(LUẬN văn THẠC sĩ) thiết lập phương pháp elisa sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán porcine circovirus type 2

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÝ ĐỨC VIỆT THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TỰ CHẾ ĐỂ CHẨN ĐOÁN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Khánh Linh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Luận văn sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu biểu protein tái tổ hợp virus PCV2 để chế tạo sinh phẩm chẩn đoán làm nguyên liệu tiến tới sản xuất vaccine” thuộc chương trình trọng điểm Ứng dụng cơng nghệ Sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát triển nông thôn Bộ Nông Nghiệp Phát triển nông thôn Tiến sĩ Đặng Vũ Hồng làm chủ trì Là người tham gia trực tiếp nội dung thuộc đề tài trình bày luận văn này, tơi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa tác giả khác công bố luận văn, luận án chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn Đề tài có quyền sử dụng kết luận văn để phục vụ cho đề tài Hà Nội, ngày 01 tháng năm 2016 Chủ nhiệm đề tài Tác giả luận văn TS Đặng Vũ Hoàng Lý Đức Việt i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong trình theo học chương trình Cao học Tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình q Thầy Cơ khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy Cô, đặc biệt Thầy Cơ tận tình dạy bảo tơi suốt q trình học tập trường Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Bùi Khánh Linh Thầy Cơ mơn kí sinh trùng- HV Nông nghiệp Việt Nam, dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Vũ Hoàng, ThS Trần Thị Thanh Hà tồn thể cán phịng Hóa sinh- Miễn dịch, Viện Thú Y hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện cho thời gian thực tập Viện Khơng thể thiếu được, nguồn động viên từ gia đình, người thân, bạn bè góp phần giúp tơi hồn thành chương trình học Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 09 năm 2016 Tác giả luận văn Lý Đức Việt ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục viết tắt viii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract .x Phần 1: Mở đầu .1 Phần 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước .14 Phần 3: Nội dung, nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu 17 3.1 Nội dung nghiên cứu 17 3.2 Nguyên liệu .17 3.3 Phương pháp nghiên cúu 18 Phần 4: Kết thảo luận 25 4.1 Ứng dụng hệ thống biểu baculovirrus nhằm sản xuất protein orf2 tái tổ hợp virus pcv2 25 4.1.2 Tạo dòng gen ORF2 vi rút PCV2 vector tách dòng pFastBac/NT TOPO 26 4.1.3 Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng .29 4.1.4 Kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp phương pháp IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay) tế bào côn trùng High FIVE 31 4.2 Thiết lập quy trình thực phương pháp elisa sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để chẩn đốn xác pcv2 lợn 32 4.2.1 Chuẩn bị mẫu huyết tham chiếu: 32 4.2.2 Kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein tái tổ hợp ORF2 virus PCV2 sau tinh khiết 33 iii download by : skknchat@gmail.com 4.2.3 Thiết lập phương pháp ELISA phát kháng thể kháng PCV2 mẫu huyết lợn 34 4.2.4 Đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế 37 Phần 5: Kết luận 39 Tài liệu tham khảo 40 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC VIẾT TẮT Viết tắt Nghĩa ADN Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxy Nucleosides Triphotphats nPCR nested - PCR ORF Open Reading Frame PCR Polymerase chain reaction PCV2 Porcine circovirus type RNA Ribonucleic Acid IPMA ImmunoPeroxidase Monolayer Assay ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Kết