Nghiên cứu đa dạng di truyền và các thông số di truyền theo tính trạng tăng trưởng phục vụ chọn giống tôm sú (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN HỮU HÙNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CÁC THƠNG SỐ DI TRUYỀN THEO TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TÔM SÚ (PENAEUS MONODON FABRICIUS, 1798) Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 9620301 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HỊA, 2020 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hảo PGS TS Lại Văn Hùng Phản biện 1: TS Nguyễn Minh Thành Phản biện 2: TS Trần Thị Thúy Hà Phản biện 3: TS Đặng Thúy Bình Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi ngày 19 tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án : Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang MỞ ĐẦU Nghề nuôi tôm nước lợ Việt Nam phát triển mạnh quy mô mức độ thâm canh năm gần Theo Tổng cục Thủy sản, năm 2017, tổng diện tích ni tơm nước lợ gồm tôm sú tôm thẻ chân trắng nước đạt 721.100 ha, diện tích ni tơm sú 595.000 (chiếm 82,5%) diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng 110.100 (chiếm 17,5%) Tổng sản lượng tôm nước lợ nuôi đạt 701.000 tấn, 270.500 tơm sú 430.500 tơm thẻ chân trắng Sản lượng giống tôm nước lợ nước đạt 104,4 tỷ con, sản xuất từ 1.863 sở sản xuất giống Nhu cầu giống cho nuôi thương phẩm tôm sú khoảng 30 tỷ con/năm (Tổng cục thủy sản, 2017) Tuy nhiên, phần lớn tôm sú bố mẹ cung cấp cho trại sản xuất giống phải nhập từ nước khai thác tự nhiên Thực tiễn cho thấy nhu cầu tôm sú giống người ni hồn tồn đáp ứng sản xuất nước, chất lượng tôm giống vấn đề nan giải, tốc độ tăng trưởng chậm, kích cỡ khơng đồng trở ngại nghề ni tơm sú năm qua Tơm sú giống khơng kiểm sốt chặt chẽ tiêu chuẩn chất lượng nguồn tôm bố mẹ mầm bệnh dẫn đến tổn thất to lớn cho người nuôi tôm suất ngày giảm dịch bệnh xảy thường xuyên Do việc chủ động phát triển dịng tơm sú bố mẹ chất lượng cao tăng trưởng nhanh bệnh thông qua chọn giống Việt Nam cần thiết Ở Việt Nam, nghiên cứu tôm sú trước năm 2000 tập trung vào lĩnh vực sinh học, sinh sản sản xuất giống Từ năm 2000 đến nay, nghiên cứu gia hóa tơm sú thực chủ yếu phát triển cơng nghệ ni khép kín vịng đời (kỹ thuật ương ni từ giai đoạn hậu ấu trùng 15 (PL15) đến kích cỡ tơm bố mẹ khơng qua chọn giống) Mặc dù có số chương trình chọn giống tơm sú tiến hành giới lý liên quan đến việc bảo mật cơng nghệ nên cơng trình khơng công bố không chuyển giao Từ phân tích cho thấy cần thiết phải tiến hảnh chương trình nghiên cứu chọn giống cho đối tượng Việt nam Đề tài nghiên cứu sinh “ Nghiên cứu đa dạng di truyền thơng số di truyền theo tính trạng tăng trưởng phục vụ chọn giống tôm sú” thực dựa thành công thực tiễn sản xuất thơng tin cơng bố cơng trình nghiên cứu có tính thực nghiệm lĩnh vực ứng dụng di truyền số lượng di truyền phân tử chọn tạo giống số đối tượng thủy sản có tơm sú cơng bố ngồi nước Các cơng trình nghiên cứu nước chủ yếu thuộc lĩnh vực sản xuất giống, gia hóa tơm sú chọn tạo giống tôm xanh thuộc đơn vị trường Đại học Cần thơ, Đại học Nha trang Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, II, III