NGHIÊN cứu đa DẠNG DI TRUYỀN và xác ĐỊNH MARKER LIÊN kết TÍNH KHÁNG BỆNH héo đỏ đầu lá TRÊN cây dứa CAYENNE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG CN LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập - Các thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm qua - TS Trần Thị Dung CN Lƣu Phúc Lợi tận tình hƣớng dẫn động viên thời gian thực đề tài tốt nghiệp - TS Lê Đình Đơn hƣớng dẫn góp ý cho tơi tiến hành chủng rệp nhà lƣới - CN Hồ Việt Thế anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh giúp đỡ suốt thời gian phịng thí nghiệm - Chị Tôn Bảo Linh, chị Biện Thị Lan Thanh góp ý giúp đỡ tơi q trình làm đề tài - Toàn thể lớp CNSH29 hỗ trợ động viên suốt thời gian học tập trƣờng - Thành kính ghi ơn ba mẹ ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên để đạt đƣợc thành nhƣ ngày hôm Tháng năm 2007 Nguyễn Hồng Phong iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT NGUYỄN HỒNG PHONG – Lớp DH03SH, Đại học Nông Lâm Tp HCM Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne (Ananas comosus) phƣơng pháp RAPD” dƣới hƣớng dẫn TS Trần Thị Dung CN Lƣu Phúc Lợi đƣợc thực Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh khu nhà lƣới bảo vệ thực vật khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp HCM Nội dung nghiên cứu gồm: Đánh giá đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Tp HCM kỹ thuật RAPD Nuôi rệp sáp tiến hành lây nhiễm virus PMWaV thông qua vector rệp sáp Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne Các kết thu đƣợc: Kết phân nhóm di truyền cho thấy nhóm Cayenne đối chứng Queen có hệ số tƣơng đồng 0,9 Nhóm dứa Cayenne phân thành nhóm nhỏ: nhóm gồm giống Cayenne Trung Quốc Thái Lan, nhóm giống Lâm Đồng Mức tƣơng đồng nhóm khoảng 0,92 Kết kiểm tra độ tin cậy phần mềm winboot cho thấy phân nhóm di truyền tạo có độ tin cậy cao Kết ni rệp sáp cho thấy rệp phát triển tốt bí đỏ điều kiện 25-26oC rệp phát triển tốt điều kiện 33-34oC Đã lây nhiễm đƣợc bệnh héo đỏ đầu lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66% có biểu bệnh Chƣa phát đƣợc marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY Studying genetic diversity and detect markers associated with resistance to wilt disease in cayenne pineapple by RAPD-PCR Supervisor: Tran Thi Dung1; Luu Phuc Loi1, BSc Student: Nguyễn Hồng Phong1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city Cayenne pineapple is an important crop in Ho Chi Minh city for domestic consumption and export But today most varietys have been plant is imports and have many pests, especially wilt disease To develop pineapple industry of this area, its need to research genetic variation of varietys in this area and find the type of wilt resistance In this study, we analysed genetic variation of varietys of Cayenne pineapple in Ho Chi Minh city and found markers associated with wilt resistant trait by using 32 primer RAPD and received these results: - primers gave DNA polymorphisms in Cayenne varietys and controls OPAC10 have hightest allen number in Cayenne UPGMA and bootstrap analysis on the basis of RAPD data clearly showed that Cayenne varietys belong to two major clusters with 92% similarity The first cluster includes Thailand and China varietys with 98% similarity The Second cluster is Lam Dong variety - The results of rearing mealybug show that mealybug can grow on pumpkin and the development of mealybug at 25 – 26oC is better than 33 – 34oC - Two primers gave most DNA polymorphisms in pineapple when analysed genetic variation were used to detect marker associated with wilt resistant trait in Cayenne pineapple But non marker was detected v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình biểu đồ xi Danh sách bảng xiii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu, nội dung yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung 1.2.3 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung dứa 2.1.1 Phân loại nguồn gốc 2.