Phần 4 : Kết quả và thảo luận
4.1. Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirrus nhằm sản xuất protein orf2 tái tổ
XUẤT PROTEIN ORF2 TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS PCV2
4.1.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và khuếch đại gen ORF2 của vi rút PCV2 bằng kỹ thuật RT-PCR
Trong nghiên cứu này, để thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen ORF2 của vi rút PCV2, 12 trình tự gen ORF2 đã cơng bố trên ngân hàng dữ liệu NCBI được sử dụng để so sánh tìm ra trình tự đặc trưng. Phần mềm FastPCR được sử để tắnh tốn các thơng số của mồi, cho phép xác định được trình tự mồi phù hợp với các yêu cầu đặt ra. Kết quả của phản ứng RT-PCR cho thấy xuất hiện một băng ADN khoảng 700 bp trên cả bốn đường chạy. Kắch thước này là phù hợp với kắch thước dự kiến của gen ORF2 theo thiết kế khi được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR của gen ORF2 thu được sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
ORF2-F: 5Ỗ-ACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3Ỗ ORF2-R: 5Ỗ-TCACTTAGGGTGAAGTGGGGGGT-3Ỗ
Hình 4.1. Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR. M, thang ADN chuẩn; giếng 1-4: sản phẩm RT-PCR từ khn mRNA mẫu
4.1.2. Tạo dịng gen ORF2 của vi rút PCV2 trong vector tách dòng pFastBac/NT TOPO pFastBac/NT TOPO
Vector pFastBac/NT Topo là vector tách dòng hiệu quả để tạo cấu trúc tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào E.coli DH10Bac tạo Bacmid tái tổ hợp. Sản phẩm sau đó được biến nạp vào chủng E.coli MJ109 khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt và được sàng lọc bước đầu trên mồi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin nồng độ 100ộg/ml. Trong nghiên cứu này 7 khuẩn lạc ngẫu nhiên đã được lựa chọn để kiểm tra khả năng mang vector pFB_ORF2 tái tổ hợp (hình 4.2).
Hình 4.2. Bảy khuẩn lạc ngẫu nhiên đã đƣợc lựa chọn để kiểm tra khả năng mang vector pFB_ORF2 tái tổ hợp
Để kiểm tra xem plasmid thu được có mang gen ORF2 và đoạn gen ORF2 có gắn vào vector đúng chiều hay khơng trước tiên chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng plasmid thu được làm khuôn với mồi xuôi bắt cặp đặc hiệu với vector và mồi ngược đặc hiệu gen ORF2. Kết quả cho thấy xuất hiện băng ADN có kắch thước khoảng 700 bp (giếng 1 Ờ 7) trùng với kắch thước của đoạn gen ORF2 được gắn vào vector (hình 4.3A). Kết quả này cho thấy rằng plasmid từ 7 dòng lựa chọn đều mang gen ORF2. Để khẳng định chắc chắn thêm, plasmid từ 2 dòng (2 và 3) được xử lý đồng thời với hai enzyme cắt hạn chế EcoRI và HindIII. Enzyme EcoRI có vị trắ cắt nằm ở vị trắ 307 của gen ORF2, enzyme HindIII có vị trắ cắt nằm ở vị trắ 27 tắnh từ vị trắ đầu mở vòng của vector pFastBac/NT Topo. Do vậy, nếu đoạn gen ORF2 được gắn vào vector pFastBac/NT Topo thì khi cắt sẽ tạo ra một đoạn ADN
có kắch thước khoảng 422 bp và băng ADN plasmid tương ứng (khoảng 5,1 kb). Kết quả ở hình 4.3B cho thấy, cả hai dịng được chon lựa để kiểm tra đều xuất hiện hai băng với kắch thước như dự kiến (hình 4B). Điều này chứng mình rằng, plasmid thu được mang gen ORF2 và đoạn gen ORF2 gắn vào vector đúng chiều.