thuộc Bộ NN&PTNT Các cơng trình nghiên cứu ngồi nước lĩnh vực gia hóa tơm sú, di truyền số lượng di truyền phân tử đối tượng giáp xác phần lớn phần lớn tổ chức CSIRO (Úc), Viện Hải Dương Hawaii thực Luận án Nghiên cứu sinh thực nội dung quan trọng đề tài cấp nhà nước “ Ứng dụng di truyền số lượng di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tơm sú theo tính trạng tăng trưởng” thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp thủy sản đến năm 2020 Bộ NN&PTNT Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II chủ trì thực Mục tiêu luận án: Xác định đa dạng di truyền thông số di truyền làm sở tạo quần đàn tơm sú có biến dị di truyền cao làm vật liệu ban đầu phục vụ cho chọn giống tơm sú theo tính trạng tăng trưởng Để đạt mục tiêu trên, luận án thực nội dung sau: Đánh giá biến dị di truyền dịng tơm sú vật liệu ban đầu kỹ thuật Microsatellite Đánh giá tăng trưởng dịng tơm phương pháp lai hỗn hợp làm sở hình thành vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống Ước tính số thơng số di truyền quần đàn tôm sú thiết lập Ý nghĩa luận án: - Ý nghĩa khoa học: Cung cấp sở khoa học đánh giá mức độ biến dị dịng tơm sú thu thập tạo quần đàn chọn giống ban đầu có tính đa dạng di truyền cao phép lai hỗn hợp, kết ước tính thơng số di truyền với liệu phong phú phương pháp ước tính có độ tin cậy cao Kết nghiên cứu cung cấp sở khoa học lý luận thực tiễn quần đàn chọn giống có nhiều triển vọng cải thiện chất lượng di truyền hệ Đây tảng quan trọng cho nghiên cứu đối tượng - Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài tạo sản phẩm đàn tôm sú chọn giống hệ thứ (G1), bệnh với thông số di truyền khả quan Đây nguồn vật liệu ban đầu cho hệ chọn giống Tôm chọn giống bệnh tăng trưởng nhanh so với tôm giống sản xuất từ tôm bố mẹ đánh bắt tự nhiên, thương mại hóa cung cấp cho thị trường giống có tính trạng tăng trưởng nhanh, khơng mang mầm bệnh Điều giúp giải hai hạn chế lớn chất lượng tôm sú giống nhiễm bệnh tăng trưởng chậm làm ngành công nghiệp chậm phát triển năm gần Điểm luận án: Kết luận án cung cấp thông tin mức độ đa dạng di truyền bốn dịng tơm sú vật liệu ban đầu, đồng thời xác định thông số di truyền liên quan đến tính trạng tăng trưởng tỷ lệ sống tơm, góp phần bổ sung vào hiểu biết di truyền số lượng chọn giống thủy sản Đây kết góp phần định hướng cho nghiên cứu dài đối tượng CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Thành tựu chương trình chọn giống đối tượng thủy sản nước giới 1.1.1 Các chương trình chọn giống đối tượng thủy sản Chương trình chọn giống thủy sản giới tiến hành cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) năm 1971 Nauy (Gjedrem ctv., 1991; Gjedrem, 2005) Di truyền số lượng mơ hình tốn, phần mềm ứng dụng chọn giống cá Hồi Đại Tây Dương, cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) Na Uy, Phần Lan Đan Mạch (Gjedrem, 2005), cá Tuyết Na Uy (Kolstad ctv., 2006), cá rô phi (Eknath ctv., 1993), cá rô hu Ấn Độ, hầu Thái Bình Dương, tơm he Nhật Bản (Hetzel ctv., 2000), tôm thẻ chân trắng (Argue ctv., 2002; Donato ctv., 2005; 2008), tôm vỏ cứng Úc (Jerry ctv., 2005) Kết ban đầu cho thấy hiệu chọn lọc tăng trưởng lồi tơm