(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tạo đột biến in vitro, chọn lọc và đánh giá sai khác di truyền của các dòng hoàng thảo kim điệp (dendrobium chrysotoxum) đột biến

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN QUỲNH CHI NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO, CHỌN LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DỊNG HỒNG THẢO KIM ĐIỆP (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM) ĐỘT BIẾN Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Đinh Trường Sơn NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa dùng để bảo vệ học vị Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Quỳnh Chi i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, quan tâm, dạy dỗ tận tình thầy giáo, cán phịng thí nghiệm cố gắng, nỗ lực thân, tơi hồn thành luận văn Trước hết, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ Sinh học tồn thể thầy cô giáo truyền đạt cho kiến thức, kỹ vô quan trọng quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Trường Sơn tận tình hướng dẫn, dạy dỗ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới ThS Phạm Thị Thu Hằng, cán phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học Thực vật giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài môn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể phịng, ban khoa Cơng nghệ Sinh học tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập, rèn luyện thực đề tài Và cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân ni nấng, động viên tạo động lực cho suốt q trình học tập, nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Quỳnh Chi ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục chữ viết tắt viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung chi lan hoàng thảo (Dendrobium) 2.1.1 Vị trí phân bố phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh thái 2.1.4 Một số thông tin Lan Hoàng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) 2.2 Nghiên cứu nhân giống lan hoàng thảo (Dendrobium) giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình nhân giống lan Hồng Thảo (Dendrobium) giới 2.2.2 Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo (Dendrobium) Việt Nam 10 2.3 Khái quát xử lý đột biến chọn tạo giống trồng 10 2.3.1 Khái niệm đột biến 10 2.3.2 Các tác nhân gây đột biến 11 2.3.3 Cơ sở di truyền đột biến 12 2.4 Chỉ thị phân tử rapd 13 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 14 iii download by : skknchat@gmail.com 3.1 Địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Thời gian nghiên cứu 14 3.3 Đối tượng - vật liệu nghiên cứu 14 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 14 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 3.4 Nội dung nghiên cứu 15 3.4.1 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi sau xử lý với sodium azide sau lần cấy chuyển 15 3.4.2 Nhân dòng cho cá thể đột biến sau chọn lọc 16 3.4.3 Đánh giá sai khác di truyền dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến 17 3.5 Phương pháp nghiên cứu 17 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 3.5.2 Phương pháp xử lý đột biến 18 3.5.3 Phương pháp tách chiết DNA 18 3.5.4 Phương pháp đánh giá sai khác di truyền thị phân tử RAPD 18 3.5.5 Chỉ tiêu theo dõi 19 3.5.6 Phân tích số liệu 19 Phần Kết thảo luận 20 4.1 Kết nghiên cứu 20 4.1.1 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi sau xử lý với sodium azide 20 4.1.2 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi sau xử lý với sodium azide 26 4.1.3 Đánh giá khả nhân nhanh in vitro môi trường MS + mg/l BA dòng dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân 32 4.1.4 Đánh giá khả nhân nhanh in vitro mơi trường MS + mg/l kinetine dịng đột biến giả định phương pháp giâm thân 33 4.1.5 Đánh giá khả nhân nhanh in vitro môi trường MS + mg/l BA + 0.5 mg/l IBA dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân 34 4.1.6 Đánh giá khả nhân nhanh in vitro môi trường MS + mg/l kinetine + 0.5 mg/l IBA dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân 36 iv download by : skknchat@gmail.com 4.1.7 Kết tách chiết DNA tổng số 37 4.1.8 Kết phân tích RAPD 38 4.2 Thảo luận 42 Phần Kết luận kiến nghị 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 Tài liệu tham khảo 46 Phụ lục 49 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách trình tự mồi 14 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 4.1 Đánh giá sinh trưởng khả trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 20 Bảng 4.2 Đánh giá sinh trưởng khả trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 21 Bảng 4.3 Đánh giá sinh trưởng khả trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 23 Bảng 4.4 Đánh giá sinh trưởng khả trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 24 Bảng 4.5 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 26 Bảng 4.6 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 27 Bảng 4.7 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 28 Bảng 4.8 Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi lần cấy chuyển thứ (sau tuần) 30 Bảng 4.9 Sinh trưởng phát triển dòng đột biến giả định môi trường MS + mg/l BA (sau tuần) 32 Bảng 4.10 Sinh trưởng phát triển dòng đột biến giả định môi trường MS + mg/l kinetin (sau tuần) 33 Bảng 4.11 Sinh trưởng phát triển dịng đột biến giả định mơi trường MS + mg/l BA + 0.5 mg/l IBA (sau tuần) 34 Bảng 4.12 Sinh trưởng phát triển dòng đột biến giả định môi trường MS + mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA (sau tuần) 36 Bảng 4.13 Kết sử dụng 13 mồi RAPD 38 