Hình 4.3. Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen orf2 trên khuôn plasmid từ các khuẩn lạc lựa chọn. M: thanh ADN chuẩn; các giếng 1 Ờ
7, sản phẩm PCR từ 7 khn plasmid tƣơng ứng với 7 dịng lựa chọn. B. Phổ điện di sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme hạn chế. M: thang ADN chuẩn
Đoạn gen ORF2 từ dòng lựa chọn (dịng 2) được sử dụng để xác định trình tự nucleotide. Trình tự gen và khung đọc của đoạn gen ORF2 đã được tách dòng được thể hiện trên hình 4.4. Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen ORF2 gồm 702 nucleotide mã hóa cho 233 amino acid và một mã kết thúc. Kết quả kiểm tra khung đọc cho thấy đoạn gen thu được có khung đọc mở từ mã đầu (mã ATG) nằm ở vector pFastBac/NT Topo và mã cuối (TGA) nằm ở gen ORF2. Kết quả này rất quan trọng, khẳng định được rằng gen ORF2 đã được đưa vào vector pFastBac/NT topo thành công và xác định được khung đọc mở nối giữa vector và gen đắch.
Hình 4.4. Trình tự gen và khung đọc của gen ORF2 đƣợc tách dịng
Trình tự đoạn gen ORF2 được sử dụng để blast lên ngân hành dữ liệu NCBI. Kết quả được thể hiện trên hình 4.5 và cho thấy đoạn gen ORF2 được tách dòng trong nghiên cứu này có độ tương đồng 99% so với gen ORF2 của vi rút PCV2 dịng phân lập của NAVETCO. Khi so sánh trình tự chúng tơi nhận thấy gen ORF2 được tách dịng có sự sai khác chỉ 1 nucleotide so với dòng đã được công bố bởi NAVETCO. 5'3' Frame 1 atgtctggttctcatcatcatcatcatcatggtagcagcggcgaaaacctgtattttcag M S G S H H H H H H G S S G E N L Y F Q tcccttacgtatccaaggaggcgtttccgcagacgaagacaccgcccccgcagccatctt S L T Y P R R R F R R R R H R P R S H L ggccagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccccgccaccgttaccgctggaga G Q I L R R R P W L V H P R H R Y R W R aggaaaaatggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccttcggatatactgtgaagaaa R K N G I F N T R L S R T F G Y T V K K accacagtcagaacgccctcctgggcggtggacatgatgagatttaatattaacgatttc T T V R T P S W A V D M M R F N I N D F cttcccccaggagggggctcaaaccccctcactgtgccctttgaatactacagaataaga L P P G G G S N P L T V P F E Y Y R I R aaggttaaggttgaattctggccctgctccccaatcacccagggtgacaggggagttgga K V K V E F W P C S P I T Q G D R G V G tccactgctgttattctagatgataactttgtaccaaaggccacagccctgacttatgat S T A V I L D D N F V P K A T A L T Y D ccctatgtaaactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccgg P Y V N Y S S R H T I T Q P F S Y H S R tactttacccccaaacctgttcttgattccactattgattacttccaaccaaataacaaa Y F T P K P V L D S T I D Y F Q P N N K aggaatcagctttggctgaggctacaaacctctgcaaatgtggaccacgtaggcctcggc R N Q L W L R L Q T S A N V D H V G L G actgcgttcgaaaacagtatatacgaccaggactacaatatccgtgtaaccatgtatgta T A F E N S I Y D Q D Y N I R V T M Y V caattcagagaatttaatcttaaagaccccccacttcaccctaagtga Q F R E F N L K D P P L H P K -
Hình 4.5. Kết quả so sánh trình tự gen và nhận diện lồi sử dụng cơng cụ Blast giữa trình tự gen ORF2 và ngân hàng NCBI
4.1.3. Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng
Vector pFB_ORF2 được biến nạp vào chủng vi khuẩn E.Coli DH10Bac bằng phương pháp sốc nhiệt. Trong vi khuẩn E.Coli DH10Bac có chứa Bacmid và một plasmid trợ giúp. Khi vector pFB_ORF2 được đưa vào E.Coli DH10Bac sẽ xảy ra hiện tượng bắt cặp và trao đổi chéo giữa pFB_ORF2 và Bacmid tại hai vị trắ Tn7L và Tn7R để tạo thành thể Bacmid tái tổ hợp. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 7 khuẩn lạc trắng trên môi trường chọn lọc. Các khuẩn lạc này có thể là các dịng chứa Bacmid tái tổ hợp (hình 4.6).
Hình 4.6. Hình ảnh khuẩn lạc trên mơi trƣờng chọn lọc chứa kháng sinh và chất chỉ thi Bluo-gal và các khuẩn lạc này có thể là các dịng chứa Bacmid tái tổ hợp.
