IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay) trên tế bào côn trùng High FIVE
Để kiểm tra hoạt tắnh kháng nguyên của protein ORF2 tái tổ hợp, chúng tôi lần đầu tiên thiết lập phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng dòng High FIVE nhằm phát hiện sự có mặt của protein ORF2 tái tổ hợp tại Việt nam. Ưu điểm của dòng tế bào này là khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp gấp 10 lần so với các dòng tế bào côn trùng thông dụng khác như SF9 hay SF21AE. Hơn nữa, tế bào High FIVE nuôi cấy không cần bổ sung huyết thanh, rất phù hợp để thiết lập phương pháp IPMA phát hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống Baculovirus. Kết quả được trình bày ở hình 4.9.
Hình 4.9. Kết quả IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE gây nhiễm với Baculovirus tái tổ hợp; A. Đối chứng âm (không sử dụng huyết thanh lợn); B. Đối chứng dƣơng (sử dụng kháng thể thƣơng mại kháng PCV2); C. Đối chứng âm (sử dụng huyết thanh âm tắnh với PCV2); D. Huyết thanh gây tối miễn dịch
Kết quả cho thấy ở giếng đối chứng âm (không bổ sung huyết thanh lợn) thảm tế bào không bắt màu khi nhuộm, ngược lại ở giếng đối chứng dương sử dụng kháng thể thương mại kháng PCV2 (PAB-PCV2 của hãng VMRD, Mỹ) của lợn xuất hiện nhiều tế bào bắt màu đỏ đậm trong nguyên sinh chất. Tương tự đối với giếng sử dụng huyết thanh lợn âm tắnh với PCV2 khi nhuộm thảm tế bào cũng không bắt màu, nhưng ở giếng sử dụng huyết thanh gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 thì ngược lại các tế bào bắt màu nâu đỏ trong nguyên sinh chất khi nhuộm. Chứng tỏ rằngprotein ORF2 tái tổ hợp phản ứng mạnh và được nhận diện bới kháng thể tự nhiên kháng vi rút PCV2. Điều này chỉ ra rằng, protein ORF2 tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện baculovirus mang đặc tắnh kháng nguyên tự nhiên
4.2. THIẾT LẬP QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ CHẨN ĐOÁN CHÍNH XÁC PCV2 TRÊN LỢN
4.2.1. Chuẩn bị mẫu huyết thanh tham chiếu:
286 mẫu huyết thanh lợn thực địa do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp và được đánh giá phát hiện kháng thể kháng vi rút PCV2 bằng 2 phương pháp: Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng (Đặng Vũ Hoàng và cs. 2016) và sử dụng kắt ELISA thương mại (PCV Kit, Shenzhen Lvshiyuan Biotechnology Co., LTD, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng thể kháng virus PCV2 trong huyết thanh lợn thực địa bằng hai phƣơng pháp IPMA và kắt ELISA thƣơng mại
Mẫu huyết thanh lợn IPMA Kit ELISA thƣơng mại
Mẫu dương tắnh 149 149
Mẫu âm tắnh 137 137
Tổng số mẫu 286 286
Qua việc trình bày kết quả ở bảng 4.1, ta thấy phương pháp IPMA cho kết quả 149 mẫu dương và 137 mẫu âm, cho thấy sự tương đồng cao giữa Kắt ELISA thương mại và phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE(Đặng Vũ Hoàng và cs, 2016). Đồng thời, kết quả này cũng chỉ ra rằng phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng với vi rút baculo mang protein ORF2 tái tổ hợp là hoàn toàn phù hợp cho
công tác chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng virus PCV2 trong huyết thanh lợn tại Việt Nam.
4.2.2. Kiểm tra hoạt tắnh kháng nguyên của protein tái tổ hợp ORF2 của virus PCV2 sau khi tinh khiết PCV2 sau khi tinh khiết
Việc tinh sạch kháng nguyên ORF2 được thực hiện trên kit tinh sạch của hãng MBL (Medical and Biologica Laboratories Co.,LTD, Nhật bản). Kháng nguyên được gắn thêm đuôi His-tag vào và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. Sơ đồ vector pFastBac/NT TOPO của hãng Invitrogen có găn đuôi His-Tag được trình bày ở Sơ đồ 1.