cao, tăng khoảng -15% sau hệ chọn lọc Ở Việt Nam, chương trình chọn giống thuỷ sản tiến hành số đối tượng cá mè trắng Trung Quốc (Hypophthalmichthys molitrix), cá mè trắng Việt Nam (Hypophthalmichthys harmandi) (Trần Mai Thiên ctv., 1987), cá chép (Cyprinus carpio) (Trần Đình Trọng, 1983), cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) (Nguyễn Văn Hảo ctv., 2003), cá rơ phi vằn dịng GIFT (Oreochromis niloticus) (Nguyễn Công Dân ctv., 2003; Nguyễn Văn Hảo ctv., 2005; Luan, 2008), tôm xanh (Thanh ctv., 2009), tôm thẻ chân trắng (Nguyễn Hữu Ninh ctv., 2018), tôm sú (Nguyễn Văn Hảo ctv., 2015) 1.1.2 Tính đa dạng mặt địa lý thu thập vật liệu ban đầu để hình thành quần thể chọn giống Chương trình chọn giống cá hồi Đại Tây Dương (S salar) thu thập đàn cá hoang dã từ 40 sông khác Na Uy (Gjedrem ctv., 1991) Quần thể cá rô phi GIFT (Genetically Improved Farmed Tilapia) (O niloticus) tạo từ dòng cá khác (Bentsen ctv., 1998., Eknath ctv., 2007) Cá rô phi đỏ thu thập từ dịng cá rơ phi ni khắp khu vực châu Mỹ La Tinh Quần thể ban đầu chương trình chọn giống tơm sú cơng ty Moana hình thành từ quần đàn tơm tự nhiên đánh bắt từ vùng khác khu vực châu Á Ở Việt Nam, nghiên cứu chọn giống tôm xanh (M rosenbergii), vật liệu ban đầu gồm dịng tơm (dịng Mê Kơng, Đồng Nai, Malaysia) (Thanh ctv., 2009) Chọn giống cá chép, quần thể ban đầu gồm dịng cá chép Việt Nam, Hungary Inđơnêsia (Nguyễn Hữu Ninh, 2010) Chọn giống tôm chân trắng với quần đàn vật liệu ban đầu từ đàn tôm chân trắng nhập nội (Trần Thế Mưu, 2015) 1.1.3 Đánh giá vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống Có hai phương pháp hình thành quần thể ban đầu cho chọn giống Phương pháp thứ thu thập tơm từ nhiều dịng khác nhau, sau cho phối ngẫu nhiên, khơng giới hạn dịng, hệ Đây phương pháp sử dụng để hình thành quần thể chọn giống cá hồi Đại Tây Dương Na Uy (Gjedrem ctv., 1991) Phương pháp thứ hai lai hỗn hợp dòng, sau chọn lọc với cường độ thấp hệ chọn giống Phương pháp sử dụng để tạo quần thể cá rô phi vằn (O niloticus) thuộc chương trình GIFT (Bentsen ctv., 1998) 1.1.4 Đảm bảo an toàn sinh học bệnh chọn giống tơm Đảm bảo an tồn sinh học bệnh điều kiện tiên nghiên cứu chọn giống áp dụng cho: Chương trình chọn giống Viện Hải Dương Học Hawaii – Mỹ (OI) tơm thẻ chân trắng, chương trình nghiên cứu gia hóa tơm sú bố mẹ bệnh Malaysia, chương trình gia hóa tơm sú CSIRO – Úc, chương trình chọn giống tơm sú cơng ty Moana – Hawai 1.1.5 Kỹ thuật đánh dấu chọn giống thủy sản Phẩm màu huỳnh quang ứng dụng đánh dấu thành công giun (Butt ctv., 2009), lươn (Imbert ctv., 2007), lưỡng cư (Heemeyer ctv., 2007), giáp xác (Zeeh and Wood., 2009), cá (Astorga ctv., 2005; Doupé ctv., 2003; Jensen ctv., 2008; Woods Martin-Smith, 2004), số lồi tơm khác (Coman ctv., 2010; Fuller ctv., 2009; Godin ctv., 1996; Pillai ctv., 2007), crayfish (Mazlum, 2007), tôm hùm (Frisch Hobbs, 2006; Uglem ctv., 1996; Woods James, 2003) tôm xanh (Dinh Hung ctv., 2012) 1.1.6 Đánh giá tương tác kiểu gen môi trường chọn giống thủy sản Các nghiên cứu đánh giá tương tác G  E công bố nhiều cá rô phi (Uraiwan ctv., 1995; Maluwa ctv., 2006; Bentsen ctv., 2012; Khaw ctv., 