Để kiểm tra chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy 7 khuẩn lạc này trong mơi trường lỏng có bổ sung kháng sinh như trên mơi trường thạch đĩa và tách Bacmid. Bacmid thu được được sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen ORF2. Kết quả được thể hiện trên hình 4.7. Kết quả cho thấy cả 7 dịng lựa chọn đều xuất hiện băng ADN với kắch thước mong đợi của gen ORF2. Từ các kết quả thu được chúng tôi kết luận rằng đã tạo được 7 dòng mang Bacmid tái tổ hợp
M 1 2 3 4 5 6 7
Hình 4.7.Phổ điện di sản phẩm PCR. M, thang ADN chuẩn; 1-7, sản phẩm PCR sử dụng Bacmid từ 7 dòng khuẩn lạc trắng
Để tạo Baculovirus tái tổ hợp, 7 dòng bacmid tái tổ hợp được sử dụng để chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE. Kết quả được thể hiện trên hình 4.8.
Hình 4.8. Hình ảnh tế bào côn trùng SF21AE sau gây nhiễm bởi Bacmid và nuôi ở 27oC trong 72 giờ
Kết quả cho thấy xuất hiện các bệnh tắch tế bào (CPE) sau 72 giờ nuôi cấy đối với các mẫu được gây nhiễm bởi Bacmid tái tổ hợp (clone 1-7).Mẫu đối chứng không gây nhiễm với Bacmid tái tổ hợp (control 1 và 2) phát triển bình thường và hồn tồn khơng thấy xuất hiện CPE. Kết quả này cho thấy đã tái tổ hợp thành công baculovirus mang gen ORF2 vào tế bào côn trùng.
4.1.4. Kiểm tra khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng phương pháp IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay) trên tế bào côn trùng High FIVE IPMA (ImmunoPeroxidase Monolayer Assay) trên tế bào côn trùng High FIVE
Để kiểm tra hoạt tắnh kháng nguyên của protein ORF2 tái tổ hợp, chúng tôi lần đầu tiên thiết lập phương pháp IPMA sử dụng tế bào cơn trùng dịng High FIVE nhằm phát hiện sự có mặt của protein ORF2 tái tổ hợp tại Việt nam. Ưu điểm của dòng tế bào này là khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp gấp 10 lần so với các dịng tế bào cơn trùng thông dụng khác như SF9 hay SF21AE. Hơn nữa, tế bào High FIVE nuôi cấy không cần bổ sung huyết thanh, rất phù hợp để thiết lập phương pháp IPMA phát hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống Baculovirus. Kết quả được trình bày ở hình 4.9.
Hình 4.9. Kết quả IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE gây nhiễm với Baculovirus tái tổ hợp; A. Đối chứng âm (không sử dụng huyết thanh lợn); B. Đối chứng dƣơng (sử dụng kháng thể thƣơng mại kháng PCV2); C. Đối chứng âm (sử dụng huyết thanh âm tắnh với PCV2); D. Huyết thanh gây tối miễn dịch
Kết quả cho thấy ở giếng đối chứng âm (không bổ sung huyết thanh lợn) thảm tế bào không bắt màu khi nhuộm, ngược lại ở giếng đối chứng dương sử dụng kháng thể thương mại kháng PCV2 (PAB-PCV2 của hãng VMRD, Mỹ) của lợn xuất hiện nhiều tế bào bắt màu đỏ đậm trong nguyên sinh chất. Tương tự đối với giếng sử dụng huyết thanh lợn âm tắnh với PCV2 khi nhuộm thảm tế bào cũng không bắt màu, nhưng ở giếng sử dụng huyết thanh gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 thì ngược lại các tế bào bắt màu nâu đỏ trong nguyên sinh chất khi nhuộm. Chứng tỏ rằngprotein ORF2 tái tổ hợp phản ứng mạnh và được nhận diện bới kháng thể tự nhiên kháng vi rút PCV2. Điều này chỉ ra rằng, protein ORF2 tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện baculovirus mang đặc tắnh kháng nguyên tự nhiên
4.2. THIẾT LẬP QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHƢƠNG PHÁP ELISA SỬ DỤNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ CHẨN ĐỐN CHÍNH XÁC PCV2 TRÊN LỢN