Sơ đồ 1: Bản đồ vector pFastbac/NT TOPO
Sau khi tinh sạch bằng kắt thương mại, chúng tôi kiểm tra đặc tắnh kháng nguyên bằng phương pháp Western Blot với huyết thanh kháng vi rút PCV2 của lợn, kết quả cho thấy chỉ thấy xuất hiện băng protein ORF2 phản ứng đặc hiệu với huyết thanh kháng vi rút PCV2 ( hình 4.10)
Hình 4.10. Kết quả Western Blot huyết thanh lợn kháng virus PCV2 sau khi tinh sạch; A. Tắnh sách từ tế bào côn trùng High FIVE; B. Tắnh sạch từ
môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Từ kết quả này đưa đến kết luận rằng protein ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 đã được tinh sạch mang đặc tắnh kháng nguyên tự nhiên (được nhận diện bởi kháng thể tự nhiên) từ môi trường nuôi cấy (culture supernatant) và tế bào côn trùng High FIVE (High FIVE insect cells) bằng sắc ký ái lực đặc hiệu đuôi His-tag.
4.2.3. Thiết lập phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong mẫu huyết thanh lợn
Qui trình thiết lập ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 của vi rút PCV2 được thực hiện gồm 3 bước chắnh như sau:
Bước 1: Chuẩn độ kháng nguyên kháng thể (Checkerboard Titration) Bước 2: Xác định OD ngưỡng(Negative-Positive Cutoff)
Bước 3: Phân tắch phản ứng chéo(Cross Reaction Analysis)
Bước 1:Chuẩn độ kháng nguyên kháng thể (Checkerboard Titration)
Nhằm xác định nồng độ kháng nguyên, kháng thể thắch hợp sử dụng trong phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong mẫu huyết thanh lợn,
chúng tôi tiến hành ELISA chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể. Kháng thể sử dụng trong chuẩn độ kháng nguyên - kháng thể là huyết thanh gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 của Bộ môn Hoá sinh Miễn dịch Ờ Viện Thú y.
Hình 4.11: Kết quả chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể
Kết quả chuẩn độ hai chiều, kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 của vi rút PCV2 (400, 200, 100, 50 và 25 nanogram) và huyết thanh gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 (pha loãng ở các nồng độ: 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 và 1/800) cho thấy nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp tối ưu cho ELISA là 200 nanogram/giếng và nồng độ pha loãng huyết thanh tối ưu là 1/50 (giá trị P < 0,05).Nồng độ conjugate được sử dụng là 1/6000
Bƣớc 2: Xác định ngƣỡng cutoff (Negative-Positive Cutoff)
Chúng tôi sử mẫu huyết thanh lợn sạch SPF (Specific Pathogen Free Pigs) làm mẫu đối chứng âm chuẩn từ Viện Thú y Nhật bản và mẫu huyết thanh lợn gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 của Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch, Viện Thú y làm mẫu đối chứng dương chuẩn để xác định OD ngưỡng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 của vi rút PCV2. Giá trị OD của mẫu âm tắnh và mẫu dương tắnh tại bước sóng 630 dùng trong thiết lập phương pháp ELISA được trình bày ở bảng 4.12
Hình 4.12: Giá trị OD mẫu đối chứng âm chuẩn và dƣơng chuẩn.
Để tắnh giá trị OD ngưỡng âm, chúng tôi áp dụng công thức:
OD ngưỡng âm = OD trung bình mẫu đối chứng âm + 3 độ lệch chuẩn
Căn cứ vào công thức tắnh, chúng tôi tắnh được giá trị OD ngưỡng âm là 0.217137202
Kết quả này cho thấy tất cả các mẫu đối chứng âm đều có giá trị dưới 0.217137202 và 100% mẫu đối chứng dương có giá trị OD cao hơn OD ngưỡng
Bƣớc 3: Phân tắch phản ứng chéo (Cross Reaction Analysis)
Nhằm đánh giá phản ứng chéo giữa kháng nguyên tự chế với kháng thể kháng 1 số loại vi rút ở lợn, chúng tôi sử dụng huyết thanh gây tối miễn dịch với 1 số vi rút ở lợn như PCV1, PRRS và CSF. Huyết thanh gây tối miễn dịch với PCV1, PRRS do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp và huyết thanh gây tối miễn dich với vi rút Dịch tả lợn do Bộ môn HSMD Ờ Viện Thú y sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2: Kết quả phân tắch phản ứng chéo với huyết thanh kháng 1 số vi rút gây bệnh ở lợn, bao gồm vi rút PCV1, PRRS và CSF
Huyết thanh tối miễn dịch Giá trị OD
PCV1 0.1045 ổ 0.003
PCV2 1.8545 ổ 0,095
PRRS 0.0931 ổ 0.015
CSF 0.0831 ổ 0.012
Kết quả này cho thấy, kháng nguyên tự chế ORF2 đặc hiệu với kháng thể kháng vi rút PCV2 trong huyết thanh lợn.
Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi tiến hành đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế khi so sánh với 2 phương pháp tham chiếu: IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE và Kắt ELISA thương mại.