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ dứa 2.1.2.1 Việt Nam 2.1.2.2 Thế giới 2.1.3 Các nhóm dứa 2.1.3.1 Nhóm Queen 2.1.3.2 Nhóm Tây Ban Nha 2.1.3.3 Nhóm Cayenne 2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền phát thị 2.2.1 Giới thiệu chung tính đa dạng di truyền thị 2.2.2 Chỉ thị hình thái vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.3 Chỉ thị isozyme 2.2.4 Chỉ thị phân tử – thị DNA 2.2.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 10 2.3 Các phƣơng pháp chủ yếu tạo phát sinh loài 11 2.4 Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử phân tích đa dạng di truyền dứa Thế Giới Việt Nam 12 2.4.1 Nghiên cứu Thế Giới 12 2.4.2 Nghiên cứu Việt Nam 13 2.5 Bệnh héo virus 14 2.5.1 Lịch sử phát virus PMWaV 14 2.5.2 Tác nhân lây truyền bệnh 16 2.5.3 Triệu chứng 18 2.5.4 Cách phòng trị 19 2.6 Marker liên kết tính kháng bệnh thực vật 20 2.6.1 Tính kháng bệnh thực vật 20 2.6.1.1 Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) 21 2.6.1.2 Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng 21 2.6.2 Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh thực vật 21 2.6.3 Một số nghiên cứu phát marker phân tử cho tính kháng bệnh thực vật kỹ thuật RAPD 22 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đánh giá đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Tp Hồ Chí Minh 23 3.1.1 Thời gian địa điểm 23 3.1.2 Đối tƣợng 23 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 23 3.1.4 Hóa chất 24 3.1.5 Phƣơng pháp tiến hành 24 3.1.5.1 Ly trích DNA tổng số từ dứa 24 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.1.5.2 Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 26 3.1.5.3 Thực phản ứng RAPD 28 3.1.5.4 Phân tích đa dạng di truyền phần mềm NTSYS Winboot 28 3.2 Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu cho dứa Cayenne 30 3.2.1 Thời gian địa điểm 30 3.2.2 Đối tƣợng 30 3.2.3 Dụng cụ 30 3.2.4 Phƣơng pháp tiến hành 31 3.2.4.1 Nuôi rệp 31 3.2.4.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 31 3.2.4.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa bệnh 32 3.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình khơng biểu bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne 33 3.3.1 Thời gian địa điểm 33 3.3.2 Đối tƣợng 33 3.3.3 Dụng cụ thiết bị 33 3.3.4 Hóa chất 33 3.3.5 Phƣơng pháp 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Đánh giá đa dạng di truyền dứa Cayenne kỹ thuật RAPD 35 4.1.1 Kết ly trích DNA tổng số từ dứa 35 4.1.2 Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 35 4.1.3 Thực phản ứng RAPD 36 4.1.4 Phân tích đa dạng di truyền phần mềm NTSYS Winboot 40 4.2 Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu cho dứa Cayenne 43 4.2.1 Nuôi rệp 43 4.2.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 45 4.2.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa bệnh 46 4.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình khơng biểu bệnh héo viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đỏ đầu dứa Cayenne 48 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT EB extraction buffer EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate OD Optical density OUT Operational Taxonomic Unit PCR Polymerase Chain Reaction PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus QTL Quantivative Trait Locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris – Acetate – EDTA TE Tris – EDTA Tm Melting temperature x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 Hình 4.13 Rệp phát triển bí sau tháng a: 25-26oC; b: 33-34oC