kiểm tra kháng thể kháng virus PCV2 huyết lợn thực địa hai phương pháp IPMA kít ELISA thương mại 32 Bảng 4.2: Kết phân tích phản ứng chéo với huyết kháng số vi rút gây bệnh lợn, bao gồm vi rút PCV1, PRRS CSF 36 Bảng 4.3: Kết ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế chẩn đoán PCV2 so với kết sử dụng kit ELISA thương mại IPMA sử dụng tế bào côn trùng 38 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc vi rút PCV2 Hình 4.1 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR M, thang ADN chuẩn; giếng 1-4: sản phẩm RT-PCR từ khuôn mRNA mẫu 25 Hình 4.2 Bảy khuẩn lạc ngẫu nhiên lựa chọn để kiểm tra khả mang vector pFB_ORF2 tái tổ hợp .25 Hình 4.3 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen orf2 khuôn plasmid từ khuẩn lạc lựa chọn M: ADN chuẩn; giếng – 7, sản phẩm PCR từ khn plasmid tương ứng với dịng lựa chọn B Phổ điện di sản phẩm cắt plasmid enzyme hạn chế M: thang ADN chuẩn 27 Hình 4.4 Trình tự gen khung đọc gen ORF2 tách dòng 28 Hình 4.5 Kết so sánh trình tự gen nhận diện lồi sử dụng cơng cụ Blast trình tự gen ORF2 ngân hàng NCBI 29 Hình 4.6 Hình ảnh khuẩn lạc môi trường chọn lọc chứa kháng sinh chất thi Bluo-gal khuẩn lạc dịng chứa Bacmid tái tổ hợp .29 Hình 4.7 Phổ điện di sản phẩm PCR M, thang ADN chuẩn; 1-7, sản phẩm PCR sử dụng Bacmid từ dòng khuẩn lạc trắng 30 Hình 4.8 Hình ảnh tế bào trùng SF21AE sau gây nhiễm Bacmid nuôi 27oC 72 .30 Hình 4.9 Kết IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE gây nhiễm với Baculovirus tái tổ hợp; A Đối chứng âm (không sử dụng huyết lợn); B Đối chứng dương (sử dụng kháng thể thương mại kháng PCV2); C Đối chứng âm (sử dụng huyết âm tính với PCV2); D Huyết gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 31 Hình 4.10 Kết Western Blot huyết lợn kháng virus PCV2 sau tinh sạch; A Tính sách từ tế bào trùng High FIVE; B Tính từ mơi trường ni cấy tế bào 34 vii download by : skknchat@gmail.com Hình 4.11: Kết chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể 35 Hình 4.12: Giá trị OD mẫu đối chứng âm chuẩn dương chuẩn 36 Hình 4.13: Sơ đồ bố trí hệ thống đối chứng sử dụng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 vi rút PCV2 .37 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lý Đức Việt Tên luận văn: “Thiết lập phƣơng pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế để chẩn đoán PCV2” Ngành: Thú y Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng nghiệp Việt Nam Mã số: 60.64.01.01 Mục đích nghiên cứu - Sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp vi rút PCV2 dùng làm nguyên liệu thiết lập ELISA - Thiết lập quy trình thực phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế để chẩn đốn xác PCV2 lợn Phƣơng pháp nghiên cứu - Hệ thống biểu baculovirus hang Invitrogen, Mỹ - Phương pháp IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay) - Phương pháp ELISA (sử dụng kít ELISA Shenzhen Lvshiyuan Biotechnology Co., LTD, Trung Quốc sản xuất) - Phương pháp Western Blot Kết kết luận Phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp, thiết lập nghiên cứu này, có độ đặc hiệu (97.16%) độ nhạy (100%) hoàn toàn phù hợp cho cơng tác chẩn đốn huyết học phát kháng thể kháng vi rút PCV2 huyết lợn điều tra dịch tễ bệnh có liên quan tới vi rút PCV2 Việt Nam ix download by : skknchat@gmail.com Kết cho thấy xuất bệnh tích tế bào (CPE) sau 72 nuôi cấy mẫu gây nhiễm Bacmid tái tổ hợp (clone 1-7).Mẫu đối chứng không gây nhiễm với Bacmid tái tổ hợp (control 2) phát triển bình thường hồn tồn khơng thấy xuất CPE Kết cho thấy tái tổ hợp thành công baculovirus mang gen ORF2 vào tế bào côn trùng 4.1.4 Kiểm tra khả biểu