4.2.4. Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế
A. Thiết lập hệ thống mẫu đối chứng cho phản ứng ELISA
Trên mỗi đĩa phản ứng ELISA với kháng nguyên ORF2 tự chế, chúng tôi thiết lập hệ thống đối chứng gồm 16 giếng, trong đó 2 giếng đối chứng cơ chất, 2 giếng đối chứng conjugate, 4 mẫu đối chứng dương và 8 mẫu đối chứng âm và được bố trắ như sau (hình 4.13):
Hình 4.13: Sơ đồ bố trắ hệ thống đối chứng sử dụng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 của vi rút PCV2
OD ngưỡng âm của mỗi đĩa phản ứng ELISA được tắnh toán theo công thức như trên. Mẫu được đánh giá là dương tắnh khi:OD trung bình của mẫu/OD ngƣỡng âm>1.
B. Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phƣơng pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế
286 mẫu huyết thanh đã được kiểm tra phát hiện kháng thể kháng vi rút PCV2 bằng 2 phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE và kắt ELISA thương mại và được sử dụng làm các phương pháp tham chiếu (Referrence Methods) để đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên ORF2 tự chế.
Bảng 4.3: Kết quả ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế chẩn đoán PCV2 so với kết quả sử dụng kit ELISA thƣơng mại và IPMA sử dụng tế bào côn trùng
Mẫu huyết thanh lợn IPMA kết hợp kắt ELISA thƣơng mai
ELISA với kháng nguyên ORF2 tái tổ hợp tự chế
Mẫu dương tắnh 149 153
Mẫu âm tắnh 137 133
Độ đặc hiệu (%) 97,16 %
Độ nhạy (%) 100 %
Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy trong 286 mẫu huyết thanh lợn có 153 mẫu dương tắnh và 133 mẫu âm tắnh với ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp ORF2. Khi so sánh kết quả với hai phương pháp tham chiếu IPMA sử dụng tế bào côn trùng và kắt ELISA thương mại thì phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế có độ đặng hiệu là 97,16% (4 mẫu dương tắnh giả) và độ nhạy là 100%.Kết quả này cho thấy đã thiết lập được phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế.
PHẦN 5: KẾT LUẬN
Nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp tối ưu cho ELISA là 200 nanogram/giếng và nồng độ pha loãng huyết thanh tối ưu là 1/50 (giá trị P < 0,05).Nồng độ conjugate được sử dụng là 1/6000
Thiết lập thành công phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng vi rút PCV2 trong huyết thanh lợn sử dụng kháng nguyên ORF2 tái tổ hợp. Độ đặc hiệu và độ nhạy của ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế là 97.16% và 100%
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu công bố kết quả nghiên cứu:
Ứng dụng kháng nguyên ORF2 của PCV2 tái tổ hợp trong ELISA chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh lợn
Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Bắch Thủy, Đặng Vũ Hoàng, Lý Đức Việt, Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Lương, Đặng Thị Kiều Anh, Nguyễn Thúy Duyên, Nguyễn Thế Vinh và Takehiro KOKUHO
Tạp chắ Khoa học Kỹ thuật Thú y XXIII số7 năm 2016
Tiếng Việt:
1. Trần Thị Dân, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, & Võ Thị Trà An. Biến đổi chỉ tiêu huyết học và bệnh tắch ở heo nuôi thịt được tiêm chủng vacxin thể ORF2 phòng ngừa hội chứng gầy còm và viêm da thận do Circovirut type 2. Tạp Chắ
Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y17, 114-120 (2010
2. Lê Tiến Dũng. Phát hiện vi rút PCV2 bằng phương pháp PCR và phân lập địch danh một số vi khuẩn gây bệnh hô hấp trên heo nghi mắc hội chứng còi cọc sau cai sữa. Luận văn Thạc
sỹ Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chắ Minh (2006).
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, 1997.
4. Nguyễn Thị Thu Hồng, Phan Hoàng Dũng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, & Chirs Morrissy. Bước đầu khảo sát về tình hình nhiễm PCV2 trên đàn heo nuôi ở một số tỉnh phắa Nam. Tạp Chắ Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y3, 67-69 (2006).
5. Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Nguyễn Ngọc Hải, Chris. J Morrissy, Darren Schafer. Phân tắch di truyền circovirus lợn typ 2 (PCV2) trên lợn tại khu vực Nam Bộ. Tạp Chắ Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y tập XV số 2, 6 (2008).
6. Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Giáo Dục, 2007.
7. Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Ngọc Hải, Chris. J Morrissy. Khảo sát đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vacxin dịch tả heo trên heo con nhiễm circovirus heo typ 2 ( PCV2) Tạp Chắ Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y tập XVII số 6, 9-16 (2008).
học Ờ Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 104 trang.