2012; Trọng ctv., 2013) Hầu hết nghiên cứu cá rô phi cho mức độ tương tác G  E từ cao đến thấp, tương quan di truyền (rg ) từ 0,64 đến 0,89 Các loài cá hồi (cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi vân, ) nhiều tác giả tập trung nghiên cứu (Winkelman Peterson, 1994; Fishback ctv., 2002; Kause ctv., 2003; Kolstad ctv., 2006; Pierce ctv., 2008) hầu hết tương quan di truyền (rg) > 0,72 Ngoài ra, nghiên cứu cá chép (Cyprinus carpio) (Wang ctv., 2007; Ponzoni ctv., 2008b), cá vược (Lates calcarifer) (Saillant ctv., 2006; Dupont-Nivet ctv., 2008; Domingos ctv., 2013), hàu (Crassostrea gigas) (Kvingedal ctv., 2007; Swan ctv., 2007), tương tác G  E đối tượng biến đổi từ 0,70 đến 0,97 Tóm lại, tương tác G  E công bố hầu hết lồi cá thấp, khơng đáng kể Ngược lại, với nghiên cứu phong phú công bố loài cá, nghiên cứu giáp xác nói chung tơm nói riêng cịn hạn chế 1.1.7 Hệ số di truyền tương quan di truyền Hệ số di truyền tính trạng khác tôm công bố tác giả: Lester (1998), Wong McAndrew (1990), Benzie ctv (1997), Benzie ctv (1997), Fjalestad ctv (1997), Hetezel ctv (2000), Argue ctv (2002), Goyard ctv (2002), Perez-Rostro Ibrara (2003a), Perez-Rostro Ibrara (2003b), Gitterle ctv (2005a), Gitterle ctv (2005b) Theo hệ số di truyền lồi tơm chọn lọc theo khối lượng thân dao động từ 0,10-0,47 Hệ số di truyền chọn lọc theo chiều dài tổng dao động khoảng từ 0,08-0,84 có khả chịu ảnh hưởng q trình biến thái tơm Các hệ số di truyền chọn lọc tính trạng khác thường thấp như: chống chịu virus đốm trắng (0,03), chống chịu ammonia (0,11) 1.1.8 Hiệu chọn lọc Hiệu chọn lọc đối tượng thủy sản thường cao, lên đến 10 đến 20% hệ cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) (Gjedrem, 2000; Quinton ctv., 2005), cá hồi coho (Oncorhynchus kisutch) (Hershberger ctv., 1990; Neira ctv., 2004), cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) (Dunham, 2007), cá rô phi (Oreochromis niloticus) (Bentsen ctv., 1998; Ponzoni ctv., 2005; Eknath ctv., 2007; Trọng ctv., 2013), cá chép Ấn Độ (Labeo rohita) (Mahapatra ctv., 2006) cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) (Sang ctv., 2012) Khác với nghiên cứu cá, giáp xác, có chương trình chọn giống chủ yếu tập trung vào số lồi tơm biển (Hetzel ctv., 2000; Argue ctv., 2002; Goyard ctv., 2002; Preston ctv., 2004; Donato ctv., 2005; Gitterle ctv., 2005a; Gitterle ctv., 2005b; Gitterle ctv., 2006), tôm nước (Jones Ruscoe, 2000; Jerry ctv., 2005), tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) (Luan ctv., 2012; Hung ctv., 2013a; Hung ctv., 2013b; Hung Nguyen, 2014; Hung ctv., 2014; Luan ctv., 2014; Luan ctv., 2015) 1.2 Gia hóa khép kín vịng đời đối tượng chọn giống điều kiện nhân tạo Trên giới, gia hóa tơm bắt đầu thực từ sớm thập niên 70, gồm: tôm thẻ chân trắng (Liptopenaeus vannamei) tôm thẻ thân xanh (Liptopenaeus stylirostris) (Cuzon ctv., 2004), tôm sú (Aquacop, 1977, 1979; Primavera Gabasa, 1981; Primavera, 1983; Subramaniam ctv., 2006) Ở Việt Nam, nhiều chương trình nghiên cứu nước tôm sú bố mẹ công bố việc khép kín vịng đời tơm sú từ trứng đến tôm bố mẹ tạo hệ gia hố điều kiện ni nhà lần thành công bước đầu thương mại