protein tái tổ hợp phương pháp IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay) tế bào trùng High FIVE Để kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein ORF2 tái tổ hợp, lần thiết lập phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng dịng High FIVE nhằm phát có mặt protein ORF2 tái tổ hợp Việt nam Ưu điểm dòng tế bào khả biểu protein tái tổ hợp gấp 10 lần so với dịng tế bào trùng thơng dụng khác SF9 hay SF21AE Hơn nữa, tế bào High FIVE nuôi cấy không cần bổ sung huyết thanh, phù hợp để thiết lập phương pháp IPMA phát protein tái tổ hợp hệ thống Baculovirus Kết trình bày hình 4.9 Hình 4.9 Kết IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE gây nhiễm với Baculovirus tái tổ hợp; A Đối chứng âm (không sử dụng huyết lợn); B Đối chứng dƣơng (sử dụng kháng thể thƣơng mại kháng PCV2); C Đối chứng âm (sử dụng huyết âm tính với PCV2); D Huyết gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 31 download by : skknchat@gmail.com Kết cho thấy giếng đối chứng âm (không bổ sung huyết lợn) thảm tế bào không bắt màu nhuộm, ngược lại giếng đối chứng dương sử dụng kháng thể thương mại kháng PCV2 (PAB-PCV2 hãng VMRD, Mỹ) lợn xuất nhiều tế bào bắt màu đỏ đậm nguyên sinh chất Tương tự giếng sử dụng huyết lợn âm tính với PCV2 nhuộm thảm tế bào không bắt màu, giếng sử dụng huyết gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 ngược lại tế bào bắt màu nâu đỏ nguyên sinh chất nhuộm Chứng tỏ rằngprotein ORF2 tái tổ hợp phản ứng mạnh nhận diện bới kháng thể tự nhiên kháng vi rút PCV2 Điều rằng, protein ORF2 tái tổ hợp hệ thống biểu baculovirus mang đặc tính kháng nguyên tự nhiên 4.2 THIẾT LẬP QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ CHẨN ĐỐN CHÍNH XÁC PCV2 TRÊN LỢN 4.2.1 Chuẩn bị mẫu huyết tham chiếu: 286 mẫu huyết lợn thực địa Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp đánh giá phát kháng thể kháng vi rút PCV2 phương pháp: Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng (Đặng Vũ Hồng cs 2016) sử dụng kít ELISA thương mại (PCV Kit, Shenzhen Lvshiyuan Biotechnology Co., LTD, Trung Quốc) theo hướng dẫn nhà sản xuất Bảng 4.1: Kết kiểm tra kháng thể kháng virus PCV2 huyết lợn thực địa hai phƣơng pháp IPMA kít ELISA thƣơng mại Mẫu huyết lợn IPMA Kit ELISA thƣơng mại Mẫu dương tính 149 149 Mẫu âm tính 137 137 Tổng số mẫu 286 286 Qua việc trình bày kết bảng 4.1, ta thấy phương pháp IPMA cho kết 149 mẫu dương 137 mẫu âm, cho thấy tương đồng cao Kít ELISA thương mại phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng High FIVE(Đặng Vũ Hồng cs, 2016) Đồng thời, kết phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng với vi rút baculo mang protein ORF2 tái tổ hợp hoàn toàn phù hợp cho 32 download by : skknchat@gmail.com cơng tác chẩn đốn phát kháng thể kháng virus PCV2 huyết lợn Việt Nam 4.2.2 Kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein tái tổ hợp ORF2 virus PCV2 sau tinh khiết Việc tinh kháng nguyên ORF2 thực kit tinh hãng MBL (Medical and Biologica Laboratories Co.,LTD, Nhật bản) Kháng nguyên gắn thêm đuôi His-tag vào thực theo quy trình nhà sản xuất Sơ đồ vector pFastBac/NT TOPO hãng Invitrogen có găn His-Tag trình bày Sơ đồ Sơ đồ 1: Bản đồ vector pFastbac/NT TOPO Sau tinh kít thương mại, chúng tơi kiểm tra đặc tính kháng nguyên phương pháp Western Blot với huyết kháng vi rút PCV2 lợn, kết cho thấy thấy xuất băng protein ORF2 phản ứng đặc hiệu với huyết kháng vi rút PCV2 ( hình 4.10) 33 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.10 Kết Western Blot huyết lợn kháng virus PCV2 sau tinh sạch; A Tính sách từ tế bào trùng High FIVE; B Tính từ mơi trƣờng ni cấy tế bào