Sau tuần thu rệp cách quét rệp trái bí xuống cân để định lƣợng Khối lƣợng rệp thu đƣợc bí đƣợc trình bày biểu đồ 4.1 25-26 C 33-34 C khoi luong (g) 40 30.44 30 18.4 20 4.16 0.12 10 0.51 0.11 0.72 6.2 16.4 9.54 thoi gian (tuan) Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển rệp 25-26o C 33-34oC (nhiệt độ phòng) Dựa vào kết thu đƣợc chúng tơi kết luận: Rệp sáp phát triển gia tăng số lƣợng nhanh bí đỏ điều kiện ánh sáng yếu Nếu ni rệp điều kiện nhiệt độ phòng (33 oC -34oC) tốc độ phát triển rệp chậm so vớí ni điều kiện nhiệt độ 25-26oC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 4.2.2 Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh  Chuyển rệp đèn Dùng đèn 5W để hấp dẫn rệp di chuyển từ bí sang dứa bệnh cách để bí có đầy rệp xung quanh dứa bệnh Đặt đèn 5W phía dứa bệnh để rệp tự di chuyển sang dứa bệnh Dứa bệnh đƣợc cắt bớt để không cản ánh sáng từ đèn tới bí Hình 4.14 Chuyển Rệp đèn Kết sau tuần có số rệp di chuyển lên dứa Ngồi có số rệp tập trung đèn Nguyên nhân đa số rệp khơng cịn giai đoạn ấu trùng nên khơng có khả di chuyển xa bí cịn dinh dƣỡng nên rệp không muốn di chuyển Số rệp tập trung đèn đực trƣởng thành (có cánh)  Chuyển rệp trực tiếp Rệp đƣợc thu cách quét trực tiếp từ bí xuống tờ giấy sau trút toàn rệp lên dứa bệnh Rệp tiếp tục đƣợc ni dứa khoảng tuần để thích nghi với loại thức ăn hấp thu virus PMWaV LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 Chúng nhận thấy rệp sống dứa số lƣợng có giảm nhiều so với lúc ban đầu trình quét rệp cọ, rệp bị tác động học nên dễ bị thƣơng chết So với phƣơng pháp chuyển rệp đèn phƣơng pháp quét trực tiếp lƣợng rệp hao hụt q trình qt có nhiều nhƣng phƣơng pháp nhanh lƣợng rệp đƣợc chuyển qua dứa nhiều Hình 4.15 Rệp phát triển dứa bệnh tuần sau chủng 4.2.3 Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa bệnh 300 dứa bệnh trồng khu nhà lưới bảo vệ thực vật (khoa nơng học- ĐH Nơng Lâm – Tp Hồ Chí Minh ) Dứa trồng hàng cách 0,3 m; líp dài 10 m, rộng m, cao 0,2 m Rệp nuôi dứa bệnh tuần để thu virus Sau dứa bệnh cắt thành khoanh với khoảng 50 rệp Các khoanh thả lên dứa bệnh khoảng 150 con/cây LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau dứa bệnh Sau thả rệp, định kỳ kiểm tra diện đếm số rệp dứa sau tuần, nhận thấy số lƣợng rệp giảm so với lúc chủng sau tuần nhƣng bắt đầu tăng lên từ tuần thứ Có lẽ tuần đầu rệp cịn chƣa thích nghi nên chết nhiều cịn từ tuần thứ rệp bắt đầu thích nghi với điều kiện ngồi đồng bắt đầu phát triển Hình 4.17 Rệp phát triển dứa sau chủng a: tuần; b: tuần;c: tuần;d: tuần LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 Sau chủng rệp tháng dứa có biểu triệu chứng rõ rệt nhƣ đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, trƣơng nƣớc, rìa phía lƣng, đầu cong xuống đất, hóa nâu khơ Ngồi tránh nhầm lẫn với trƣờng hợp biểu triệu chứng tƣơng tự nhƣng bệnh Số biểu bệnh 107 chiếm tỷ lệ 35,66% Nhƣ sau tiến hành chủng virus PMWaV thông qua tác nhân rệp sáp, trình chủng rệp thành công với 35,66% dứa biểu bệnh Tuy nhiên, cịn 64,34% số dứa khơng biểu bệnh Có thể dứa có khả chống chịu bệnh tốt lƣợng rệp virus chƣa đủ để làm biểu bệnh Hơn nữa, theo Sether (2005) việc biểu bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, đặc biệt mƣa Sau đó, có biểu triệu chứng bệnh rõ không biểu triệu chứng đƣợc chọn để phân tích xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu Hình 4.18 Dứa biểu bệnh héo đỏ đầu 4.3 Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình khơng biểu bệnh héo đỏ đấu dứa Cayenne Sau phân tích đa dạng di truyền, chọn primer cho đa dạng nhiều dứa Cayenne để phân tích có khơng có biểu bệnh héo đỏ đầu Chúng tội chọn primer OPAC10 OPB08 primer cho đa hình nhiều dứa Cayenne Bản thân hai primer marker phân tử gene kháng