hóa quy mơ nhỏ chương trình “Gia hố khép kín vịng đời sản xuất tơm sú bố mẹ tôm sú giống bệnh” (Hoa, 2009) 1.3 Ứng dụng thị microsatellite để đánh giá biến dị di truyền chọn giống đối tượng trồng thủy sản Ngày nay, marker phân tử, chủ yếu AFLP microsatellite sử dụng rộng rãi để đánh giá đa dạng di truyền quần đàn tự nhiên quần đàn gia hóa cho số đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cá hồi (Skaala ctv., 2004), cá chép (Kohlmann ctv., 2005), rơ phi (Romana-Eguia ctv., 2004), vài lồi tôm biển (Moore ctv., 1999; Xu Thornalley, 2001; Cruz ctv., 2004; Dixon ctv., 2008) 1.4 Ứng dụng phương pháp đại (MAS – Marker Assisted Selection; GWS – Genome Wide Selection) chọn giống Chọn giống dựa thị phân tử liên kết với tính trạng quan tâm gọi tắt MAS (marker-assisted selection) quy trình sử dụng thị phân tử để chọn lọc gián tiếp nhiều yếu tố định di truyền tính trạng quan trọng, phương pháp giới ủng hộ mạnh mẽ kỹ thuật rút ngắn thời gian lai tạo giống cho kết sau ba hệ chọn lọc MAS cho phép lựa chọn kiểu gen không bị ảnh hưởng yếu tố môi trường MAS làm tăng hiệu lựa chọn sử dụng giai đoạn giống, phân biệt đồng hợp tử với dị hợp tử, lựa chọn cho số đặc tính lúc (Tanksley Nelson, 1996) Chọn lọc dựa việc tầm sốt tồn bộ gen (GWS-Genomic Wide Selection) thực chất ảnh hưởng khác kiểu gen (cùng gen) lên tính trạng quan tâm Phương pháp cho phép xác định tất SNP (Single Nucleotide Polymorphism) có liên quan đến tính trạng quan tâm, tồn bộ gen Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi đầu tư cao chưa ứng dụng phổ biến Theo Meuwissen ctv., 2001, cách tiếp cận GWS, thị cân liên kết với locus quy định tính trạng số lượng (QTL - quantitative trait locus), số alen thị tương quan với tác động tích cực QTL tất gia đình sử dụng mà không cần cần thiết phải thiết lập giai đoạn liên kết gia đình Ngồi ra, liệu kết hợp kiểu gen kiểu hình sử dụng để ước tính giá trị di truyền dự đốn giá trị kiểu hình đặc điểm quan tâm Chọn lọc dựa việc tầm soát toàn bộ gen nghiên cứu rộng rãi phát triển ứng dụng chăn nuôi (Solberg ctv., 2008 Trong nuôi trồng thủy sản, đánh giá gần MAS chương trình chọn giống cá, Sonesson (2003) cho rằng, MAS có giá trị tính trạng khó ghi lại, quan sát kháng bệnh, chất lượng phi lê, hiệu thức ăn thành thục Mồi sử dụng cho nghiên cứu hãng Sigma, tổng số 15 cặp mồi microsattlite sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền bốn dịng tơm sú vật liệu ban đầu 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu cho đánh giá dòng phép lai hỗn hợp ước tính số thông số di truyền - Tổng số 69 gia đình tơm sú từ 16 tổ hợp lai hình thành hệ G0 với số lượng 200 con/gia đình, kích cỡ trung bình 2g/con tạo từ bốn dịng tơm vật liệu ban đầu có nguồn gốc khác - Tổng số 76 gia đình hệ thứ (G1) với 7.412 tơm kích cỡ từ - 3g/con 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp đánh giá biến dị di truyền microsatellite Phương pháp nghiên cứu gồm bước: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN tổng số, khuếch đại microsatellite kỹ thuật PCR, chạy điện di Gel Agarose kiểm tra sản phẩm PCR, phân tích allen 2.3.2 Phương pháp đánh giá tăng trưởng dịng tơm phương pháp