Từ kết đưa đến kết luận protein ORF2 tái tổ hợp vi rút PCV2 tinh mang đặc tính kháng nguyên tự nhiên (được nhận diện kháng thể tự nhiên) từ môi trường nuôi cấy (culture supernatant) tế bào côn trùng High FIVE (High FIVE insect cells) sắc ký lực đặc hiệu đuôi His-tag 4.2.3 Thiết lập phương pháp ELISA phát kháng thể kháng PCV2 mẫu huyết lợn Qui trình thiết lập ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 vi rút PCV2 thực gồm bước sau: Bước 1: Chuẩn độ kháng nguyên kháng thể (Checkerboard Titration) Bước 2: Xác định OD ngưỡng(Negative-Positive Cutoff) Bước 3: Phân tích phản ứng chéo(Cross Reaction Analysis) Bước 1:Chuẩn độ kháng nguyên kháng thể (Checkerboard Titration) Nhằm xác định nồng độ kháng nguyên, kháng thể thích hợp sử dụng phản ứng ELISA phát kháng thể kháng PCV2 mẫu huyết lợn, 34 download by : skknchat@gmail.com tiến hành ELISA chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể Kháng thể sử dụng chuẩn độ kháng nguyên - kháng thể huyết gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 Bộ mơn Hố sinh Miễn dịch – Viện Thú y Hình 4.11: Kết chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể Kết chuẩn độ hai chiều, kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 vi rút PCV2 (400, 200, 100, 50 25 nanogram) huyết gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 (pha loãng nồng độ: 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 1/800) cho thấy nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp tối ưu cho ELISA 200 nanogram/giếng nồng độ pha loãng huyết tối ưu 1/50 (giá trị P < 0,05).Nồng độ conjugate sử dụng 1/6000 Bƣớc 2: Xác định ngƣỡng cutoff (Negative-Positive Cutoff) Chúng sử mẫu huyết lợn SPF (Specific Pathogen Free Pigs) làm mẫu đối chứng âm chuẩn từ Viện Thú y Nhật mẫu huyết lợn gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 Bộ mơn Hóa sinh Miễn dịch, Viện Thú y làm mẫu đối chứng dương chuẩn để xác định OD ngưỡng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 vi rút PCV2 Giá trị OD mẫu âm tính mẫu dương tính bước sóng 630 dùng thiết lập phương pháp ELISA trình bày bảng 4.12 35 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.12: Giá trị OD mẫu đối chứng âm chuẩn dƣơng chuẩn Để tính giá trị OD ngưỡng âm, chúng tơi áp dụng công thức: OD ngưỡng âm = OD trung bình mẫu đối chứng âm + độ lệch chuẩn Căn vào cơng thức tính, chúng tơi tính giá trị OD ngưỡng âm 0.217137202 Kết cho thấy tất mẫu đối chứng âm có giá trị 0.217137202 100% mẫu đối chứng dương có giá trị OD cao OD ngưỡng Bƣớc 3: Phân tích phản ứng chéo (Cross Reaction Analysis) Nhằm đánh giá phản ứng chéo kháng nguyên tự chế với kháng thể kháng số loại vi rút lợn, sử dụng huyết gây tối miễn dịch với số vi rút lợn PCV1, PRRS CSF Huyết gây tối miễn dịch với PCV1, PRRS Viện Thú y Nhật Bản cung cấp huyết gây tối miễn dich với vi rút Dịch tả lợn Bộ môn HSMD – Viện Thú y sản xuất Kết trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết phân tích phản ứng chéo với huyết kháng số vi rút gây bệnh lợn, bao gồm vi rút PCV1, PRRS CSF Huyết tối miễn dịch Giá trị OD PCV1 0.1045 ± 0.003 PCV2 1.8545 ± 0,095 PRRS 0.0931 ± 0.015 CSF 0.0831 ± 0.012 Kết cho thấy, kháng nguyên tự chế ORF2 đặc hiệu với kháng thể kháng vi rút PCV2 huyết lợn Từ kết thu trên, tiến hành đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế so sánh với phương pháp tham chiếu: IPMA sử dụng tế bào trùng High FIVE Kít ELISA thương mại 36 download by : skknchat@gmail.com 4.2.4 Đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế A Thiết lập hệ thống mẫu đối chứng cho phản ứng ELISA Trên đĩa phản ứng ELISA với kháng nguyên ORF2 tự chế, thiết lập hệ thống đối