bệnh héo đốm virus cà chua tiêu (OPAC10-593bp) gene kháng bệnh nấm vảy táo (OPB08-710bp) Việc sử dụng marker liên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 kết gene kháng có sẵn hy vọng rút ngắn đƣợc thời gian phát gene kháng bệnh gene kháng trình tự liên kết khác tƣơng đồng thực vật Hình 4.19 Kết phân tích RAPD dứa biểu khơng biểu bệnh héo đỏ đầu với primer OPAC10 TQ: Dứa Cayenne Trung Quốc; TL: Dứa Cayenne Thái Lan; LD: Dứa Cayenne Lâm Đồng “+”: Cây biểu bệnh; “-”: Cây không biểu bệnh; “ ”: Cây không chủng bệnh Hình 4.20 Kết phân tích RAPD dứa biểu không biểu bệnh héo đỏ đầu với primer OPB08 TQ: Dứa Cayenne Trung Quốc; TL: Dứa Cayenne Thái Lan; LD: Dứa Cayenne Lâm Đồng “+”: Cây biểu bệnh; “-”: Cây không biểu bệnh; “ ”:Cây không chủng bệnh Sau thực lại phản ứng RAPD với primer cho đa hình nhiều dứa Cayenne (OPAC10, OPB08), Chúng tơi nhận thấy với primer OPAC10 có băng đa hình khoảng 1500bp 850bp mẫu Lâm Đồng có khơng có biểu bệnh nhƣng băng lại xuất mẫu có biểu bệnh nên marker liên kết gen kháng bệnh Tƣơng tự với mồi OPB08 có băng đa hình 600bp diện mẫu Lâm Đồng bệnh mà không diện mẫu Lâm Đồng kháng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 nên marker liên kết gen kháng bệnh Các mẫu Thái Lan Trung Quốc khơng có khác biệt mẫu có khơng có biểu bệnh Riêng mẫu khơng chủng bệnh phân tích với mồi OPB08 có khác biệt với mẫu có khơng có biểu bệnh, mẫu ly trích lần khác nên chất lƣợng DNA tổng số khác Nhƣ kết kết phân tích với mồi OPAC10 OPB08 khơng cho band đa hình liên kết với kiểu hình khơng biểu bệnh héo đỏ đầu Hơn nữa, có xuất band đa hình khó khẳng định marker liên kết với tính kháng bệnh héo đỏ đầu kháng ban đầu chƣa đƣợc xác định có thật kháng với bệnh héo đỏ đầu hay không Từ đó, chúng tơi xác định đƣợc số ngun nhân khơng xác định đƣợc marker kháng nhƣ: Chƣa có hệ thống xác định mức độ bệnh thông qua kiểu hình Hơn bệnh có khả tiềm ẩn nên việc khó khăn RAPD phƣơng pháp xác định marker phổ biến dễ làm nhƣng phƣơng pháp phụ thuộc nhiều vào yếu tố ngẫu nhiên nên xác suất thành công thấp Việc xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh dễ dàng tính kháng gene quy định Tuy nhiên tự nhiên tính kháng chủ yếu tổ hợp nhiều gene (QTLs) quy định Hơn dứa Cayenne giống mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu nên việc xuất gene kháng bệnh khó xảy (chỉ xảy đột biến) mà khả cao xuất tổ hợp gene kháng cho tính kháng mạnh hay yếu biến dị tổ hợp Ngồi ra, cịn mối quan hệ phức tạp virus PMWaV, rệp sáp biểu bệnh (D.M Sether, 2004): Bệnh héo đỏ đầu biểu bệnh có rệp sáp virus PMWaV-2 Bệnh khơng biểu khơng có rệp sáp có rệp sáp mà bị xâm nhiễm virus PMWaV-1 PMWaV-3 hai Điều cần đƣợc ý tiến hành chủng bệnh Để xác định marker liên kết gene kháng bệnh héo đỏ đầu dứa áp dụng phƣơng pháp sau: Sử dụng phƣơng pháp phân tích quần thể phân ly (bulked segregant analysis, BSA): Hai giống kháng nhiễm bệnh héo đỏ đầu chủng kiểu hình đƣợc phân tích kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ RAPD, SSR, AFLP… để xác định band đa hình giống Sau lai F2 chúng đƣợc chia thành nhóm kháng nhiễm dựa vào mức độ biểu bệnh cá thể nhóm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 phân tích lại với marker cho đa hình bố mẹ để xác định marker cho đa hình marker liên kết với tính kháng bệnh Tuy nhiên phƣơng pháp gặp khó khăn cần phải có vật liệu ban đầu giống có kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu chủng trƣớc Nghĩa phải có giống kháng bệnh héo đỏ đầu để làm vật liệu ban đầu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc, đƣa số kết luận sau :  Phân tích đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Tp Hồ Chí Minh Trong primer sử dụng primer cho độ đa hình lần lƣợt OPAC10, OPAH13, OPB01, OPB08, S1384, V20 