lai hỗn hợp 2.3.2.1 Phương pháp nuôi thành thục, cho sinh sản tôm bố mẹ ương nuôi ấu trùng Phương pháp sử dụng gồm: phương pháp nuôi cách ly, phương pháp nuôi vỗ thành thục tôm bố mẹ, phương pháp cấy tinh, phương pháp cắt mắt tôm mẹ, phương pháp kiểm tra tôm thành thục, phương pháp cho sinh sản, phương pháp thu trứng, rửa trứng ấp trứng, phương pháp ương nuôi ấu trùng từ Nauplius đến hậu ấu trùng PL15, phương pháp ương từ giai đoạn hậu ấu trùng PL15 đến kích cỡ đánh dấu, phương pháp nuôi tăng trưởng bể an tồn sinh học, phương pháp ni tăng trưởng ao đất vùng địa lý khác 2.3.2.2 Phương pháp ni tăng trưởng gia đình tơm hệ G0 G1 * Thế hệ G0: Thực bốn địa điểm gồm Trung tâm Quốc gia giống Hải sản Nam Bộ (nuôi bể ATSH), Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Trung – Khánh Hòa (nuôi ao đất), Trại Nghiên cứu Thực nghiệm Bạc Liêu (nuôi ao đất), Doanh nghiệp tư nhân Đặng Lâm – Vũng Tàu (nuôi ao đất) * Thế hệ G1: Thực hai địa điểm gồm nuôi bể ATSH Trung tâm Quốc gia giống Hải sản Nam Bộ nuôi ao đất Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Trung – Khánh Hòa 11 Quy trình sinh sản nhân tạo ni tăng trưởng áp dụng quy trình cơng bố ứng dụng địa phương mà đề tài lựa chọn để nuôi đánh giá tăng trưởng gồm: Khánh Hòa, Bạc Liêu Vũng Tàu 2.3.2.2 Phương pháp đánh dấu cá thể Phẩm màu huỳnh quang (VIE) sử dụng để đánh dấu cá thể tôm theo hướng dẫn nhà sản xuất (công ty Northwest Marine Technology) 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Bố trí thí nghiệm chọn lọc cặp mồi sử dụng để đánh giá biến dị di truyền microsatelite Khảo sát 29 cặp mồi 28 mẫu ADN tôm ngẫu nhiên để chọn 15 cặp mồi cho hiệu suất PCR cao nhất, đồng thời có số allen cao sử dụng phân tích đa dạng di truyền bốn đàn tôm sú bố mẹ ban đầu 2.4.2 Bố trí tổ hợp lai tồn phần dịng tơm sú Các gia đình hệ G0 tạo từ 16 tổ hợp lai toàn phần dịng tơm (4 x = 16 tổ hợp lai) gồm tổ hợp lai nội dòng (AA, TT, NN GG) 12 tổ hợp lai khác dòng gồm (AT, AN, AG, TA, TN, TG, NA, NT, NG, GA, GT, GN) 2.4.3 Bố trí lai tạo gia đình hệ G0 tạo hệ G1 Các gia đình hệ G1 lai tạo dựa giá trị Index truy xuất nguồn gốc phả hệ đảm bảo tránh cận huyết có diện ba nhóm Index với tỷ lệ khác 2.4.4 Nuôi tăng trưởng đánh giá tương tác kiểu gen môi trường Nuôi tăng trưởng đánh giá tương tác kiểu gen môi trường tiến hành ao đất Nam Trung Bộ (Khánh Hòa), Tây Nam Bộ (Bạc Liêu), Đông Nam Bộ (Vũng Tàu) bể an toàn sinh học (Trung tâm Quốc gia giống Hải sản nam Bộ) 2.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 2.5.1 Phương pháp phân tích xử lý số liệu đánh giá đa dạng di truyền Sử dụng phần mềm GenAlEx (Peakall Smouse, 2006), Genepop 4.2 để tính tốn tần số alen, mức dị hợp tử quan sát (H0), mức dị hợp tử mong đợi (He), hệ số sai khác di truyền (Fst), hệ số cận huyết (FIS), kiểm định độ lệch so với cân Hardy-Weinberg 2.5.2 Phương pháp phân tích xử lý số liệu phục vụ đánh giá tăng trưởng dịng tơm khác phép lai hỗn hợp Trước thả ni chung gia đình cân khối lượng ngẫu nhiên 30 cá thể 12 để ghi nhận khối lượng bắt đầu thả vào bể an toàn sinh học ao nuôi Sau thời gian nuôi khoảng 80 ngày tiến hành thu hoạch tồn số tơm bể ao Số liệu thu thập gồm