Bảng 4.15 Hệ số tương đồng di truyền 12 dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến dòng đối chứng 39 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế tác động tạo đột biến gen sodium azide 12 Hình 4.1 Sinh trưởng chồi lần cấy chuyển thứ 21 Hình 4.2 Sinh trưởng lần cấy chuyển thứ 22 Hình 4.3 Sinh trưởng lần cấy chuyển thứ 24 Hình 4.4 Sinh trưởng lần cấy chuyển thứ 25 Hình 4.5 Sinh trưởng chồi lần cấy chuyển thứ 27 Hình 4.6 Sinh trưởng lần cấy chuyển thứ 28 Hình 4.7 Sinh trưởng chồi lần cấy chuyển thứ 29 Hình 4.8 Sinh trưởng chồi lần cấy chuyển thứ 31 Hình 4.9 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân mơi trường MS + mg/l BA 33 Hình 4.10 Sinh trưởng phát triển dòng đột biến giả định môi trường MS + mg/l kinetin 34 Hình 4.11 Sinh trưởng phát triển dịng đột biến giả định mơi trường MS + mg/l BA + 0.5 mg/l IBA 35 Hình 4.12 Sinh trưởng phát triển dòng đột biến giả định môi trường MS + mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA 37 Hình 4.13 Kết điện di DNA tổng số 12 dòng Hồng thảo Kim Điệp đột biến dịng đối chứng 37 Hình 4.14 Sơ đồ hình biểu mối tương quan di truyền 12 dòng Hồng thảo Kim Điệp đột biến dịng đối chứng 40 Hình 4.15 Phân tích thành phần 12 dịng đột biến nhóm đối chứng 41 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BA - Benzylaminopurine CT Công thức CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide ĐC Đối chứng IBA Indol butyric acid MS Murashige and Skoog NAA Naphthalene acetic acid PCR Polymerase chain reaction PLB Protocorm Like Bodies TCS Thin cross section RAPD Random Amplified Polymorphic DNA viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Quỳnh Chi Tên luận văn: Nghiên cứu tạo đột biến in vitro, chọn lọc đánh giá sai khác di truyền dịng Hồng thảo Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) đột biến Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định kỹ thuật xử lý tạo đột biến phù hợp, đánh giá khả trì biến dị giai đoạn ni cấy in vitro - Nghiên cứu nhân nhanh, tạo dòng cho cá thể đột biến chọn lọc - Đánh giá sai khác di truyền dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi sau xử lý với sodium azide sau lần cấy chuyển - Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi sau xử lý với sodium azide với nồng độ khác lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, - Đánh giá khả sinh trưởng trì biến dị chồi sau xử lý với sodium azide thời gian khác lần cấy chuyển thứ 3, 4, 5, Nội dung 2: Nhân dòng cho cá thể đột biến sau chọn lọc - Đánh giá khả nhân nhanh in vitro mơi trường MS + mg/l BA dịng đột biến giả định phương pháp giâm thân - Đánh giá khả nhân nhanh in vitro môi trường MS + mg/l kinetin dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân - Đánh giá khả nhân nhanh in vitro môi trường MS + mg/l BA + 0.5 mg/l IBA dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân - Đánh giá khả nhân nhanh in vitro môi trường MS + mg/l kinetin + 0.5 mg/l IBA dòng đột biến giả định phương pháp giâm thân Nội dung 3: Đánh giá sai khác di truyền dịng Hồng thảo Kim Điệp đột biến - Tách chiết DNA tổng số - Phân tích đa dạng di truyền thị phân tử RAPD ix download by : skknchat@gmail.com HE SO BIEN DI TUAN Run 26 17:55 Thursday, September 27, 2017 The GLM Procedure Dependent Variable: HSBD DF Sum of Squares Mean Square Value Source Pr > F Model F rep 0.4219 trt 55380.9 F rep 0.4219 trt 55380.9 F Model F DF Type I SS Mean Square 0.00000952 0.00000476 0.13452381 0.02242063 53.91 rep 0.9886 trt F DF Type III SS Mean Square Value 0.00000952 0.00000476 0.13452381 0.02242063 Value 0.01 0.01 rep 0.9886 trt F 105 download by : skknchat@gmail.com F F 53.91 F DF Sum of Squares Mean Square 106 download by : skknchat@gmail.com F 62.66 Model F DF Type I SS Mean Square 0.01720952 0.00860476 3.40792381 0.56798730 83.13 rep 0.3188 trt F DF Type III SS Mean Square Value rep 0.3188 trt F Model F DF Type I SS Mean Square 0.00606667 0.00303333 1.30369524 0.21728254 20.22 rep 0.7589 trt F DF Type III SS Mean Square Value rep 0.7589 trt F F R-Square Coeff Var Root MSE 109 download by : skknchat@gmail.com sr Mean 0.000000 Source Pr > F Value 100.0000 DF Type I SS Mean Square rep 0 trt 0 DF Type III SS Mean Square rep 0 trt 0 Source Pr > F Value So Re Thursday, September 20, 2017 17:49 11 The GLM Procedure t Tests (LSD) for sr NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 12 2.17881 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N trt A A A A A A A A A A A A A 100.0 100.0 100.0 3 100.0 100.0 100.0 100.0 Chieu Cao Thursday, September 20, 2017 16:38 The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values 110 download by : skknchat@gmail.com F F Thursday, September 20, 2017 rep 3 trt 7 Number of Observations Read Number of Observations Used Chieu Cao 22 21 16:38 The GLM Procedure Dependent Variable: cc DF Sum of Squares Mean Square Value Source Pr > F Model F DF Type I SS Mean Square 0.00218095 0.00109048 0.27116190 0.04519365 50.44 rep 0.3302 trt F DF Type III SS Mean Square Value rep 0.3302 trt F Model F rep 0.1714 F R-Square Coeff Var Root MSE sc Mean 0.971173 6.038412 0.110877 1.836190 DF Type I SS Mean Square 0.05040952 0.02520476 112 download by : skknchat@gmail.com F trt F DF Type III SS Mean Square Value rep 0.1714 trt F 100.18 Model F rep 0.8618 trt F rep 0.8618 trt F Model F DF Type I SS Mean Square 58.303210 29.151605 4762.095267 793.682544 19.60 rep 0.5068 trt F DF Type III SS Mean Square Value 58.303210 29.151605 Value 0.72 0.72 rep 0.5068 F 115 download by : skknchat@gmail.com F F 19.60 trt