chứng gồm 16 giếng, giếng đối chứng chất, giếng đối chứng conjugate, mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm bố trí sau (hình 4.13): Hình 4.13: Sơ đồ bố trí hệ thống đối chứng sử dụng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 vi rút PCV2 OD ngưỡng âm đĩa phản ứng ELISA tính tốn theo cơng thức Mẫu đánh giá dương tính khi:OD trung bình mẫu/OD ngƣỡng âm>1 B Đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phƣơng pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế 286 mẫu huyết kiểm tra phát kháng thể kháng vi rút PCV2 phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE kít ELISA thương mại sử dụng làm phương pháp tham chiếu (Referrence Methods) để đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên ORF2 tự chế 37 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.3: Kết ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế chẩn đoán PCV2 so với kết sử dụng kit ELISA thƣơng mại IPMA sử dụng tế bào côn trùng IPMA kết hợp kít ELISA với kháng nguyên ORF2 ELISA thƣơng mai tái tổ hợp tự chế Mẫu dương tính 149 153 Mẫu âm tính 137 133 Mẫu huyết lợn Độ đặc hiệu (%) 97,16 % Độ nhạy (%) 100 % Kết bảng 4.3 cho thấy 286 mẫu huyết lợn có 153 mẫu dương tính 133 mẫu âm tính với ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 Khi so sánh kết với hai phương pháp tham chiếu IPMA sử dụng tế bào côn trùng kít ELISA thương mại phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế có độ đặng hiệu 97,16% (4 mẫu dương tính giả) độ nhạy 100%.Kết cho thấy thiết lập phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế 38 download by : skknchat@gmail.com PHẦN 5: KẾT LUẬN Nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp tối ưu cho ELISA 200 nanogram/giếng nồng độ pha loãng huyết tối ưu 1/50 (giá trị P < 0,05).Nồng độ conjugate sử dụng 1/6000 Thiết lập thành công phương pháp ELISA phát kháng thể kháng vi rút PCV2 huyết lợn sử dụng kháng nguyên ORF2 tái tổ hợp Độ đặc hiệu độ nhạy ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế 97.16% 100% 39 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu công bố kết nghiên cứu: Ứng dụng kháng nguyên ORF2 PCV2 tái tổ hợp ELISA chẩn đoán phát kháng thể kháng PCV2 huyết lợn Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Bích Thủy, Đặng Vũ Hoàng, Lý Đức Việt, Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Lương, Đặng Thị Kiều Anh, Nguyễn Thúy Duyên, Nguyễn Thế Vinh Takehiro KOKUHO Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y XXIII số7 năm 2016 Tiếng Việt: Trần Thị Dân, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, & Võ Thị Trà An Biến đổi tiêu huyết học bệnh tích heo ni thịt tiêm chủng vacxin thể ORF2 phòng ngừa hội chứng gầy còm viêm da thận Circovirut type Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y17, 114-120 (2010 Lê Tiến Dũng Phát vi rút PCV2 phương pháp PCR phân lập địch danh số vi khuẩn gây bệnh hơ hấp heo nghi mắc hội chứng cịi cọc sau cai sữa Luận văn Thạc sỹ Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh (2006) Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, 1997 Nguyễn Thị Thu Hồng, Phan Hoàng Dũng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, & Chirs Morrissy Bước đầu khảo sát tình hình nhiễm PCV2 đàn heo ni số tỉnh phía Nam Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y3, 67-69 (2006) Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J Morrissy, Darren Schafer Phân tích di truyền circovirus lợn typ (PCV2) lợn khu vực Nam Bộ Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y tập XV số 2, (2008) Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Giáo Dục, 2007 Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J Morrissy Khảo sát đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vacxin dịch tả heo heo nhiễm circovirus heo typ ( PCV2) Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y tập XVII số 6, 9-16 (2008) Lê Thanh Hòa (2002), Sinh học phân tử: nguyên lý ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh 40 download by : skknchat@gmail.com học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 104 trang Lê Thanh Hòa (chủ biên), 2006, Y - Sinh học phân tử Nhà xuất Y học, Hà Nội, 240 trang 10 Chu Hoàng Mậu, Cơ sở phương pháp Sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm, 2005 11 Võ Thị Phương Lan, Giáo trình Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo Dục, 2011 12 Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2010), Giáo trình Cơng nghệ ADN tái tổ hợp, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh: Allan GM Some physico-chemical and biological properties of porcine circovirus J Vet Med B 17-26 (2000) Allan, G M & Ellis J.A Porcine circovirus: areview J.Vet.Diagn.Investing12, 3-14 (2000) B.HARRACH Characterisation of Hungarian Porcine Circovirus genomes associated with PMWS and PDNS cases Acta Veterinaria Hungarica51, 551-562 (2003) C.Choi & C.Chae Brief communication and case repots Vet Pathol436, (2001) Cadhla Firth, Michael A.Charleston, Siobain Duffy, Beth Shapiro, & Edward C.Holmes Insights into the Evolutionary History of an Emerging Livestock Pathogen: Porcine Circovirus Journal of Irology 12813-12821 (2009) Carl A.Gagnon et al The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada Can Vet J48, (2007) Chang HW et al Immunopathological effects of porcine circovirus type (PCV2) on swine alveolar macrophages by in vitro inoculation Vet Immunol Immunopathol15, 207-219 (2006) Cheung AKLager KM, Kohutyuk OI, Vincent AL, Henry SC, Baker RB, Rowland RR, Dunham AG Detection of two porcine circovirus type genotypic groups in United States swine herds Arch Virol152, 1035–1044 (2007) Ching-Chang Cheng et al.Bronchiolitis Obliterans Organizing Pneumonia in Swine Associated with Porcine Circovirus Type Infection Journal of Biomedicine and Biotechnology (2011) 41 download by : skknchat@gmail.com 10 David P Clark and Nanette J Pazdernik (2010) Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press 11 D.M.Madso, A.R.Patterson, S.Ramamoorthy, & T.Opriessnig Reproductive Failure Experimentally Induced in Sows via Artificial Insemination with Semen Spiked with Porcine Circovirus Type Vet Pathol46, 707-716 (2009 12 Dominique Mahe et al Differential recognition of ORF2 protein from type and type porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes Journal of General Virology81, 1815-1824 (2000) 13 Ellis, J A et al Isolation of porcine circovirus-like viruses from pogs with a wasting disease in the USA and Europe J.Vet.Diagn.Invest10, 3-10 (1998) 14 Ellis, J A et al Lack of antibodies to porcine circovirus type virus in beef and dairy cattle and horses in western Canada Can Vet J42, 461-464 (2001) 15 Esther Steiner, Carole Balmelli, Heidi Gerber, Artur Summerfield, & Kenneth McCullough Cellular adaptive immune response against porcine circovirus type in subclinically infected pigs BMC Veterinary Research (2009) 16 Gordon Allan & Francis McNeill PMWS/PCVD: Diagnosis, Disease, and Control:What doweknow? Proc 19th Congress Inter Pig Vet Soc 1-9 (2006) 17 Gordon M.Allan et al Temporal distribution of porcine circovirus genogroups recovered from postweaning multisystemic wasting syndrome–affected and – nonaffected farms in Ireland and Northern Ireland J Vet Diagn Invest19, 668-673 (2007) 18 G M Rodríguez-Arrioja, J Segalés,C Rosell, A Rovira, J Pujols, J Plana-Durán, M Domingo Retrospective study on porcine circovirus type infection in pigs from 1985 to 1997 in Spain J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.50, 99-101 (2003) 19 Jaret Bogdan et al Association of porcine cicrovirus with reproductive failure in pigs: a retrospective study J Vet Diagn Invest 1995-1998 (2011) 20 J Gillespie, T Opriessnig, X.J Meng, K Pelzer, and V Buechner-Maxwell Porcine Circovirus Type and Porcine Circovirus-Associated Disease J Vet Intern Med.23, 1151-1163 (2009) 21 J.Segalés, M.Calsamiglia, & M.Domingo How we diagnose Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome International Symposium on Emerging and 42 download by : skknchat@gmail.com Re-emerging Pig Diseases (2003) 22 John A.Ellis Porcine circovirus: An old virus in anew guise causes an emerging disease through a novel pathogenesis Large Animal Veterinary Rounds (2003) 23 John C.S.Harding, Edward (Ted) G.Clark, John H.Strokappe, Phil I.Willson, & John A.Ellis Postweaning multisystemic wasting syndrome: Epidemiology and clinical presentation ASSV (1998) 24 Jun Li et al A mouse model to study infection against porcine circovirus type 2: viral distribution and lesions in mouse Virology Journal7, 158 (2010) 25 Kawashima, K & at all Epidemiological investigation of the prevalence and features of postweaning multisystemic wasting syndrome in Japan J Vet Diagn Invest19, 60-68 (2007) 26 Keith H.West et al Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus J Vet Diagn Invest11, 530-532 (1999) 27 Krakowka S & Ellis JA Immunologic features of porcine circovirus type infection Viral Immunology 562-582 (2002 28 Kwang Soo Lyoo In partial fulfillmett of the requirement for the degree of doctore of philosophy Korea PhDThesis (2009) 29 Gerd Gellissen (2005), Production of Recombinant Proteins, 1st edition, WileyBlackwell Publisher 30 Lloren, Grau-Roma , Lorenzo Fraile , Joaquim Segalés Recent advances in the epidemiology, diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type The Veterinary Journal 187, 23–32(2011) 31 Long J Guo, Yue H Lu, Yan W Wei, Li P Huang, & Chang M Liu Porcine circovirus type (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China Virology Journal7, 273 (2010) 32 McCullough KC, Ruggli N, & Summerfield A Dendritic cells at the front-line of pathogen attack Vet Immunol Immunopathol128, 7-15 (2009) 33 MeehanB.M & McNeilly, F T D Characterization of novel cicrovirus ADNs associated with wasting syndromes in pigs J Gen Virol79, 2171-2179 (1998) 34.Mehan B.M, Creenlan J.L, McNulty M.S., & Todd D Sequence of porcine circovirus AND: affinities with plant circovirus Journal virology78, 221-227 (1997) 35 Merial Limited & Merial SAS Postweaning multisystemic wasting syndrome and 43 download by : skknchat@gmail.com porcine circovirus from pigs United States Patent (2011) 36 P.H.Rathkjen, P.Conradsen, E.Nielsen, & H.-J.Riising Spread of PMWS within an area of denmark –an epidemiological report from practice International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Diseases - Rome (2003) 37 PT Ooi et al Identification of Porcine Circovirus Type From Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in Malaysia Veterinary Association Malaysia Congress 19, 59 – 61 (2007) 38 Pallares, F & et al Porcine cicrovirus type (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) J Vet Diagn Invest14, 515-519 (2002) 39 Qiang Liu, Li Wang, Phil Willson, & Lorne A.Babiuk Quantitative, Competitive PCR Analysis of Porcine Circovirus ADN in Serum from Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome Journal of Clinical Microbiology 3474-3477 (2000) 40 Rene´e Larochelle, Rzej Bielanski, & Ronald Magar PCR Detection and Evidence of Shedding of Porcine Circovirus Type in Boar Semen Journal of Clinical Microbiology 4629-4632 (2000) 41 Ronald Magar, Peter Muller, & Renee Larochelle Retrospective serological survey of antibodies to porcine circovirus type and type The Canadian Journal of Veterinary Research64, 184-186 (2000) 42 Rosell, C et al Pathological, immunohistochemical and in-situ hybridization studies of nat-ural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs J.Comp.Pathol120, 59-87 (1999) 43 Sebastian Knell, Hermann Willems, Barbara Hertrampf, Gerald Reiner Comparative genetic characterization of Porcine Circovirus type samples from German wild boar populations Veterinary Microbiology109, 169–177 (2005) 44.Steven D.Sorden, Perry A.Harms, Porntippa Nawagitgul, David Cavanaugh, & Prem S.Paul Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type porcine circovirus in formalin-?xed, paraf?n-embedded tissue J Vet Diagn Invest11, 528-530 (1999) 45 T Opriessnig, N E McKeown, E.-M Zhou, X.-J Meng, P G Halbur Genetic and experimental comparison of porcine circovirus type (PCV2) isolates from cases 44 download by : skknchat@gmail.com with and without PCV2-associated lesions provides evidence for differences in virulence Journal of General Virology 87, 2923–2932(2006), 46 T.Opriessnig, S.Ramamoorthy, D.M.Madson, A.R.Patterson, & P.G.Halbur Differences in virulence among porcine circovirus type isolates are unrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous Protection Journal of General Virology89, 2482-2491 (2008) 47 Taner Karao Porcine circovirus type infection in Turkey Vet Fak Derg58 , 93-97 (2011) 48.Tippawan Jantafong et al Genetic characterization of porcine circovirus type in piglets from PMWS-affected and -negative farms in Thailand Virol J8, 88 (2011) 49 Welch J, Bienek C, Gomperts E, & Simmonds P Resistance of porcine circovirus and chicken anemia virus to virus inactivation procedures used for blood products Transfusion46, 1951-1958 (2006) 50 Yilmaz A & Kaleta EF Disinfectant tests at 20 and 10 degrees C to determine the virucidal activity against circoviruses Dtsch Tierarztl Wochenschr111, 248-251 (2004) 51 Zong-zhao YANG, Jiang-bing SHUAI, Xian-jun DAI, & Wei-huan FANG A survey on porcine circovirus type infection and phylogenetic analysis of its ORF2 gene in Hangzhou, Zhejiang Province, China J Zhejiang Univ Sci B92, 148-153 (2008) 52 Zvonimir Poljak et al Spread of porcine circovirus associated disease (PCVAD) in Ontario (Canada) swine herds: Part II Matched case-control study BMC Veterinary Research 6-58 (2010) 53 Liu C, Ihara T, Nunoya T, Ueda S.Development of an ELISA based on the baculovirus-expressed capsid protein of porcine circovirus type as antigen J Vet Med Sci:237-42 (2004) 45 download by : skknchat@gmail.com ... tác phịng chẩn đốn chống bệnh có liên quan đến vi rút PCV2, tiến hành nghiên cứu: “THIẾT LẬP PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TỰ CHẾ ĐỂ CHẨN ĐOÁN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2? ?? Luận văn gồm hai... PCV2 dùng làm nguyên liệu thiết lập ELISA B Thiết lập phƣơng pháp ELISA phát kháng thể kháng PCV2 huyết lợn kháng nguyên tự chế 3 .2 NGUYÊN LIỆU - Mẫu bệnh phẩm: 28 6 mẫu huyết lấy từ Trung tâm Chẩn. .. phƣơng pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế 28 6 mẫu huyết kiểm tra phát kháng thể kháng vi rút PCV2 phương pháp IPMA sử dụng tế bào trùng High FIVE kít ELISA thương mại sử dụng làm phương