khối lượng thân (g, sai số 0,1g), giới tính (đực/cái), bể ni tổ hợp dấu (để truy xuất gia đình) - Ước tính trung bình bình phương tối thiểu (Least square mean, LSM) Mơ hình tuyến tính chọn sau sàng lọc tất ảnh hưởng cố định hiệp biến là: Khối lượngijkl = µ + tổ hợp laii + giới tínhj + tuổi + khối lượng đánh dấu + bể nuôik + (tổ hợp lai  bể ni)l + số dưijkl (Mơ hình 1) Trong ‘khối lượngijkl’ khối lượng cá thể tôm l thu hoạch, µ trung bình khối lượng quần thể, ‘tổ hợp laii’là ảnh hưởng cố định 16 phép lai, ‘giới tínhj’ ảnh hưởng cố định hai giới tính (đực, cái), ‘tuổi’ ảnh hưởng hiệp biến số ngày ni (ngày) tính từ giai đoạn hậu ấu trùng 15 đến đạt kích cỡ thu hoạch, ‘khối lượng đánh dấu’ ảnh hưởng hiệp biến khối lượng (g) trung bình gia đình thời điểm đánh dấu với cá thể gia đình coi có khối lượng đánh dấu, ‘bể nuôik’ ảnh hưởng cố định bể nuôi khác nhau, ‘(tổ hợp lai bể nuôi)l’ ảnh hưởng cố định tương quan kép 16 tổ hợp lai khác nuôi bể nuôi khác nhau, ‘số dưijkl’ ảnh hưởng phần dư 2.5.3 Phương pháp thu thập, phân tích xử lý số liệu phục vụ tính tốn thơng số di truyền Thống kê mơ tả ảnh hưởng giới tính (tức khác biệt khối lượng tôm tôm đực) ảnh hưởng tôm bố (hoặc tôm mẹ) phân tích sử dụng phần mềm R 3.2.1 (R Core Team, 2015) Các thành phần phương sai ước tính phần mềm ASReml 3.0 (Gilmour ctv., 2009) - Tương tác kiểu gien − môi trường (G  E) hai môi trường nuôi Tương quan di truyền (rg) tính trạng khối lượng thu hoạch hai mơi trường ni ước tính theo cơng thức 𝒓𝒈 = 𝝈𝟏𝟐 √𝝈𝟐𝟏 ×√𝝈𝟐𝟐 , 𝝈𝟏𝟐 hiệp phương sai ảnh hưởng di truyền cộng gộp khối lượng thu hoạch hai môi trường, 𝝈𝟐𝟏 𝝈𝟐𝟐 phương sai ảnh hưởng di truyền cộng gộp tính trạng khối lượng thu hoạch môi trường (Falconer Mackay, 1996) - Phương pháp ước tính hệ số di truyền 13 Hệ số di truyền (h2) cho tính trạng khối lượng ước tính ảnh hưởng mơi trường ước tính Hệ số di truyền cho tính trạng tỉ lệ sống cá thể (sống = 1, chết = 0), ước tính 𝒉𝟐 = 𝝈𝟐𝑨 𝝅𝟐 𝝈𝟐𝑨 +𝝈𝟐𝑬 × 𝟑 (Gilmour ctv, 2009), với 𝝈𝟐𝑬 cố định (Gilmour ctv., 2009) - Hiệu chọn lọc ngắt đoạn: R1 = i × h2 × σP - Hiệu chọn lọc gia đình: 𝑅2 = 𝑖 × 𝑟 × 𝜎𝑃 14 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá biến dị di truyền tôm sú thị microsatellite 3.1.1 Kết chọn microsatellite đánh giá biến dị di truyền Tiến hành khảo sát 29 cặp mồi microsatellite 28 mẫu ADN tách chiết ngẫu nhiên từ đàn tôm nghiên cứu Đánh giá hiệu suất PCR số alen cặp mồi để sàng lọc, chọn cặp mồi cho kết tốt Kết xác định tổng số 15 microsatellite sử dụng để phân tích, đánh giá biến dị di truyền bốn dịng tơm sú Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa Nội Địa gồm: W2, W3, W4, W9, W10, P1, P2, P4, P5, P7, L1, L3, L4, N1, N2 3.1.2 Các thông số đa dạng di truyền dựa 15 microsatellite bốn dịng tơm sú bố mẹ vật liệu ban đầu Các microsatellite dịng tơm nghiên cứu có số lượng alen (A) tương đối thấp so với công bố từ - alen, kích thước alen (S) tập trung chủ yếu kích thước từ 200 - 400 bp, có hai microsatellite có kích thước alen lớn từ 400 - 600 bp W3 W4 Số lượng kiểu gen (G) khoảng trung bình kiểu gen, cao kiểu gen hai microsatellite P1 W10 Cân Hardy-Weinberg: Chỉ có ba microsatellite (P2, P4 P5) phân phối