4.2.1. Chuẩn bị mẫu huyết thanh tham chiếu:
286 mẫu huyết thanh lợn thực địa do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp và được đánh giá phát hiện kháng thể kháng vi rút PCV2 bằng 2 phương pháp: Phương pháp IPMA sử dụng tế bào cơn trùng (Đặng Vũ Hồng và cs. 2016) và sử dụng kắt ELISA thương mại (PCV Kit, Shenzhen Lvshiyuan Biotechnology Co., LTD, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng thể kháng virus PCV2 trong huyết thanh lợn thực địa bằng hai phƣơng pháp IPMA và kắt ELISA thƣơng mại
Mẫu huyết thanh lợn IPMA Kit ELISA thƣơng mại
Mẫu dương tắnh 149 149
Mẫu âm tắnh 137 137
Tổng số mẫu 286 286
Qua việc trình bày kết quả ở bảng 4.1, ta thấy phương pháp IPMA cho kết quả 149 mẫu dương và 137 mẫu âm, cho thấy sự tương đồng cao giữa Kắt ELISA thương mại và phương pháp IPMA sử dụng tế bào cơn trùng High FIVE(Đặng Vũ Hồng và cs, 2016). Đồng thời, kết quả này cũng chỉ ra rằng phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng với vi rút baculo mang protein ORF2 tái tổ hợp là hoàn toàn phù hợp cho
cơng tác chẩn đốn phát hiện kháng thể kháng virus PCV2 trong huyết thanh lợn tại Việt Nam.
4.2.2. Kiểm tra hoạt tắnh kháng nguyên của protein tái tổ hợp ORF2 của virus PCV2 sau khi tinh khiết PCV2 sau khi tinh khiết
Việc tinh sạch kháng nguyên ORF2 được thực hiện trên kit tinh sạch của hãng MBL (Medical and Biologica Laboratories Co.,LTD, Nhật bản). Kháng nguyên được gắn thêm đuôi His-tag vào và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. Sơ đồ vector pFastBac/NT TOPO của hãng Invitrogen có găn đi His-Tag được trình bày ở Sơ đồ 1.
Sơ đồ 1: Bản đồ vector pFastbac/NT TOPO
Sau khi tinh sạch bằng kắt thương mại, chúng tôi kiểm tra đặc tắnh kháng nguyên bằng phương pháp Western Blot với huyết thanh kháng vi rút PCV2 của lợn, kết quả cho thấy chỉ thấy xuất hiện băng protein ORF2 phản ứng đặc hiệu với huyết thanh kháng vi rút PCV2 ( hình 4.10)
Hình 4.10. Kết quả Western Blot huyết thanh lợn kháng virus PCV2 sau khi tinh sạch; A. Tắnh sách từ tế bào côn trùng High FIVE; B. Tắnh sạch từ
môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Từ kết quả này đưa đến kết luận rằng protein ORF2 tái tổ hợp của vi rút PCV2 đã được tinh sạch mang đặc tắnh kháng nguyên tự nhiên (được nhận diện bởi kháng thể tự nhiên) từ môi trường nuôi cấy (culture supernatant) và tế bào côn trùng High FIVE (High FIVE insect cells) bằng sắc ký ái lực đặc hiệu đuôi His-tag.
4.2.3. Thiết lập phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong mẫu huyết thanh lợn
Qui trình thiết lập ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 của vi rút PCV2 được thực hiện gồm 3 bước chắnh như sau:
Bước 1: Chuẩn độ kháng nguyên kháng thể (Checkerboard Titration) Bước 2: Xác định OD ngưỡng(Negative-Positive Cutoff)
Bước 3: Phân tắch phản ứng chéo(Cross Reaction Analysis)
Bước 1:Chuẩn độ kháng nguyên kháng thể (Checkerboard Titration)
Nhằm xác định nồng độ kháng nguyên, kháng thể thắch hợp sử dụng trong phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2 trong mẫu huyết thanh lợn,
chúng tôi tiến hành ELISA chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể. Kháng thể sử dụng trong chuẩn độ kháng nguyên - kháng thể là huyết thanh gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 của Bộ mơn Hố sinh Miễn dịch Ờ Viện Thú y.