9. Lê Thanh Hòa (chủ biên), 2006, Y - Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 240 trang.
10. Chu Hoàng Mậu, Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm, 2005.
11. Võ Thị Phương Lan, Giáo trình Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo Dục, 2011
12. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2010), Giáo trình Công nghệ
ADN tái tổ hợp, NXB ĐHQG TP. Hồ Chắ Minh, TP. Hồ Chắ Minh.
Tiếng Anh:
1. Allan GM. Some physico-chemical and biological properties of porcine circovirus. J
Vet Med B 17-26 (2000).
2. Allan, G. M. & Ellis J.A. Porcine circovirus: areview. J.Vet.Diagn.Investing12, 3-14 (2000).
3. B.HARRACH. Characterisation of Hungarian Porcine Circovirus 2 genomes associated with PMWS and PDNS cases. Acta Veterinaria Hungarica51, 551-562 (2003). 4. C.Choi & C.Chae. Brief communication and case repots. Vet Pathol436, (2001).
5. Cadhla Firth, Michael A.Charleston, Siobain Duffy, Beth Shapiro, & Edward C.Holmes. Insights into the Evolutionary History of an Emerging Livestock Pathogen: Porcine Circovirus. Journal of Irology 12813-12821 (2009).
6. Carl A.Gagnon et al. The emergence of porcine circovirus 2b genotype (PCV-2b) in swine in Canada. Can Vet J48, (2007)
7. Chang HW et al. Immunopathological effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) on swine alveolar macrophages by in vitro inoculation. Vet Immunol
Immunopathol15, 207-219 (2006).
8. Cheung AKLager KM, Kohutyuk OI, Vincent AL, Henry SC, Baker RB, Rowland RR, Dunham AG. Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in United States swine herds. Arch Virol152, 1035Ờ1044 (2007)
9. Ching-Chang Cheng et al.Bronchiolitis Obliterans Organizing Pneumonia in Swine Associated with Porcine Circovirus Type 2 Infection. Journal of Biomedicine and
10. David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. (2010). Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
11. D.M.Madso, A.R.Patterson, S.Ramamoorthy, & T.Opriessnig. Reproductive Failure Experimentally Induced in Sows via Artificial Insemination with Semen Spiked with Porcine Circovirus Type 2. Vet Pathol46, 707-716 (2009
12. Dominique Mahe et al. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes. Journal of
General Virology81, 1815-1824 (2000).
13. Ellis, J. A. et al. Isolation of porcine circovirus-like viruses from pogs with a wasting disease in the USA and Europe. J.Vet.Diagn.Invest10, 3-10 (1998).
14. Ellis, J. A. et al Lack of antibodies to porcine circovirus type 2 virus in beef and dairy cattle and horses in western Canada. Can Vet J42, 461-464 (2001)
15. Esther Steiner, Carole Balmelli, Heidi Gerber, Artur Summerfield, & Kenneth McCullough. Cellular adaptive immune response against porcine circovirus type 2 in subclinically infected pigs. BMC Veterinary Research (2009)
16. Gordon Allan & Francis McNeill. PMWS/PCVD: Diagnosis, Disease, and Control:What doweknow? Proc 19th Congress Inter Pig Vet Soc 1-9 (2006) 17. Gordon M.Allan et al. Temporal distribution of porcine circovirus 2 genogroups
recovered from postweaning multisystemic wasting syndromeỜaffected and Ờ nonaffected farms in Ireland and Northern Ireland. J Vet Diagn Invest19, 668-673 (2007).
18. G. M. Rodrắguez-Arrioja, J. Segalés,C. Rosell, A. Rovira, J. Pujols, J. Plana-Durán, M. Domingo. Retrospective study on porcine circovirus type 2 infection in pigs from 1985 to 1997 in Spain. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.50, 99-101 (2003)
19. Jaret Bogdan et al. Association of porcine cicrovirus 2 with reproductive failure in pigs: a retrospective study. J Vet Diagn Invest 1995-1998 (2011)
20. J. Gillespie, T. Opriessnig, X.J. Meng, K. Pelzer, and V. Buechner-Maxwell. Porcine Circovirus Type 2 and Porcine Circovirus-Associated Disease. J Vet Intern Med.23, 1151-1163. (2009)
21. J.Segalés, M.Calsamiglia, & M.Domingo. How we diagnose Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome. International Symposium on Emerging and
Re-emerging Pig Diseases (2003).
22. John A.Ellis. Porcine circovirus: An old virus in anew guise causes an emerging disease through a novel pathogenesis. Large Animal Veterinary Rounds (2003). 23. John C.S.Harding, Edward (Ted) G.Clark, John H.Strokappe, Phil I.Willson, & John
A.Ellis. Postweaning multisystemic wasting syndrome: Epidemiology and clinical