119 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L119 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 35 1 0 1 14 1 15 1 14 1 15 0 14 0 0 15 0 0 14 0 1 0 0 15 1 1 0 PHỤ LỤC 21 Bảng 3.22 Kết xác định allen đa hình thị L149 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L149 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 PHỤ LỤC 22 Bảng 3.23 Kết xác định allen đa hình thị PVM99 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM99 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 PHỤ LỤC 23 Bảng 3.24 Kết xác định allen đa hình thị PVM105 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 PVM105 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 PHỤ LỤC 24 Bảng 3.25 Kết xác định allen đa hình thị L111 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L111 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 36 14 1 0 1 1 1 15 0 0 0 0 0 14 15 0 14 15 14 1 1 15 1 1 PHỤ LỤC 25 Bảng 3.26 Kết xác định allen đa hình thị L115 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L115 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC 26 Bảng 3.27 Kết xác định allen đa hình thị L73 Chỉ thị Các mẫu 10 11 12 13 L73 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Ghi chú: - xuất allen – không xuất allen 37 14 0 1 1 1 15 0 1 1 1 14 1 1 1 15 1 1 1 ... TRƯỜNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ EST- SSR PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Ngành : Cơng nghệ sinh... độ đa dạng nguồn gen Sâm Ngọc Linh thực cần thiết Trên sở đó, tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thị phân tử EST- SSR phục vụ. .. phân tử EST- SSR phục vụ cho công tác chọn giống? ?? Mục tiêu đề tài Đánh giá mức độ đa dạng di truyền mẫu Sâm Ngọc Linh giống gốc thị phân tử EST- SSR phục vụ công tác chọn giống Ý nghĩa đề tài a