Hình 4.11: Kết quả chuẩn độ hai chiều kháng nguyên kháng thể
Kết quả chuẩn độ hai chiều, kháng nguyên tái tổ hợp ORF2 của vi rút PCV2 (400, 200, 100, 50 và 25 nanogram) và huyết thanh gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 (pha loãng ở các nồng độ: 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 và 1/800) cho thấy nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp tối ưu cho ELISA là 200 nanogram/giếng và nồng độ pha loãng huyết thanh tối ưu là 1/50 (giá trị P < 0,05).Nồng độ conjugate được sử dụng là 1/6000
Bƣớc 2: Xác định ngƣỡng cutoff (Negative-Positive Cutoff)
Chúng tôi sử mẫu huyết thanh lợn sạch SPF (Specific Pathogen Free Pigs) làm mẫu đối chứng âm chuẩn từ Viện Thú y Nhật bản và mẫu huyết thanh lợn gây tối miễn dịch với vi rút PCV2 của Bộ mơn Hóa sinh Miễn dịch, Viện Thú y làm mẫu đối chứng dương chuẩn để xác định OD ngưỡng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 của vi rút PCV2. Giá trị OD của mẫu âm tắnh và mẫu dương tắnh tại bước sóng 630 dùng trong thiết lập phương pháp ELISA được trình bày ở bảng 4.12
Hình 4.12: Giá trị OD mẫu đối chứng âm chuẩn và dƣơng chuẩn.
Để tắnh giá trị OD ngưỡng âm, chúng tôi áp dụng cơng thức:
OD ngưỡng âm = OD trung bình mẫu đối chứng âm + 3 độ lệch chuẩn
Căn cứ vào công thức tắnh, chúng tôi tắnh được giá trị OD ngưỡng âm là 0.217137202
Kết quả này cho thấy tất cả các mẫu đối chứng âm đều có giá trị dưới 0.217137202 và 100% mẫu đối chứng dương có giá trị OD cao hơn OD ngưỡng
Bƣớc 3: Phân tắch phản ứng chéo (Cross Reaction Analysis)
Nhằm đánh giá phản ứng chéo giữa kháng nguyên tự chế với kháng thể kháng 1 số loại vi rút ở lợn, chúng tôi sử dụng huyết thanh gây tối miễn dịch với 1 số vi rút ở lợn như PCV1, PRRS và CSF. Huyết thanh gây tối miễn dịch với PCV1, PRRS do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp và huyết thanh gây tối miễn dich với vi rút Dịch tả lợn do Bộ môn HSMD Ờ Viện Thú y sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2: Kết quả phân tắch phản ứng chéo với huyết thanh kháng 1 số vi rút gây bệnh ở lợn, bao gồm vi rút PCV1, PRRS và CSF
Huyết thanh tối miễn dịch Giá trị OD
PCV1 0.1045 ổ 0.003
PCV2 1.8545 ổ 0,095
PRRS 0.0931 ổ 0.015
CSF 0.0831 ổ 0.012
Kết quả này cho thấy, kháng nguyên tự chế ORF2 đặc hiệu với kháng thể kháng vi rút PCV2 trong huyết thanh lợn.
Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi tiến hành đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế khi so sánh với 2 phương pháp tham chiếu: IPMA sử dụng tế bào côn trùng High FIVE và Kắt ELISA thương mại.
4.2.4. Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế
A. Thiết lập hệ thống mẫu đối chứng cho phản ứng ELISA
Trên mỗi đĩa phản ứng ELISA với kháng nguyên ORF2 tự chế, chúng tôi thiết lập hệ thống đối chứng gồm 16 giếng, trong đó 2 giếng đối chứng cơ chất, 2 giếng đối chứng conjugate, 4 mẫu đối chứng dương và 8 mẫu đối chứng âm và được bố trắ như sau (hình 4.13):
Hình 4.13: Sơ đồ bố trắ hệ thống đối chứng sử dụng cho phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tự chế ORF2 của vi rút PCV2
OD ngưỡng âm của mỗi đĩa phản ứng ELISA được tắnh tốn theo cơng thức như trên. Mẫu được đánh giá là dương tắnh khi:OD trung bình của mẫu/OD
ngƣỡng âm>1.
B. Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phƣơng pháp ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp tự chế
286 mẫu huyết thanh đã được kiểm tra phát hiện kháng thể kháng vi rút