Với mức tƣơng đồng 0,92, nhóm dứa Cayenne phân thành nhóm nhỏ, nhóm gồm giống Cayenne Trung Quốc Thái Lan với độ tƣơng đồng 0,98, nhóm Cayenne Lâm Đồng Nhóm đối chứng Queen có mức tƣơng đồng với nhóm Cayenne 0,9 Qua thấy đƣợc độ đa dạng di truyền dứa Cayenne nông trƣờng Phạm Văn Hai Tp Hồ Chí Minh thấp Nhƣ vậy, việc lai tạo giống dựa vào giống dứa Cayenne có khu vực khơng có lợi cho việc tăng suất dứa  Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu Kết nuôi rệp cho thấy rệp phát triển tốt bí đỏ 25-26oC phƣơng pháp quét trực tiếp rệp từ bí lên dứa hiệu phƣơng pháp dùng đèn Kết chủng bệnh chƣa thành công ảnh hƣởng nhiều yếu tố, đặc biệt điều kiện thời tiết thiếu diện đầy đủ tác nhân gây bệnh nhƣ Virus PMWaV-2, rệp kiến theo Sether cs, 2001  Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình biểu không biểu bệnh héo đỏ đầu Lần lƣợt primer cho đa hình cao nhƣ OPAC10 OPB08 đƣợc sử dụng để sàng lọc marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá, nhƣng kết khơng cho marker có liên kết với tính trạng cách rõ ràng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 53 5.2 Đề nghị  Tiếp tục phân tích thêm giống cayenne vùng khác để đánh giá đầy đủ mức độ đa dạng di truyền dứa Cayenne sở cho công tác chọn giống  Tiến hành chủng bệnh cho dứa nhiều lần với mật độ rệp cao để dứa biểu bệnh rõ ràng  Sử dụng nhiều primer để tăng khả phát marker liên kết tính kháng, bên cạnh kết hợp với phƣơng pháp xác định marker khác nhƣ AFLP, RFLP… LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Biện Thị Lan Thanh, 2005 Ứng dung kỹ thuật RT-PCR phát hịên virus PMWaV-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1) gây bệnh héo đỏ đầu dứa Cayene), luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm – Tp Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu, 2002 Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại trồng Nhà xuất nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Tr 12-13, 169-208 Hùynh Chấn Khơn, 2005 Nghiên cứu đa dạng di truyền tiêu (Piper nigrum L.) thị xã Bà Rịa thuộc tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu kỹ thuật RAPD, luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp Hồ Chí Minh Lê Thị Thanh Tuyền, 2004 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne phương pháp marker phân tử, luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm – Tp Hồ Chí Minh Lê Văn Huy, 2005 Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (berk & curt) Wei gây bệnh cao su (hevea brasiliensis muell arg.) trại thực nghiệm Lai Khê, viện nghiên cứu cao su Việt Nam kỹ thuật RAPD, luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm – Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Tr 50-53 Nguyễn Thị Thu Cúc Côn trùng nhện gây hại ăn trái vùng Dồng Bằng Sông Cửu Long biện pháp phịng trị Nhà xuất nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Tr 311-313 Tơn Bảo Linh, 2004 Nghiên cứu tạo dứa Cayenne in vitro virus gây bệnh héo đỏ đầu (PMWaV – Pineapple Mealybug Wilt associated Virus), luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm – Tp Hồ Chí Minh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 55 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI: Gary C Jahn, John W Beardsley and Hector González-Hernández, 2003 A review of the association of ants with Mealybug Wilt Disease of Pineapple Proc Hawaiin Entomol SOC 36:9–28 10 Guihong YU, Hongxiang MA, Zhang XU, Lijian REN, Maoping ZHOU, Weizhong LU., 2004 Cloning a DNA marker associated to wheat scab resistance J Appl Genet 45(1), pp 17-25 11 Gygax M., Gianfranceschi L., Liebhard R., Kellerhals M., Gessler C., Patocchi A., 2004 Molecular markers linked to the apple scab resistance gene Vbj derived from Malus baccata jackii Theor