tuân theo cân HWE, microsatellite lại lệch khỏi cân HWE Điều tương thích với kết dị hợp tử quan sát xác định nghiên cứu từ 0,176 đến 0,557, trung bình 0,407 thấp dị hợp tử mong đợi (0,490 – 0,738), trung bình 0,633 Giá trị cận huyết (FIS) tương đối cao, trung bình 0,357  0,19 Giá trị FIS vượt 0,125 biểu trạng thái suy thối di truyền cận huyết quần thể Các thông số vừa nêu cho thấy số hạn chế tính đa dạng di truyền chung đàn tôm sú bố mẹ sử dụng làm vật liệu ban đầu 3.1.3 Đa dạng di truyền dịng tơm sú vật liệu ban đầu Kết khảo sát đa dạng di truyền bên dịng tơm cho thấy số kiểu gen dị hợp quan sát (Ho) nghiên cứu có giá trị trung bình tất microsatellite 0,41 thấp so với hệ số dị hợp tử mong đợi (He) 0,63 Trong bốn nhóm mẫu phân tích, số PIC (thơng tin đa hình ) trung bình dịng Gia hóa thấp 0,515; ba dịng tơm cịn lại tương đương 0,554 Các microsatellite phân tích dịng tơm Nội địa có phân phối tuân theo cân Hardy-Weinberg Giá trị cận huyết FIS dịng tơm Nội địa thấp (0,316) so với ba dịng tơm cịn lại có xuất xứ Ấn 15 Độ Dương, Thái Bình Dương Gia hóa (lần lượt 0,374; 0,398; 0,338) Giá trị đa dạng gen ba dịng tơm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương Nội địa tương đối mức cao, tương đương 0,645 Dịng tơm Gia hóa có số đa dạng gen thấp 0,599 có biến động lớn quần thể (0,398 – 0,710) Dịng tơm Gia hóa có sai khác di truyền có ý nghĩa với dịng tơm cịn lại Kết phân tích ANOVA Post Hoc test cho thấy thông số đa dạng di truyền gồm: số kiểu gen (G), kiểu gen dị hợp tử mong đợi (He), dị hợp tử quan sát (Ho), đa hình (PIC) giá trị cận huyết (FIS) 04 dịng tơm khơng có sai khác có ý nghĩa (P > 0,05) 3.2 Đánh giá tăng trưởng dịng tơm sú 3.2.1 Sàng lọc bệnh đàn tôm bố mẹ vật liệu ban đầu Kết sàng lọc kỹ thuật PCR khác loại virus nguy hiểm thường gặp cho thấy tỷ lệ tôm bệnh 48,0% tôm 54,5% tơm đực 3.2.2 Tạo gia đình tổ hợp lai Kết ghép dịng tơm tạo 69 gia đình tổng số 16 tổ hợp lai Tỷ lệ đóng góp di truyền dịng Nội địa (N) cao thấp dịng Gia hóa (lần lượt 28,7% 20,4%), kết trình bày Bảng 3.1 Về lý thuyết, tỷ lệ đóng góp vật liệu di truyền dịng tơm cân bằng, tương ứng 25% tốt Bảng 3.1 Tỷ lệ tham gia dịng tơm vật liệu ban đầu vào 16 phép lai để tạo hệ G0 Dịng tơm Ấn Độ Gia hóa Nội địa Thái Bình Dương (A) (G) (N) Dương (T) Giới tính Cái Đực Cái Đực Cái Đực Cái Đực Số lượng 19 10 16 17 14 13 13 Tỷ lệ tham gia vào tổ hợp lai (%) Tổng số (đực + cái) 34,5 18,9 10,9 30,2 30,9 26,4 23,6 24,5 29 22 31 26 (26,9 %) (20,4 %) (28,7 %) (24,1%) 16 3.2.3 Ương ni gia đình tôm 16 tổ hợp lai (thế hệ G0) 3.2.3.1 Ương nuôi từ nauplius đến hậu ấu trùng 15 (PL15) Kết ương nuôi từ nauplius đến PL 15 trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết ương ni 69 gia đình 16 tổ hợp lai (thế hệ G0) từ nauplius đến hậu ấn trùng 15 STT Tổ hợp lai Số lượng gia đình Tỷ lệ sống (%) T×T 63,3 ± 6,3a T×N 57 ± 10,9a T×G 59 ± 6,6a T×A 60,5 ± 13,9a N×N 51 ± 4,3a N×G 49 ± 13,3a N×T 55,6 ± 8,3a N×A 52,5 ± 10,3a G×G 50a 10 G×N 60 ± 8,49a 11 G×T 49 ± 1,41a 12 G×A 44 ± 2,83b 13 A×A 49,1 ± 23,8a 14 A×T 46,7 ± 22,97a 15 A×N 60 ± 3,16a 16 A×G 54,4 ± 5,6a Ghi chú: Giá trị cột có ký hiệu chữ khác sai khác có ý nghĩa (P