Appl Genet 109: 17021709 12 Import Risk Analysis (IRA) for the Importation of Fresh Pineapple Fruit, 2001 Agriculture, fisheries and forestry, Australia P 32-33 13 Meyerdirk D E., Warkentin R., Attavian B., Gersabeck E., A.Francis, Adams M., and Francis G., 2001 Biological Control of Pink Hibiscus Mealybug Project Manual United States Department of Agriculture 14 Moury B., Pflieger S., Blattes A., Lefebvre V., and Palloix A., 2000 A CAPS marker to assist selection of tomato spotted wilt virus (TSWV) resistance in pepper Genome 43: 137–142 15 Okubara, Inglis, Muehlbauer, Coyne, 2002 A novel RAPD marker linked to the Fusarium wilt race resistance gene (Fwf) in Pisum sativum Pisum Genetics 16 Sether, D M., and Hu, J S., 2002 Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of pineapple disease Phytopathology, 92: 928-935 17 Sether D M., Melzer M J., Busto J., Zee F., HU J S., 2004 Diversity of Pineapple mealybug wilt associated viruses in pineapple Phytopathology 94: 1031 Publication no P-2004-0803-Ama 18 Sether D M., Melzer M J., Busto J., 2005 Diversity and Mealybug Transmissibility of Ampeloviruses in pineapple Plant Dis 89:450-456 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 56 TÀI LIỆU TỪ INTERNET: 19 Ronald F.L Mau, Jayma L Martin Kessing Dysmicoccus brevipes (Cockerell) Updated by: J.M Diez April 2007 < http://www.extento.hawaii.edu/kbase/crop/Type/d_brevip.htm> 20 Ronald F.L Mau, Jayma L Martin Kessing Dysmicoccus neobrevipes (Beardsley) Updated by: J.M Diez April 2007 < http://www.extento.hawaii.edu/kbase/crop/Type/d_neobre.htm> 21 William Roltsch, 2001 Insectary Rearing of the Pink Hibiscus Mealy Bug and Its Parasitoids in a Desert Environment LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC 1.Sự phát triển rệp bí sau tuần Thời gian (tuần) Trọng lƣợng rệp (g) (trung bình lần cân) 25-26oC 0,11 0,72 6,2 18,4 30,44 Nhiệt độ phòng (33340C) 0,12 0,51 4,16 9,54 16,4 Kết đo OD mẫu dùng phân tích đa dạng di truyền (TQ: cayenne Trung Quốc, LD: Cayene Lâm Đồng, TL: Cayenne Thái lan) Mẫu Ratio Abs Abs DNA (ng/ul) TQ TL TL Q LAN 1.81709 1.77507 1.72627 2.28098 2.61983 0.1822000 0.2187600 0.2125040 0.1424700 0.0544400 0.1002700 0.1232400 0.1231000 0.0624600 0.0207800 785.066000 932.336400 893.490160 671.280300 267.619600 pha loãng 16 19 18 13 Kết đo OD mẫu dùng xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu (“+”: biểu bệnh, “-”: không biểu bệnh, “”: Cây không chủng bệnh) (TQ: cayenne Trung Quốc, LD: Cayene Lâm Đồng, TL: Cayenne Thái lan) Mẫu Ratio Abs Abs DNA (ng/ul) TQ+ TQTQ TL+ TLTL LD+ LDLD 2.07660 1.69388 1.75040 1.71773 1.78053 1.83022 2.18030 1.64556 1.74126 0.2342200 0.2168500 0.1968500 0.2250400 0.2933600 0.2113360 0.1702600 0.2970400 0.1702600 0.1127900 0.1280200 0.1124600 0.1310100 0.1647600 0.1154700 0.0780900 0.1805100 0.0977800 1067.199800 903.114500 833.330500 943.865600 1252.098400 913.611440 789.811400 1218.545600 718.927400 pha loãng 21 18 17 19 25 18 16 24 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết mã hóa nhị phân cho kết điện di mồi TQ OPB01 OPAH13 V20 S1384 OPAC10 OPB08 TL 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 LD 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Q 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 LAN 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas... tích đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng Tp Hồ Chí Minh Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne 1.2.2 Nội dung Đánh giá đa dạng di truyền. .. để xác định đa dạng di truyền giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng Tp Hồ Chí Minh Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu cho dứa Thực PCR với mồi RAPD để xác định band đa hình liên kết tính kháng